小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察实验报告

【实 验 题 目 】小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察【实验目的】1、 掌握线粒体的超活染色原理及方法。2、 观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。【实验材料与用品】试剂：％的詹纳绿B染液、Ringer试剂器具：解剖盘、镊子、剪刀、双凹片、小烧杯、载玻片、盖玻片、胶头滴管、显微镜等材料：小鼠【实验原理】I・线粒体线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包裹的细胞器，直径在微米左右；线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷的主要场所，为细胞的活动提供了能量，有“细胞动力工厂”之称。线粒体在代谢活动旺盛的细胞，如肌肉细胞，肝细胞，神经细胞等中大量存在；线粒体的数量差异巨大，如在肝脏细胞中有1000-2000个线粒体，而有些细胞只有一个线粒体，如酵母菌细胞的大型分支线粒体，大多数哺乳动物成熟红细胞不具有线粒体。线粒体分布方向与微管一致，通常分布在细胞功能旺盛的区域：如在肾脏细胞中靠近微血管，呈平行或栅状排列；在肠表皮细胞中呈两极分布，集中在顶端和基端，在精子中分布在鞭毛中区。II超活染色实验原理超活染色也称活体染色，是指对生命有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法；超活染色的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞死亡。应用活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理病理状态。

活体染色根据染色剂的性质和染色方法不同分为：体内活染（注入、固定、堆积）、体外活染（分离、浸染、固定）1） 体内活染：是以胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的作用。2） 体外活染：又称超活染色，它是由活的动植物分离出的细胞或组织小块，以染料溶液浸染，燃料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染色之所以能固定，堆积在细胞内某些特殊部分，主要是染料的“电化学”特性起到重要作用；碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染液的胶粒表面带阴离子，被染的部分本身也是具有阳离子或阴离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用，从而使样品着色。不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料。活体染色剂的选择原则：1、 对细胞无毒性或毒性极小的染剂2、 具有电化学特性3、 配成稀淡的溶液来使用4、 具有专一性（特异性）5、 一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。本实验采用的活体染色剂…詹纳斯绿B詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性的对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态--蓝绿色）；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原呈无色的色基（即无色状态）。另外，中性红也属于碱性染料，对植物液泡系的染色有专一性。【实验步骤】一、大体流程f断头法处死小白鼠取肝组织f断头法处死小白鼠取肝组织剪下合适大小的肝组织小 —用詹纳斯绿B染色20-30min制片，高信镜观察取着色制片，高信镜观察Ringer溶液制成悬液二、具体操作1、 用断头法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取出小白鼠肝组织，选取边缘较薄的肝组织，放入小烧杯中，用Ringer液冲洗去血污。2、 在干净的凹面载玻片的凹穴中，滴加1/5000詹纳斯绿B溶液，再将上述洗净的肝组织移入染液中（注意：不可将组织块完全浸没，要是组织块至少三分之一的部分露在染液外，这样细胞内的线粒体酶系可充分得到氧化，易被染色）进行染色，一般染色20—30min，以组织块边缘被染成蓝绿色为准。3、 吸去染液，用剪刀将组织块着色部分剪下重置小烧杯中，滴加Ringer溶液，用剪刀将组织充分剪碎制成悬液。4、 取上述细胞悬液滴片，加上盖玻片，在高倍镜下观察。【实验结果与分析 】实验结果理想状态下小鼠肝细胞细胞质中的线粒体应被染成蓝绿色，在高倍镜（10*40）下观察到的结果如下：图1:10*40倍显微镜下观察小鼠肝细胞 图2:10*40倍显微镜下观察图实验分析在打开小鼠腹腔后，可找到呈淡红褐色的肝脏，其边缘很薄，呈小三角形状；在取下肝脏的操作中，发现其比较柔软，易被镊子的尖端挑破。所以剪的时候要注意，既要是所得的组织块体积较小，又不要让其破碎。在将肝细胞进行染色的过程中，大约20min左右可看到半浸在染液中的肝组织的边缘部分出现蓝绿色；取着色部分制成细胞悬液后在40倍显微镜下观察，可以看到小鼠肝细胞细胞质中的线粒体被詹纳斯绿B染液着色，不过着色程度很浅，为浅绿色，可能是染色时间不够，染色不够充分导致的，也有可能是因为所选用的詹纳斯绿B染剂的浓度极稀（％），使得染色过程有一定难度。在显微镜下观察时，可以看到肝细胞的周围有红细胞出现，但是数量并不是很多，不影响观察。若是在观察中发现有大量的红细胞，可能是在处死小鼠时，放血不够充分，导致大量血液淤留在了肝脏中，使最终视野中红细胞过多；也有可能是取出肝组织块后，没有用Ringer溶液将血污冲洗干净，使部分血液残留在肝组织块表面，并最终混在了细胞悬液内。m,实验讨论使用肝细胞的缘由：线粒体含量较多，每个肝细胞有1000-2000个线粒体；长度适合观察，约5um；肝脏较软，易于破碎，并且适于快速提取，因而利于保持线粒体活性；【注意事项】1、 用断头法处死小白鼠后，要将血放干净，可以剪开小鼠两侧颈动脉，使血液尽量流出，防止肝脏中储存过多血液，影响观察。2、 打开腹腔后，可以看到肝脏位于左手边，呈红色，但颜色有一些偏淡，不要与右手边血红色的脾脏混淆，切下小鼠的肝脏，备用，剪的时候要注意避开各种血管，防止出血量过多凝结。3、 在从小鼠体内取肝组织块时要尽快，从而保证它具有更高的活性。4、 剪下来的组织块要立即放到Ringer缓冲液中去洗去其上的血液，因为如果组织块长时间暴露在空气中的话，其上的血液会凝固，使得染色操作变得困难，洗的时候用镊子轻轻的夹住涮洗，这样可使血液快速的被洗脱，但不要太用力，这样会将组织块弄碎。5、 从小鼠肝脏上取组织块的时候，要选取薄边的一端，从此处取2小块，这一部分血少，易取（另一端太厚，不易取也不易染色，而且剪的时候出血量比较多）。在选取肝组织片时要在处于边缘，且为由薄到厚的地方选取。6、 染色时要使组织块上面部分（至少三分之一）露在染液外，不可完全浸没在染液中，以便