人类外周血染色体标本制备及G带观察及核型分析

实验报告课程名称：分子医学实验指导老师：成绩：实验名称：人类外周血染色体标本制备G带观察及核型分析同组学生姓名：一、实验目的及原理 三、实验结果二、操作步骤四、讨论分析实验目的及原理熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法。初步掌握人类染色体标本培养和制备的基本方法。通过实验掌握Ｇ带标本制备的基本方法，学会在显微镜下直接观察G带分裂相。在细胞周期的不同阶段，染色体的结构不同，在细胞分裂间期，染色体呈现细长的丝状结构，分散于细胞核中，且交织成网状，难以识别其数目和每个染色体特有的结构；在细胞有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构，排列在赤道板上，此时染色体的形态、数目最清楚，所以一般选择有丝分裂中期的细胞来观察染色体的形态、数目。在人类遗传分析中，普遍采用外周血培养的方法制备染色体标本。但是在正常情况下，外周血中的淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，因而外周血细胞中是没有分裂相的。在细胞培养过程中加入植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)，可以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂，再通过秋水仙素处理，将细胞阻断在有丝分离中期。再通过离心、低渗、固定和滴片，就可以获得大量有丝分裂相。最后通过染色就可以观察染色体的结构和数目。本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。有许多显示Ｇ带的方法，最常用的是将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行处理，然后用Giemsa染色。胰酶可以从染色体上抽取蛋白特定的组成部分。通过胰酶处理使Ｇ带区的疏水蛋白被除去或使它们构型变为更疏水状态。由此可见在Ｇ带区中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。关于显带机理有多种论点，总的来说，还不能完全解释显带的机理问题。二、操作步骤人类外周血染色体标本制备１、采血２、培养RPMI1640培养液，37℃0.5℃恒温中培养72小时。3、秋水仙素(colchicine)处理在终止培养前２-３小时，加入秋水仙素。4、离心以1000转/分离心10分钟，弃上清，留沉淀并用吸管打匀。5、低渗处理加８毫升预温(37℃)的0.075MKCl低渗液（hypotonicsolution），用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，37℃水浴箱静止25－30分钟。6、预固定低渗后，加新配的固定剂（甲醇：冰醋酸，3:1）１毫升，打匀。7、离心以1000rpm离心10分钟，弃上清8、固定加入5ml新配置的固定液，悬浮细胞，室温固定10-15分钟9、离心1000rpm离心10分钟，弃上清10、再固定，加入5mL固定液（甲醇：冰醋酸=1：3），室温固定10-15分钟11、再离心1000转/分离心10分钟，弃去上清液。12、再固定加入固定液（甲醇：冰醋酸1：1）5mL,打匀，固定10－15分钟。13、制片固定后，1000转/分离心留下0.2ml沉淀物，吸取细胞悬液滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用嘴吹散，在洒精灯焰上通过几次，使细胞平铺于载玻片上，空气干燥（airdrying）。14、染色（Giemsastaining）Giemsa染液染色８分钟，玻片用自来水冲洗，晾干。15、镜检（microscopicexamination）G带观察及核型分析１、先将胰酶液水浴加热到37℃。２、将染色体标本浸入胰酶液中，作用时间几秒到几十秒不等，依样本存放时间长短而定。(标本需预先经60-70℃烤２小时，或37℃恒温老化3-7天)３、取出玻片标本，在生理盐水中过一下，再经过蒸馏水洗。４、Giemsa染色８分钟。５、自来水洗、晾干。６、镜检。在低倍镜下选择分散及显带良好的分裂相，然后在油镜下观察。如观察到染色体变粗并显得毛糙边缘，有时甚至呈糊状，是处理过度了。三、实验结果四、讨论分析经过观察，所观察到的染色体数目恰好为46条，且基本上清楚可辨。染色体的边缘也不粗糙模糊。但是带型不清楚，可能是处理不当，与仪器的清晰度不够也有一定关系。所观察的区域为胰液处理30分钟的区域。其余时间处理的很难找到优良的观察对象。说明在当时实验条件下30分钟为最佳处理时间。这次实验最大的感触就是需要对片子进行耐心的观察，想要找到合适的容易观测的染色体很难，需要有一定的耐心。装订线装订线P.3注意事项1、带效果的好坏，主要决定于染色体的标本质量。标本染色体要长，染色体分散合适，背景无胞浆，标本未老化即保存时间过长。2、要注意胰酶处理的温度和时间。稳定显带的条件，才能保证显带效果。