血型分子诊断技术进展与应用课件

血型分子诊断技术进展与应用主要内容红细胞血型系统分子诊断红细胞血型系统分子基础ABO血型系统Rh血型系统H血型系统(类孟买型)红细胞血型系统分子诊断技术及其应用小结有关分子生物学概念点突变同义突变无义突变有义突变起始密码突变缺失插入重排有关分子生物学概念基因结构异常或表达异常点突变插入缺失易位和重排拷贝数扩增DNA多态性基因的检测常见突变示意图ATGCGGTAGCGTAGTCTGATGCGATAGCGTAGTCTGATACGGTAGCGTAGTCTGATGCGGGTAGCGTAGTCTGATGCGTAGCGTAGTCTG新等位基因形成ABO血型分子生物学研究1990年Yamamoto等首次克隆基因定位于染色体9q34ABO基因cDNA，其分子量为41,000Dalton，DNA长度为1062bpABO血型系统为三复等位基因，有A、B、O三个基因ABO基因包括7个外显子，长度大于18kb大多数编码序列位于第6和7外显子ABO基因示意图常见等位基因A和B基因编码的蛋白都是353个氨基酸，O基因编码的蛋白只有115个氨基酸A101、A102、B101、O01、O02A101作为参考序列A102等位基因C467T(Pro-Leu)B101基因在297、526、657、703、796、803、930、1096位有8个核苷酸与A101基因不同但只有526、703、796、803四个核苷酸的变化造成了氨基酸序列的变化（A101依次是精氨酸、甘氨酸、亮氨酸和甘氨酸，B101依次是甘氨酸、丝氨酸、蛋氨酸和丙氨酸）O01基因在261位的G缺失,提前终止ABO亚型频率分布ABO血型中存在ABO亚型临床输血和献血者检测中常见440617份A亚型22份AxB11例，AelB3例，Ax3例，Ael2例，Amh2例，A31例B亚型41份Bx11例，B39例，ABx7例，AB35例，Bel3例，Bm2例，ABel1例，ABend1例，ABm1例，Bend1例。B(A)1例CisAB2例A214例A2B35例引自中国输血杂志2006，19（1）：25ABO亚型的分子研究通过检测261、526、703、796、803位的核苷酸可以确认大多数典型的ABO血型的基因型近年来对血清学分类的ABO血型亚型抗原，应用PCR、DNA测序等技术，在核苷酸和酶蛋白氨基酸序列水平上进行研究结果表明：原为同一亚型的抗原存在异质性，即血清学上同一亚型，在核苷酸和酶蛋白氨基酸序列水平上有可能存在差异。几个位点以外的核苷酸变化引起的ABO血型亚型常会引起检测结果的偏差发现的等位基因数为290个（2012年05月22日）A等位基因可简要分为7大类等位基因A1、A2、A3、Ax、Ael、Aw、AmA101等位基因序列作为参照标准A102(C467T)（在中国人群中比例大于A101)A103(C467T,C564T)A104(A297G)A105(A297G,B-O1重组)A106(B-O02重组)A205(A1009G)B等位基因型可简要分为5大类等位基因B1、B3、Bx、Bel、BwB等位基因中297、703、796、803位基本恒定B101-B118B101:A297G;C526G;C657T;G703A;C796A;G803C;G930A;G1096AB301-B308B301:A297G,C526G,C657T,G703A,C796A,G803C,G930A,G1096A,C1054TO等位基因O01－O74大多数261nt缺失，13个261nt不缺失O01:261delGO02:261delG、T646A、G681T、C771T、G829A人群中常见003:261G、A297G,C526G,G802AO50CisAB和B(A)等位基因CisAB01-06CisAB01:C467T,G803CCisAB02:C526G,C657T,G703A,G803C,B(A)01-06B(A)型单克隆试剂应用于临床后，抗A试剂偶尔与原定为B型的红细胞发生反应，这类含有大量B抗原极少A抗原的红细胞称之为B(A)型B(A)01:A297G,C526G,796A,G803C,G930A,G1096AB(A)02:A297G,C526G,C657T,C700G,G703A,C796A,G803C,G930A,G1096A实验室发现的ABO等位基因A208allele*C467T;G539CA210allele*268T>C;467C>T

A211allele*266C>T;467C>T

B112

allele*297A>G;526C>G;559C>T;657C>T;703G>A;796C>A;803G>C;930G>A

B305

allele*297A>G;425T>C;526C>G;657C>T;703G>A;796C>A;803G>C;930G>AB307

allele*297A>G;410C>T;526C>G;657C>T;703G>A;796C>A;803G>C;930G>ABw12allele*C278TCisAB05allele*A297G;C526G;C657T;G703A;C796A;G930A

O61allele*261del743CABO基因诊断PCR-SSPPCR-RFLPPCR-SSOPCR-SSCPPCR-SBT261G干扰正反定型不一致ABO亚型分子机制和诊断凝集强度改变正反定型不一致点突变为主PCR-SSP261GPCR-SBTSNP(单核苷酸多态性)ABO亚型分子机制和诊断PCR-SBT常见为6-7外显子扩增双向测序存在风险：扩增引物SNP多态性位点在其它位置其它机制：表观遗传、其它ABO亚型分子机制和诊断PCR-SBT1-7外显子扩增技术和策略全长18kb一般3对引物以上外显子上的突变ATG位置突变其它机制？？ABO亚型分子机制和诊断基层实验室如何有效获取信息血清学结果家系分析保存抗凝全血-20℃以下寻求分子诊断实验室帮助Rh血型基因基因位于1号染色体短臂上，即1P34—36两个基因：RHD编码D抗原，RHCE编码CcEe抗原RHD和RHCE基因同源性高达96%以上RHD和RHCE基因均有10个外显子RHD基因第1、2、8、10外显子的编码序列与RHCE的相对应序列相同RHD基因第3、4、5、6和第9外显子序列与RHCE基因有区别两个RH基因紧密连锁，相隔30000bp两个基因的3‘末端面对面两个基因之间有一个独立的基因SMP1RHD和RHCE两个基因之间以及外侧分别有1个Rhesus盒SMP1基因距中间一个Rhesus盒下游仅15bpRHCE和RHD基因组成示意图1p34-p36Rh血型等位基因RHAGRHDRHCE突变和缺失、基因转换、基因重组RHD218RHCE104RHAG23RHD等位基因RhD阳性正常RhD阳性弱D(weakD)部分D(partialD)DelRhD阴性RHD基因缺失RHD基因功能丧失部分弱D的分子突变点RHDweakDtype1T809GRHDweakDtype1.1C5G;T809GRHDweakDtype2G1154ARHDweakDtype3C8GRHDweakDintron5'5Aintron35‘G5ARHDweakDtype33(Taiwan1)G520ARHDweakDtypeTaiwan2T809ARHDweakDtype51A594T;C602GRHDweakDtype5292T>CRHDweakDtype53T740G分子机制碱基突变缺失mRNA拼接位点变异部分D分子机制PartialD发现等位基因70多个-RHDVa2T667G;G697C;G712A;G1273CRHDVa3G697ARHDVa4hybridD(1-4)CE5D(6-10)RHDVItypeIhybrid(D1-3)CE(4,5)D(6-10)RHDVItypeIIhybridD(1-3)CE(4-6)D(7-10)RHDVItypeIIIhybridD(1,2)CE(3-6)D(7-10)RHDVItypeIVhybridD1Ce(2/3-5)D(6-10)分子机制基因交换RHD-CE-D点突变部分D分子机制示意图Del分子机制Del（Delution）亚洲人群常见RHDDEL(Cde)1intron3G1ARHDDEL(Cde)2G885TRHDDEL(Cde)3intron9G1A;G1227ARHDDEL(Cde)4intron538delCTCTRHDDEL(Cde)51252insTRHDDEL(Cde)6T1203ARHDDel(Cde)7G3ARHDDel(Cde)8C28TRHDDel(Cde)9T53CRHDDel(Cde)10T251CRHDDELT1222CRHDDelintron8-9:del1013RHDDELexon8del995ntincluding3'intron7+exon8+5'intron8RhD阴性的机制不同Rh阴性表现型频率不同RHD阴性的可能机制RHD基因缺失RHD基因发生改变RHD-CE-D融合基因RHD基因的第3到9外显子被RHCE基因取代RHD阴性个体中约1/3具有完整的RHD基因非洲D阴性个体具有RHDψ（假基因）RHCE等位基因RHCE等位基因104个正常RHCERHce48C

RHCEG48CRHCE(1)D(2-10)

RHCE(1)D(2-10)RHCED-ChineseRH(D1-9CE10)

RH(CE1D2-7CE8-10)hybridCE(1)D(2-7)CE(8-10)RHCE685-687del685-687delAGARHCEnullamorph2Intron4:G1T9例弱D样本RHD845A5例（RHDweakDtype15）RHD1227A3例（D-el(CDe);minimalexpressionofDantigen;

）RHD1013C1例（RHDweakDtype24）10例部分D样本Dva(Kou)1例Dva(Hus)1例DVa-like(YH)1例DVItypeIII7例MolecularbasisofDvariantsinChinesepersons.Transfusion.2007;47(3):471-7

本实验室部分检测结果Rh表型样本量RHD+/RHD+

RHD+/RHD-

RHD-/RHD-

RhD阳性198186（93.94%）12（6.06%）0（0）WeakD323（9.37%）29（93.63%）0（0）RhD阴性20810（4.81%）53（25.48%）145（69.71%）RHD血型分子诊断RhD阴性多重PCR技术FQ-PCRPCR-RFLPDVariantPCR-SSP测序技术RHD血型分子诊断分子机制复杂RhD阴性分子机制基因交换RHD-CE-D疑难标本单一技术难以判定多种技术并存血清学结果H血型系统H抗原与ABO血型，Lewis血型密切相关，属于Hh血型系统（ISBT018）其它血型系统血清学特性分子机制点突变基因重组PCR-SSP基因芯片其它血型系统罕见表型血清学特性基因定位测序技术体外表达红细胞血型系统分子诊断技术的应用红细胞血型的诊断人群遗传的分析谱细胞血型的诊断罕见表型分子机制研究疑难血型的判断多次输血后的血型检测产前血型的诊断红细胞血型系统分子诊断技术的应用罕见表型多次输血病人ABO、RhD血型的不一致RhD变异体弱表达的基因情况RHD杂合度筛选稀有系统（抗体缺乏）谱细胞红细胞血型中采用的技术PCR-RFLPPCR-SSP多重PCR技术PCR-SBTPCR-SSCPPCR-RQ基因芯片方法的优缺点与血清学方法的比较红细胞血型系统基因分型技术PCR-RFLP(限制性片段长度多态性)通过PCR扩增出包含突变位点的特定片段利用限制性内切酶消化片段经凝胶电泳不同的片断大小检测便能确认基因型方法特性操作较简单酶切过程需要控制PCR-RFLP复合PCR-RFLP技术检测ABO基因型.中华医学遗传学杂志,1999年第2期复合PCR技术在ABO血型基因分型中的应用,北京医学2007年第29卷第2期PCR-SSP利用3‘碱基特性分别设计一系列序列特异性引物直接扩增出目的基因片段通过凝胶电泳观察方法特性简单快捷易于操作基于已知序列PCR-SSCP选择性扩增基因片段加热或用变性剂解开DNA双链由于等位基因的核苷酸顺序的不同，二级结构产生差异在聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳迁移率不同分析电泳带型即可区别开等位基因DNA测序法通过PCR扩增基因的主要片段，然后对产物进行序列分析测定，分析发生突变的碱基便可确认血型血型及其亚型的分子基础本方法结果准确可靠需要特殊的仪器设备操作烦琐，成本高测序技术测序技术双脱氧终止法化学降解法高通量测序Partialsequenceinexon6O01alleleBw12alleleAnovelallele基因芯片技术2005年Transfusion45(5):654-9Transfusion45(5):667-679高通量同时分析多个系统