【微流控芯片在船舶压载水检测中的应用分析15000字（论文）】

微流控芯片在船舶压载水检测中的应用研究摘要船舶是国际贸易和运输的主要工具，其携带的压载水是传播海洋生物传播的主要途径。微藻是压载水检测中非常重要的检测目标，对压载水中的微藻进行快速、自动的检测和识别尤为重要。本文提出了一种基于微流控芯片的船舶压载水中单个微藻活性检测和分类的新方法。该实验系统提出了一种新的检测方法，通过激光诱导叶绿素荧光检测原理检测微藻的存活状态，实现压载水的现场快速检测。与现有的流式细胞仪等藻类检测方法相比，该生物传感器检测系统具有成本低、数量少、操作简单等优点，实现了快速、有效、便携的压载水检测目标。关键词：微流控芯片，压载水，微藻检测目录TOC\o"1-3"\h\u79271绪论 1283831.1研究的目的与意义 1271011.1.1研究目的 1143221.1.2研究意义 1212391.2常见藻类检测及分类方法 2273341.2.1流式细胞术法 2160521.2.2光学分析及成像方法 3120441.2.3光学色素分析法 379472微流控芯片技术 4152702.1微流控芯片技术的原理 4207352.2微流控芯片技术的发展历程 6319112.3微流控芯片的微藻检测技术 6284223微流控芯片在船舶压载水检测中的应用 8201193.1微流控芯片技术检测船舶压载水中藻细胞活性的研究 819933.1.1实验设计 883723.1.2实验内容与方法 11255693.1.3结果与讨论 1277393.2微流控芯片技术检测船舶压载水中藻细胞计数的研究 1767793.2.1实验设计 17161303.2.2结果与讨论 20296994总结与展望 22250734.1总结 22213204.2不足与展望 2224767参考文献 241绪论1.1研究的目的与意义1.1.1研究目的航运业是中国经济快速发展的重要组成部分。船舶是海上运输的重要工具。船舶主要依靠压载水来维持稳定性。通过不断调整水量，确保货物顺利装卸和通航。当船舶调整压载水量时，海水中的细菌和有害微生物也会被装载到船舱中。每年大约有500亿吨的压载水将装载这些货物。向主要海域输送3000多种动植物。如果压载水直接排放到目的地，很容易造成外来生物入侵，导致细菌和有害微生物的危险传播，破坏当地生态平衡。赤潮是最常见的海洋生态系统灾害。赤潮的产生是由于海洋微生物的大规模控制。海洋微生物，如漂浮在海水表面的鱼。黄海和渤海的赤潮面积和频率逐年增加。最终导致数以百万计的经济损失。因此，压载水处理的标准化是一个有效防止生物入侵的问题。各国有关机构也更加重视这一问题，以避免或减少压载水造成的严重生态问题。2004年2月，国际海事组织在相关大会上通过了压载水公约，该公约定义了压载水排放的具体标准。通过更换压载水或处理压载水，排放指标可达到D-1标准。对于D-1标准，通过直流、稀释和交换压载水在行驶过程中完成，交换率要求为压载水量的95%。关于D-2标准：所有船舶必须配备压载水处理设备。压载水排放前，通过物理、化学和其他处理方法进行有效的灭活操作，以确保压载水中各种微生物的含量在排放前符合以下标准：1）尺寸在50μm及以上的微生物含量小于10个/m3；（2）尺寸在10μm到50μm的微生物含量小于10个/ml；（3）指示微生物的浓度不超过以下要求：有毒霍乱弧菌不到一个菌落形成单位（CFU）。大肠杆菌含量低于250cfu/100ml；肠球菌应低于100cfu/100ml。从上面可以看出，压载水必须经过测试和确定，以满足排放标准，然后才能排出。然而，大量的压载水以及各种微生物和杂质的混合物会对压载水的检测造成重大损害，并显著降低压载水的检测效率。因此，压载水的分类和富集预处理是必要的。1.1.2研究意义目前国内外压载水处理技术日趋成熟，但方法多种多样，压载水的相关法规和排放标准也在不断完善。在不同的治疗方法中，治疗后的效果在有效性、稳定性、经济性和周期性方面有很大差异。压载水处理过程中的有害物质是否对压载水作业中的人员有害，如压载水作业后的使用寿命和微生物灭活率是否符合要求，以便用操作成本和压载水处理中广泛使用的化学方法污染环境，选择哪种试剂不能有效地快速激活微生物，并且在系统受损时最低。操作和维护成本最低，是达到治疗效果的前提。可以通过使用最低浓度和最短时间来满足要求。这种浓度和时间在实际工业应用中具有重要意义。当工艺超过此时间时，操作成本和系统损失增加，当手动操作工艺超过此增加的浓度时，材料和试剂的消耗增加，并产生浪费。特别是在现代海上运输业中，每天产生成千上万的船舶压载水。在现有的处理技术中，没有有效的方法和完善的系统，这给压载水处理带来了大量人力和物力的浪费，系统运行、维护成本高、周期长等。压载水处理和分离技术是基于微流控芯片实现的。技术原理是在微芯片上集成物理、化学、生物和其他实验操作。芯片内设有微米级的液体通道，对微通道中液体的精确分析完成了样品的分析、检测和处理。微流控芯片具有良好的透光性、流动性和便携性。与宏器件相比，微流控芯片可以用少量反应液实现高效、快速的处理和检测，大大提高了压载水藻类检测效率。1.2常见藻类检测及分类方法尽管公约没有对压载水的微生物和检测技术提出要求，但许多压载水处理装置的处理效果应通过特定的检测手段进行测量。对于生物检测技术，传统方法被广泛用于研究水生生物的数量和种群，但检测过程复杂。检测手段操作简单，但耗时较长，专业领域的工程师需要熟悉该领域。观察过程是用肉眼判断海洋生物生存状况所必需的。由于海水中存在一些动态藻类，因此可以通过移动和显微镜观察它们，这种情况很容易导致遗漏或重复计数。各种生物技术的不断发展导致了一些简单、快速和准确的检测方法。1.2.1流式细胞术法流式细胞仪计数法始于20世纪70年代初，发展成熟，成为最先进的生物定量分析技术。在功能水平上对单个细胞或其他生物颗粒进行定量分析和筛选的方法。流式细胞仪可以快速分析数十万个细胞，分析和分析单个细胞颗粒，同时测量细胞的多个参数，可以准确分析细胞的大小、数量、细胞核、细胞器和内部物质等细胞参数。几种流式细胞术将光散射测量、鞘液聚焦流体驱动原理、细胞荧光染色、激光测量技术、计算机分析和数学统计技术与荧光测量相结合。一些流式细胞仪还包括细胞成像、分类、脉冲形状分析和其他功能。流式细胞术甚至可以检测最小的光合生物原绿球菌。与传统的细胞分析方法相比，流式细胞仪克服了人工操作的计数误差，效率高，具有速度快、精度高、准确度高等优点。它是生物数量定量分析的标准方法之一，是当代最先进的细胞检测技术。流式细胞术可以用来测定活细胞的存活率。基于这一特点，它适用于检测压载水中的海洋生物数量。使用一种新的流式细胞仪技术，流成像仪可以检测和分类海洋和污水中的浮游微生物和细胞。然而，流式细胞术被广泛用于检测小型微藻物种。海水、压载水微藻样本可能会导致设备产生生物结垢。非球形微藻在流动过程中会产生不同的方向，导致数据缺乏和分辨率下降。引入的天然样品（压载水微藻样品）的大小和形状多种多样，很难从样品中区分单个微藻、碎屑或杂质。压载水样本中大量的微藻、商用原位水流式细胞仪的长期运行时间以及设备的大容量和高成本是限制流式细胞仪在压载水检测中应用的重要因素。1.2.2光学分析及成像方法微藻的光学鉴别主要包括光散射分析和光学成像。利用光散射分析法估算微藻的体积。测量结果可以很容易地识别微藻的大小并对其进行识别，但不同的光散射方向可以表征微藻颗粒的不同性质。前向散射与微藻数量、营养物质、盐度等因素有关。横向散射特性受单个微藻叶绿素含量的影响，光散射分析不适用于不规则和非球形微藻颗粒，也没有统一的测量标准，因此识别结果不明确。光学成像是比较流行的方法之一。它使用CCD对图像中的细藻类进行检测，并与数据库中现有的形状信息进行比较，以确定藻类的类型。然而，存在的问题是高性能处理器硬件和实时图像处理算法（包括数据库建立和图像匹配算法）限制了该方法的应用，该方法主要用于静态分类、数据采集的动态分类和高速相机。1.2.3光学色素分析法光合色素在植物光合作用中起着重要作用，是微藻检测和鉴定的良好探针。根据色素的颜色鉴别，主要有分光光度法（光谱吸收法）和荧光法。分光光度法是利用一定带宽的光发射压载水样品，从而观察吸收光波长的函数。不同微藻的吸收光谱不同，因为不同微藻中所含的辅助色素含量不同，但这种差异非常小，函数曲线变化很小，远程光谱测量仪器和现场测量仪器的成本非常昂贵。荧光分析提供了有关色素相对量和绝对量的详细信息。然而，它是一种无需样品制备的快速实时现场识别技术。荧光测量可用于测量微藻叶绿素和辅助染料的激发荧光强度，并通过提供辅助染料的光谱吸收信息来识别微藻。虽然一些荧光测量仪器可以识别和鉴定各种微藻，但荧光测量仪器的组成过于准确，成本非常昂贵。其他方法，如图像分析、光学显微镜、染料荧光显微镜计数、原位PCR聚合酶链反应计数和分子识别基因组学，也可用于检测压载水中的单个生物体。然而，上述方法存在一些缺点。例如，必要的设备昂贵且难以管理。它基本上采用了一种将样本带到实验室进行培养和鉴定的方式。此外，检测类型相对有限，新类型无法通过缺乏了解来确认。该方法不适用于压载水检测，因为有必要向训练有素的工程师准备样品和分析结果。研究了适用于压载水检测技术的方法和系统。压载物检测系统需要便携性、经济性和良好的再现性。2009年，在柏林城市大学举办的促进和协调欧洲国家和区域海洋研究合作项目会议上，开展了当前海洋环境的技术挑战，包括压载水检测技术。在这次会议上，提议使用微流控芯片来解决探测钻石和其他海洋环境的问题。微流控技术的优点是压载水检测领域的热点。微流控芯片技术通过芯片实现压载水藻类的快速自动检测，是一种较好的技术手段。目前，这种新的、简单的和便携式的压载水生物检测方法是必要的，以确保通过不同方法处理的压载水排放物符合IMO公约的要求。2微流控芯片技术2.1微流控芯片技术的原理微流控芯片也称为微流控芯片实验室或芯片实验室。微流控芯片是微流控技术实用检测的主要平台。微流控芯片的主要特点是含有流体的通道为微米级，流体的操作在微空间中实现，化学或生物实验室建立在微芯片上。各种化学和生物过程可以在高速自动微流控系统下完成。由于微通道与细胞之间具有良好的尺度兼容性，微通道被广泛应用于细胞培养、细胞分选、细胞检测、细胞微环境模拟和芯片器官等领域。（1）细胞培养微流控芯片的微通道尺寸相当于单元，结构设计灵活多样。这可以有效地模拟细胞的实际生活环境，并确保生长条件是无菌、无毒、透光、温度和营养所需的。它是细胞培养的理想工具。此外，由于大多数微流控生物反应器具有光学透明性，并且与传统成像技术兼容，因此可以进行实时图像分析。还可以制造廉价的一次性系统，以便于组装、清洁和消毒，广泛用于细胞培养领域。（2）细胞分选微流控芯片细胞分类技术根据细胞的组成、结构和大小以及背景环境中细胞的种类来识别细胞。微流控细胞分选技术根据分选机理的不同可分为主动分选技术和被动分选技术。利用声、光、电、磁等外力进行主动分选；被动分选方法依赖于颗粒的物理性质，例如流场的特征和尺寸、形状、硬度等，以便在不施加外力的情况下实现分选。常用的方法包括微结构滤波、确定性横向位移（DLD）、惯性分选等。声学分选技术是在声辐射力的作用下，在通道周围施加超声波场，产生悬浮颗粒。声辐射力驱动粒子到达压力波节点或波腹位置。由于颗粒大小和密度不同，声辐射力也不同，颗粒的最终稳定位置也不同，实现了细胞的选择。声分离法虽然通量大，但分离纯度低，所需设备和操作复杂。光学分选使用光来操纵细胞或粒子。光镊通常用于光分拣。光镊的本质是将强聚焦激光束施加到大于介质折射率的粒子上。由于粒子的折射，光的传播方向发生变化，即光子的动量量发生变化，控制粒子在固定时间内获得动量以控制粒子。虽然光镊技术具有较高的精度、回收率和纯度，但该方法通量低，不适合分离许多颗粒，所用设备昂贵，颗粒的操作距离短。最常用的电学分选是使用介电泳力进行细胞分选和操作。介电泳最早由Pohl等人于20世纪50年代提出，1978年被引入生物和化学领域，用于细胞分类和操作。自那以后，研究人员引起了全世界的关注。介电泳具有较高的操作精度，广泛应用于细胞捕获、鉴定、聚焦、筛选等应用研究。介电泳可分为直流介电泳、交流介电泳、行波介电泳和光诱导介电泳。这些方法各有优缺点。其中，交流介质电泳因电压低、细胞损伤小、有气泡、热量少等优点而得到广泛应用。磁分选主要是利用磁场产生的磁力分离具有不同磁性的颗粒。磁选基本上与电分离相似。然而，与电分离相比，它有几个优点。（1）磁铁不与溶液接触；（2）通常磁力不影响细胞的活力；（3）磁力不受介质表面电荷、离子强度和pH值的影响。然而，由于大多数细胞和颗粒不是磁性的，所以通常需要用免疫磁珠标记细胞（或颗粒）。微观结构筛选通常用于被动分拣。由于单元尺寸、形状和可变形性的差异，该技术使用微机械技术在芯片上设计不同尺寸的孔、柱、沟、坝和其他微结构，而无需增加外力。主要分为薄膜式、微柱式和围堰式。微结构分离原理简单，通过合理设计精细结构可以实现非常精确的颗粒分离，且该方法制造难度大、通量低、操作简单。DLD技术是Huang等人在2004年提出的一种新方法，用于根据粒径等特性进行连续选择。该方法是一种基于粒度特征的高效、连续机械力分离方法。通过在流体通道中放置多个障碍物，当颗粒直径大于临界值时，颗粒和微柱改变运动轨迹，导致碰撞后的偏移。当粒径小于或等于临界值时，颗粒与微柱碰撞后不发生偏移，沿原流动方向流动，实现不同粒径颗粒的分离。该方法已用于多种生物学目的，包括分选稀有细胞、浓缩循环肿瘤细胞、分离活细胞和死细胞、分离红细胞和白细胞等。2007年，Di-Carlo等人首次将惯性聚焦技术应用于微流控设备，通过研究了线性和弯曲微通道中的粒子聚焦，设计了对称和非对称正弦通道来实现粒子聚焦。从那时起，惯性微流体技术引起了人们的关注并得到了积极的发展。根据微通道的拓扑结构，惯性微流控技术可分为三类。这三种惯性筛选方法具有固有的特点，适用于不同的应用。此外，被动分选方法包括水力分选、挤压流分选、仿生分选、亲和性分选等。（3）细胞检测细胞内成分复杂，细胞内成分的分析和检测有助于研究细胞代谢过程、细胞与药物的相互作用以及细胞功能。细胞生物学、药物筛选和环境监测都很重要。微流控芯片技术为细胞检测和分析提供了很好的技术平台。根据检测原理的不同，微流控细胞检测技术可分为电化学检测技术和光学检测技术。电化学检测方法是将电极或传感器安装在芯片上，通过在分析溶液中记录被测物体的化学反应引起的电阻、容量、电流和电压的变化来反映物体的信息。该方法简单、成本低、易于集成。更重要的是，它具有高灵敏度和实时性。这是目前使用的检测方法之一。光检测是一种通过检测不同参数来确定生化样品指数的方法。它具有检测精度高、与样品接触、设备简单、易于与微流控芯片集成等优点，应用最广泛的微流控芯片信号检测系统。1993年，伯恩斯报道了用激光诱导荧光技术检测悬浮液滴中的单分子。荧光检测是最灵敏的检测技术之一。目前，荧光检测极限从微微摩尔上升到1升纳米孔。荧光检测技术存在固有缺陷。也就是说，在分析之前，必须对非荧光分析物进行荧光标记。图像包含许多信息，如细胞大小、形状和表面形态。因此，结合图像信息的细胞检测技术备受关注。例如，新兴的成像流式细胞仪集成了传统流式细胞仪的显微细胞分析方法的单细胞识别、高通量、快速分析和图像数据采集。可以对细胞的形态特征和光电特性进行完整的分析，并且可以快速准确地分析复杂的细胞群体。然而，成像流式细胞术具有价格高、操作复杂、体积大等缺点，限制了其在许多要求小型化、现场化、低成本等领域的应用。2.2微流控芯片技术的发展历程微流控芯片实验室首次出现在20世纪90年代初。Manz和Widner首次提出了微型全分析系统（itas）的概念，微流控技术是由微流控技术发展而来的。后来，与微流控芯片相关的公司相继出现。随着基于微流控芯片的高质量文章的增多，微流控芯片技术越来越受到科学界和人们的关注。微流控技术被评为影响人类未来的十五项最重要发明之一。自微流控芯片技术问世以来，人们对其的研究一直没有停止过。目前，人类仍在进行这方面的努力和研究。微流控芯片可以与微流控、生物、医学、化学、计算机、材料科学等多个技术领域相结合，可以实现各种分析检测功能，采样、稀释、试剂添加、反应、分离，最大限度地将检测等分析功能集成到最大的集成分析系统中。微流控芯片技术的出现和发展，使许多检测设备和医疗设备小型化、便携化，给人们的生活带来了极大的便利。只有在特定地点才能完成的功能可以随时随地实现。总的来说，微流控芯片技术具有以下优点：（1）检测速度快，分析效率高。为了在微流控芯片上实现相关的自动分析和检测功能，只需几秒钟或更短的时间。（2）样品和试剂消耗低。由于微流控芯片中的通道尺寸为微纳级，因此所需的检测样品和相关生物试剂可以是微升或纳升。对于昂贵的生物试剂，可以大大节省检测成本，并且可以在样本很少的情况下检测。（3）体积小型化，易于集成和携带。由于生化分析实验室集中在一个不到几平方厘米的芯片上，它可以通过收集、处理和显示信号作为便携式检测器，用于各种现场检测和分析，如极端环境和条件，如偏远地区、战争和外空间。2.3微流控芯片的微藻检测技术微流控芯片是一种用于微纳通道样品自动生化分析的新技术，为生化分析提供了良好的微环境平台。微流控芯片实现了单细胞研究和分析。它具有样品体积小、速度快、成本低、小型化等优点。高水平自动检测，测量误差小，现场检测，成本低，检测器小型化、集成化，可批量生产。这些潜在优势在其他技术中是不存在的。微流控芯片分析技术是化学和生物分析的重要工具。它的优点（低消耗、原位分析、高速实时等）被应用于细胞和分子水平的检测，尤其是在细胞研究和应用中。微通道尺度与细胞亲和力强，在体内模拟能力强，在生命科学领域广泛应用于细胞培养、细胞操作、样品处理和细胞检测。它成为实时发现和研究细胞和单细胞的新平台。微流控芯片上的细胞检测技术主要采用光电检测和电化学检测。光检测是一种灵敏、简单的设备，易于与微流控芯片结合。它具有实时检测活细胞的巨大潜力。微流控芯片在船舶压载水中微藻的检测、鉴定和分类中引起了研究人员的关注。这些研究成果在这一领域有着优异的表现，出现了许多新的快速识别方法。基于微流控芯片的微藻识别、鉴定和分类主要有静态成像法、动态法、光谱法、阻抗法和光波导形状识别法。阻抗检测是一种常用的电子检测方法。直流阻抗测量比传统交流仪器简单。与光谱检测相比，阻抗检测鉴别和识别细胞大小和计数细胞。然而，当检测样本是多个不同的粒子或细胞时，它不能像光学检测那样提供许多粒子信息。基于微流控芯片的光学探测鉴别法是一种比较准确的微藻鉴定方法。微藻有各种大小、形状和结构，包括各种色素和辅助色素。这些内部探针为微藻的光学识别提供了标准。将光纤埋入微流控芯片中检测叶绿素、藻红蛋白和微藻散射光。使用波分复用光纤耦合器将两个激光器的泵浦光耦合到嵌入微流控芯片的单模光纤上。两条多模光纤以90度角排列，用于激发光纤，用于收集荧光和散射光。光纤采集的光信号通过光学带通滤波器直接入射到光电倍增管上，并通过测量的光学信息检测和识别微藻。然而，在芯片中嵌入光纤集成是很困难的。Schaap等人利用嵌入石英制芯片的光纤，观察微小藻类通过检测点产生的小波变化，并判断其形状。然而，在上述方法中，电极和光纤集成在芯片中，并且处理困难且成本高。基于微流控芯片的微藻识别方法和设备中的微藻识别方法和设备在微流控芯片中积累并嵌入光纤。将光纤嵌入微流控芯片有两个主要原因。其中一个原因是光纤靠近细胞距离，这大大提高了激发光激发效率和发射的叶绿素荧光的收集效率。另一个原因是，测量前的散射光（FSC）通常用于测量细胞的大小，而嵌入式光纤大大提高了散射光的检测精度。虽然这些方法具有高度的灵敏度，但与分离光学布局相比，存在一些缺点，例如成本高、处理过程复杂和稳定性差。3微流控芯片在船舶压载水检测中的应用3.1微流控芯片技术检测船舶压载水中藻细胞活性的研究3.1.1实验设计（1）实验原理在本实验中，通过检测单个微藻细胞的叶绿素荧光强度来表征单个微藻细胞的活性。检测原理是激光诱导叶绿素荧光理论。微藻细胞中含有多种色素，叶绿素就是其中之一。叶绿素是光合作用过程中最重要的载体，包括叶绿素a、叶绿素b、叶绿素C和类胡萝卜素。微藻细胞内的叶绿素具有荧光特性，叶绿素会发出特定的波长和强度。这是因为在可见光照射下，叶绿素分子在高能下从最稳定的基态转变为不稳定的激发态。由于激发态不稳定，电子容易从激发态跃迁到原始基态，电子跃迁过程伴随着能量的释放。当电子从第二激发态跃迁到第一激发态时，能量通常以热辐射的形式释放到外部。当电子进一步从第一激发态跃迁到基态时，能量以特定波长的光的形式向外发射。这是荧光的产生机制。通过检测荧光强度，可以表征微藻细胞的叶绿素含量，以及微藻细胞的活性。叶绿素选择性地吸收光。也就是说，当具有不同波长和强度的光被叶绿素照射时，光以不同的强度和波长受到刺激。叶绿素只吸收可见光中的红光和蓝光。叶绿素a和叶绿素b的蓝光吸收波长为400～500nm，红光吸收波长为640～680nm。图3.1显示了叶绿素a的激发和发射光谱。图3.1叶绿素a的激发光谱和发射光谱示意图从图3.1可以看出，在450nm到500nm之间，光的吸收最大，也就是说，叶绿素a在该波长范围内对激发光最敏感。激发后的发射波长集中在640nm到700nm之间。这种光叫做叶绿素荧光。激发后的激发光用中心波长685nm的滤光片过滤，光电设备接收并转换为相应的信号数据。叶绿素荧光检测原理如图3.2所示。图3.2叶绿素荧光检测原理图（2）系统组成检测系统主要由激光器、微流控芯片、光电倍增管、直流电源、数据采集设备、PC机和注射泵组成。图3.3示出了检测系统的框图。图3.3检测系统结构框图光电倍增管是探测系统的核心部件。光电倍增管由光电阴极、电子光学输入系统、二次辐射倍增系统和阳极组成。具体加工工艺如下：外部光子影响光电阴极产生光电子。光电子通过内部电压的作用进入倍增系统。经过多级倍增后，电子聚集在阳极中产生电压或电流。通过检测电压或电流，可以从外部评估入射到光电倍增管上的光子数量，即从光的强度。光电倍增管的工作原理如图3.4所示。图3.4光电倍增管工作原理图由于实验中检测到的荧光很弱，光电倍增管需要一个密封的检测环境，因此研究了三维密封模型，并将绘图结构图带入3D打印机，选择了屏蔽性能好的黑色材料。密封结构完成后，密封检测部分，密封检测部分如图3.5所示。图3.5密封后的检测部件实物图检测系统的激发光源采用单频发射方向性好的蓝光激光。滤光片采用红光滤光片，滤光片中心波长为685nm。电源采用直流可调电源，为光电倍增管提供持续稳定的电压。数据采集设备采用NIUSB-6259采集板，该采集板对光电倍增管转换的电压信号进行滤波和放大，并将其发送至计算机进行分析。计算机有特殊的虚拟仪器程序和相关的硬件驱动程序。加载到计算机上的数据读写程序由LabVIEW语言设计，LabVIEW语言具有多个功能库、子VI、控制包等，可以对每个子功能和程序进行调节。由于来自光电倍增管端子的电子数量等于相应脉冲序列的数量，因此只要对脉冲序列的数量进行计数，就可以知道产生的电子数量。程序对每秒采集的脉冲序列进行计数，计算值确定为一个点。确定好一个点后再确定下一个点。确定两个点后，将它们连接到曲线并连接到其他点。最后，读取信号曲线显示在程序窗口上。数据显示程序的控制布局如图3.6所示。在图中，“指示灯”控件用于表示程序的运行状态，指示绿灯正在运行程序。启动控件用于启动程序。停止控制用于终止程序，当前时间频率（CPS）显示在“当前计数”控制中。“总计数”控件显示的值是从检测开始到当前时间的计数数，“检测时间”控件以秒为单位显示程序的总执行时间。图3.6数据显示程序的控件布局图3.1.2实验内容与方法（1）处理试剤的制备在本实验中，微波藻类的处理试剂是次氯酸钠消毒剂，因为化学方法在目前处理船舶压载水中的微藻时更有效。次氯酸钠溶液是一种常见的消毒剂，可产生1-15%的氯，易于制造。有效氯溶液的强氧化可以攻击和杀死压载水中的藻类。它是常用的化学试剂，广泛用于杀灭微生物。用碘量法测定次氯酸钠溶液中次氯酸钠的浓度。碘量法的原理是次氯酸钠消毒剂中的有效氯在酸性溶液中与碘化钾反应，碘的量是通过氧化释放的。用已知浓度的硫代硫酸钠滴定硫代硫酸钠，可根据硫代硫酸钠的消耗量得出次氯酸钠消毒剂中有效氯的含量。本实验中碘测量值的测定如下。1）试剂的配制①10%碘化钾溶液②向0.5g淀粉中加入5%淀粉溶液，放入烧杯中，向烧杯中倒入100ml热水，继续搅拌，直到溶液变透明。③2mol/LH2SO4溶液；④0.1mol/LK2Cr2O7溶液，干燥的K2Cr2O7试剂首先在室温下储存在干燥容器中2小时。然后，在天平中称取1.2258g的k22cr2o7试剂，放入烧杯中，用去离子水在250ml容量瓶中完全溶解，用水稀释，摇匀。⑤0.1mol/lNa2S2O3溶液，12.5gNa2S2O35H2O，在500ml去离子水中称重，添加0.1g碳酸钠，完全溶解，并储存在棕色瓶中。2）有效氯的测定将10mL次氯酸钠水溶液放入带进样管的锥形瓶中，依次加入10mL硫酸溶液（2mol/L）和10mL碘化钾溶液（10%）。溶液的颜色是棕色。盖上碘酒瓶，摇匀。在瓶盖边缘加入几滴清蒸填充水，并倒入5分钟。然后用Na2S2O3溶液滴定游离碘，滴水时摇匀。当瓶子的溶液变为浅棕黄色时，淀粉指示剂（0.5%）下降，溶液变为蓝色。继续倾倒，直到溶液变为无色。记录测量过程中消耗的Na2S2O3溶液的体积。为确保测量结果的准确性，相同的测量过程重复三次，并对以下计算进行平均。C=c*v*0.03545/W*100%测量次氯酸钠消毒剂中的有效氯含量后，可以知道次氯酸钠的含量，并用纯水稀释以提供必要的浓度。使用次氯酸钠溶液（3x104ppm）、次氯酸钠溶液（30ppm）和福尔马林（37%至40%甲醛溶液）直观地比较了不同处理剂对微藻活性动力学变化的影响。（3）单微藻细胞活性监测光电倍增管（PMT）非常灵敏，探测范围被限制在探测极限内。因此，必须严格控制PMT上的光照强度，以防止损坏设备。单个微藻细胞的叶绿素荧光非常小。为了弄清单个微藻细胞的活性变化，必须严格控制激发强度、滤池的渗透面积和周围环境。此外，应在每次实验前进行背景测试，以确保实验的准确性和有效性。经过多次调试，选择封闭暗室作为实验环境，选择488nm波长的单蓝光作为激发光源，光源功率为1.0mW。滤光片的中心波长为685nm。直流电源的输出值保持在4.85-5.00V之间，接口连接到光电倍增管的电源线。连接检测系统后，可以调整激光源、微流控芯片和红光滤光片之间的相对位置，激光可以准确击中微藻细胞，并注意滤光片狭缝的大小，确保良好的信噪比。安装检测系统后，首先运行后台测试。本底测试的目的是测试系统的稳定性。本底测试时间为几分钟。如果测试界面上的检测线近似为直线，如图3.7所示，则检测系统稳定。图3.7系统本底测试图本底测试完成后，首先将微流控芯片准确捕捉到系统的检测位置，关闭暗室周围的所有光源，然后打开软件操作界面，点击开始按钮，最后打开PMT开关，检测未经处理的单个微藻细胞的活动。时间测试完成后，关闭PMT，点击软件界面上的停止按钮，保存测量的信号数据。然后，再次关闭暗室周围的所有光源，然后单击开始按钮，从微流控芯片的注射孔中滴下10uL的处理试剂，并使用数字移液枪打开PMT开关，以快速监测处理后的单个微藻细胞活性。再次监控时间后，点击软件界面上的停止按钮，在PMT开关关闭时保存测量的信号数据。保存数据后，微通道中捕获的单个微藻完全死亡，等待一段时间再次关闭暗室周围的所有光源，然后打开软件操作界面并单击开始按钮。为了获得相应的基准值，打开PMT开关以检测单个死亡微藻细胞的荧光。测量完成后，关闭PMT开关，点击软件界面上的停止按钮，存储测量的信号数据。3.1.3结果与讨论（1）不同处理试剂对同种单微藻细胞处理后活性变化根据设定的实验方案，监测了不同处理剂处理后，单亚种涡虫活性的动态变化。图3.8显示了用30ppm次氯酸钠溶液处理后单中心扁藻的叶绿素荧光强度随时间的变化。在图中，横轴代表时间，纵轴代表单位时间的PMT收集的单个光子数，纵轴是微藻细胞叶绿素荧光的特征值，符合光电倍增管的原理。类似地，图3.9显示了在处理浓度为3X104ppm的次氯酸钠溶液后处理单个中心扁平藻后，扁平藻单个中心部分的叶绿素荧光强度的变化。图3.10显示了福尔马林（37%至40%甲醛溶液）处理后单个心下扁平藻的叶绿素荧光强度随时间的变化。（a）处理前（b）处理中（c）处理后图3.830ppm的次氯酸钠处理后单个亚心型扁藻的叶绿素荧光强度变化（a）处理前（b）处理中（c）处理后图3.93X104ppm的次氯酸钠处理后单个亚心型扁藻的叶绿素荧光强度变化（a）处理前（b）处理中（c）处理后图3.10福尔马林(37%~40%的甲醛溶液)处理后单个亚心型扁藻的叶绿素荧光强度变化当单个亚心型扁藻细胞的活性没有发生根本性变化，而单个皮层下扁平藻细胞未经处理，而是经化学试剂处理，且其活性随时间呈下降趋势时，其活性立即受到影响。然而，通过对单中心扁平藻细胞活性的动态监测，发现微藻细胞的活性并不总是被抑制，其活性的减弱是一个剧烈的下降过程。如图3.11所示，本文获得的单个亚心型扁藻细胞的活性动态变化曲线可以清晰地观察到活性变化过程。图3.11单个亚心型扁藻的活性动态变化曲线在图3.11中，使用浓度为30ppm的次氯酸钠溶液、浓度为3X104ppm的次氯酸钠溶液、福尔马林（37%至40%甲醛溶液）作为治疗试剂，用于治疗单个亚心型扁藻细胞。横坐标代表时间s，纵轴代表相对活动，代表单个心脏下扁平藻类细胞活动的相对变化。通过取活性的相对变化值，可以消除单个心脏下扁平藻细胞活性背景值和绝对值差异的影响，直观比较单个心脏下扁平藻细胞的活性变化曲线。从图中可以看出，不同的加工试剂对单个心脏扁平藻细胞的活性变化有不同的影响。3x104ppm浓度的次氯酸钠溶液的处理效果远强于30ppm浓度的次氯酸钠溶液和福尔马林（37%至40%甲醛溶液）。浓度为30ppm的次氯酸钠溶液的处理效果与福尔马林（37%至40%甲醛溶液）的处理效果差别不大。两者都能在5分钟内完全杀死亚中心扁平藻细胞。从亚心型扁藻的活性动态变化曲线可以看出，扁藻细胞的活性变化不是单调的，扁藻细胞的生理特性（抗逆性等）在药剂处理过程中起着拮抗作用。另外，从图中可以看出，三种试剂都可在30s使扁藻细胞的相对活性降至0.5以下，这说明这三种处理试剂均可在30s内有效处理扁藻这种生物。在图3.11中，拟合曲线显示了用浓度为3X104ppm的次氯酸钠溶液处理之前，亚心型扁藻细胞（50-60）的活性变化。这是一种常规的检测方法，即在每个时期检测藻类细胞的活性，并分析治疗效果。为了简化比较，数据的多项式拟合和拟合方程的决策系数均为0.95616，拟合度很好。对比分析表明，常规检测菌落藻细胞可以产生略微单调的下降曲线。统计结果可以涵盖单个藻类细胞之间的差异，以及许多有价值的信息方法。与传统检测方法相比，这是检测方法的一个优点。（2）不同种类的单微藻细胞用同种试剂处理后活性变化为了比较同一化学试剂处理后不同藻类活性的动态变化，用浓度为30ppm的次氯酸钠溶液处理捕获的单个亚心型扁藻细胞和单个杜氏盐藻细胞。根据本次实验设计，监测单个震源藻类细胞和单个盐藻细胞活性的动态变化。图3.12显示了在浓度为30ppm的次氯酸钠溶液中处理单个盐藻后，单个盐藻叶绿素荧光强度的变化。横坐标表示时间s，纵坐标表示单位时间内PMT收集的单光子数。根据上述光电倍增管，纵坐标代表微藻细胞的叶绿素荧光特征值。图3.1230ppm的次氯酸钠处理后单个杜氏盐藻的叶绿素荧光强度变化这些结果表明，单个盐藻细胞的活性不受单个盐藻细胞的影响。同样，通过动态监测单个盐藻细胞的活性，发现盐藻细胞的活性并不总是被抑制，其活性的减弱也是一个严重的下降过程。图3.13显示了用30ppm浓度的次氯酸盐溶液处理后单个杜氏盐藻和单个亚心型扁藻的活性动态变化曲线。图3.13单个柱氏盐藻与单个亚心型扁藻的活性动态变化曲线从图3.13可以看出，两个微藻细胞的生理特性（如抗逆性）在试剂处理过程中不难发挥拮抗作用。亚心型扁藻的拮抗作用在60年代、220年代和260年代更为明显，杜氏盐藻的拮抗作用比60年代、200年代和240年代更为明显。此外，在相同的化学试剂（30ppm浓度的次氯酸盐溶液）处理5分钟后，亚心型扁藻细胞的相对活性降低至0，而盐藻细胞的相对活性继续保持，表明亚心型扁藻细胞死亡。大于0.1表明盐藻细胞没有死亡。30℃处理未经处理的扁平藻细胞后，30ppm次氯酸钠溶液的相对活性为0。下降到5。这表明杜氏盐藻的拮抗作用强于亚中心扁平藻。也就是说，在实际的海滩水处理过程中，杜氏盐藻比亚中心扁平藻更难处理。杜氏盐藻细胞的活性在50s至175s期间显著降低，而杜氏盐藻的拮抗作用在这段时间内最弱，这对实际船舶压载水处理中的药物控制和用药时间具有重要意义。3.2微流控芯片技术检测船舶压载水中藻细胞计数的研究3.2.1实验设计实验系统主要由激发光源、微流控芯片及平台、激光诱导叶绿素荧光光学系统、RPS差分放大检测电路、光电信号放大电路和数据采集模块组成。叶绿素荧光检测计数系统如图3.14所示。图3.14叶绿素荧光检测计数系统原理示意图本系统中的激光诱导叶绿素荧光检测系统包括一个488nm的激光发射激光器，击中芯片内的RPS阻抗脉冲检测区域，以确保激光发射激光器、RPS阻抗脉冲检测区域和光电探测器位于同一平面。本系统中的RPS差分放大检测电路用于检测微藻颗粒的阻抗脉冲检测信号，检测原理是检测微藻颗粒通过阻抗脉冲检测区域时，检测区域内的阻抗变化。（1）差分微流控芯片的设计芯片设计是微藻RPS检测和计数的基础。为了达到预期的实验目标，芯片应满足以下要求：1）利用电泳原理，检测区域顺利通过，确保了叶绿素荧光和RPS检测过程的连续性；2）适当的聚焦通道宽度角允许样品通过RPS和荧光检测点的中心聚焦；3）适当的主通道宽度，以保持适当的流量；4）RPS检测区域的位置和大小满足激光诱导叶绿素荧光和RPS阻抗脉冲传感的同时检测。RPS检测区域需要确保相对较小的细胞、最大藻细胞和高信噪比通过。芯片通道由叉型聚焦微通道、RPS检测通道、RPS阻抗脉冲检测区域和六个储液池组成。利用AutoCAD二维绘图软件设计了微通道的结构。图形被转换并存储在特定的图形文件中，并打印在具有高分辨率打印机的透明塑料膜上，以完成光刻掩模的生产。通道的整体水平长度约为4cm，从样品池到交叉点的宽度为100μm。宽度至5cm，RPS检测区域和废物箱μRPS阻抗脉冲检测区域的检测尺寸为35μM，宽度为15μM，RPS检测通道2是聚焦通道粒子的RPS信号，宽度为100μM，微藻颗粒集中在主通道的中心线上。图3.15RPS微流控芯片结构设计图（2）差分放大检测电路RPS差分放大检测电路中使用的差分芯片是AD8210芯片。AD8210是一种低成本、高精度的仪表放大器，即精密差分电压放大器。AD8210只需外部电阻即可设置增益。放大倍数为1到1000。在精度方面，放大到500倍时最为精确。高精度（最大非线性40ppm）和低偏移电压μ5μ低偏移漂移是具有V/C特性的精密数据采集系统的理想选择。AD8210具有低噪声、低输入偏置电流、低功耗特性，并具有电压保护功能。此外，AD8210采用8引脚SOIC和DIP封装，DIP封装比分体式设计小，功耗低（最大电源电流为1.3mA）。它非常适合电池供电的便携式（或远程）应用。表3.1AD8210芯片的电气特性参数额定值电源电压±18V内部功耗650mW输入电压（共模）±VS差分输入电压25V工作温度范围-55℃至+125℃引脚稳定范围（10s焊接）300℃RPS检测电路是基于AD8210设计的差分放大电路。作为一种放大电路，AD8210具有良好的共模抑制、降低噪声和增强检测稳定性。如图3.16所示，根据AD8210的相关电路数据设计了特定的RPS电路。图3.16检测电路原理图电路图中的电容器C3、C4和C5旨在抵抗射频干扰。在该电路中，电容器C1和C2使用R2和R3放电。在放大器的输入端设计R-C网络，过滤射频信号，过滤射频干扰，保护放大器。在电路中，由于AD8210的输出电压与参考引脚的电势有关，因此只有五个引脚必须接地才能解决问题。P3是差分信号的输入，连接到RPS检测到的两个臂。P1是滑动变阻器，输入电压进入AD8210，选择增益，并根据以下方程式计算RP1：RP1=49.4KΩ/G-1当RP1=500Ω，放大率约为100。图3.17是电路PCB焊接的物理图。该电路体积小，易于集成到便携式设备中，检测精度与商用设备相近。图3.17RPS差分放大电路（3）实验操作流程在实验过程中，首先将相当于缓冲液的PBS缓冲液添加到样品储液池中。根据系统设计，将6个电极插入每个储罐并连接到电路。在电渗流的驱动下，样品被输送到主通道，流经与缓冲池相连的通道，然后浓缩并通过RPS检测区域。当颗粒通过检测区域时，与废水池中的电极相连的滤波放大电路和差分放大器同时检测叶绿素荧光信号和变化后的微阻抗脉冲检测信号，并将信号放大并将处理信号发送至NI信号采集卡。采集卡采集的数据由LabVIEW程序处理。3.2.2结果与讨论对RPS检测系统与8μm标准聚苯乙烯颗粒进行了测试，测试结果如图3.18所示。由于每个向下的峰值代表在检测区域中流动的颗粒，因此下峰值的数量是通过的颗粒数量，下峰值的大小可以代表颗粒的体积大小。图3.188μm颗粒RPS检测结果在RPS检测系统验证标准粒子实验后，结合叶绿素荧光检测系统对微藻粒子样品进行检测和计数。实验系统检测微藻细胞的叶绿素荧光，根据RPS阻抗脉冲传感器对微藻细胞进行计数，并对细胞的大小和体积进行粗略分析。通过叶绿素荧光和RPS阻抗脉冲可以自动检测微藻，并可以粗略分析微藻的数量和大小。该系统用于测试盐藻细胞样本，测试结果如图3.19所示。图3.19盐藻细胞的叶绿素荧光和RPS