不同来源的翘鳞香菇形态特征研究及交配型b位点解析

MorphologicalandBmating-typelocusanylysisofLentinns

squarrosulus

ABSTRACT

Ediblefungiasahealthyfood,whichislowinfatcontentandrichindietaryfiberand

protein,areverypopularamongconsumers.Lentinussquarrosuluswithbigmarketpotential

isonekindofrecentlydevelopedfungusstrains.

Themainfindingsofthisstudyareasfollows:

1.Fromthecultivatingresultof8wildstrainsofLentinussquarrosulus.Wegetthe

growingconditionofthiskindofmushroom.Thetemperatureis34chigherthanthatof

Lentinulaedodes.Thus,otherconditionsaresimilartothegrowingconditionsofLentinula

edodes.Temperaturechangingandclourchangingintodarkareneededforfruitbody

growing.Wegetfruitbodiesfromonly6strains.Thereare3kindsofthefruitbodies.

2.ITSregionof8strainsandLentinulaedodes135strainwereamplifiedbyPCR,

sequencedandcompared.Theresultindicatedthatthereare3groupsbetweentheITSregions

ofLentinussquarrosuluswasequaltotheresultofcultivatingandprovedthatstudying

ITSregioncanhelpusknowthedifferencesbetweendifferentstrains.

3.BydegeneratePCRoftwodikaryonstrains0826,QL7-6,whichweremorphological

diversity.Weobtainedtwopheromonereceptorgenes.Itwasidentifiedthatthetwo

pheromonereceptorssharedthehomology.

4.Thereareincompatibilityfactors:AandBfactors,whichcontroltheirmating,in

tetrapolarheterothallicmushroom.BymeansofdegeneratePCRandgenewalking,wecloned

thepheromonereceptorgeneonBmating-typeloci.Weobtainedonepheromonereceptor

geneLS-rcbl-BlfromthesporemonokaryonstrainNO.2ofL.squarrosulusstrainNO.7-4;

somesequencesofpheromonereceptorgeneLS-rcb2-B2fromthesporemonokaryonstrain

NO.5ofL.squarrosulusstrainNO.7-4.BasedtheDNAsequencesofpheromonereceptor

genefromBmatingtypefactorinL.squarrosulus,wedesignedtwogroupsofspecific

primers:rcbl-Bl-F,rcbl-Bl-R；rcb-B2-l,rcbl-B2-R,toamplifythefragmentofpheromone

receptorfromtheprotoplastmonokaryonstrainsandsporemonokaryonstrains.Weobtained

thepheromonereceptorfragmentfrommonokaryonstrainswiththematingtypefactorBl

usingspecificprimersrcbl-Bl-Frcbl-Bl-R;alsoobtainedthepheromonereceptorfragment

piiiiDIN.ID。ii_9irii_9ir\,IOMU4_iCMI□乙r\,2amrmyudiiagiiiDI11uer11

RrnmnnarfirAPtnrfnmthAPrntnPlaatmnnnkarvnnRITAinaandsPnrAmnnnkarvnnatcina

frommonokaryonstrainswiththematingtypefactorB2usingspecificprimersrcb-B2-F

rcbl-B2-R.

5.ThepheromonereceptorgeneencodedbyLS-rcbl-Blwereseventransmembrane

proteinsfollowingtheanalysisusingtheTMpredsoftware.Phylogeneticanalysisonamino

acidsofpheromonereceptorgeneLS-rcbl-Blaswellasother15kindsofbasidiomyceteswas

donebyusingtheNJmethodinPHYLIPsoftwarepackage.Theresultshowedthatthe

LentinussquarrosulussharedthesameclusterwiththeLentinulaedodes.

KEYWORDS:Lentinussquarrosulus,ITS,Bmating-typelocus,pheromonereceptor,

chromosomewalking

目录

第一章绪论.........................................................1

1.翘鳞香菇的概况..................................................1

2.食用菌育种技术概况..............................................2

3.食用菌品种鉴定方法..............................................5

4.担子菌交配型因子的研究进展......................................7

5.课题的提出及意义...............................................12

第二章翘鳞香菇的形态学特征分析....................................13

2.1引言............................................................13

2.2材料与方法.....................................................13

2.3结果与分析.....................................................15

2.4讨论.......................18

第三章翘鳞香菇ITS序列分析........................................20

3.1弓|言...........................................................20

3.2材料与方法.....................................................20

3.3结果与分析.....................................................24

3.4讨论...........................................................27

第四章翘鳞香菇B交配型位点解析...................................28

4.1引言...........................................................28

4.2材料与方法.....................................................28

4.3结果与分析.....................................................32

4.4讨论...........................................................45

第五章总结........................................................49

5.1本课题的结论...................................................49

5.2本课题创新点...................................................49

5.3存在的问题及展望...............................................50

参考文献.......................................................51

附录...............................................................56

硕士期间发表论文及学术活动情况.....................................60

致谢..............................................................61

-6

32二口—T八

析...................................................................

东华人学硕I•论文

第一章绪论

食用菌以其独特的生物学特性和生产方式成为农业中的一个新型产业，越来

越受到人们的重视。1973年能源危机以后，唤醒了人们对农业、工业废弃物利用

的重视，在全球范围内开始利用农作物秸秆、棉子壳、木屑等废弃物质米栽培食

用菌，通过生物质转化生产人类需要的优质蛋白质并解决环境污染等问题。在中

国，自上个世纪80年代以来，随着人工栽培食用菌技术的不断进步和推广，以及

国民食品消费结构与层次的改善和提高，人工栽培食用菌迅猛发展。中国已成为

世界上的食用菌栽培量、加工、贸易最大国家。目前全国有直接从业人员1860

余万人；生产品种90多个，产量1100多万t,产值480亿人民币，出口60万t,创

汇9亿多美元。食用菌已经跃居我国继粮、棉、油、果、菜之后的第六大农副产

品和重要的创汇农产品。同时，伴随着品种优良化，栽培标准化和市场品牌化进

程，食用菌生产在我国已早现产、小化发展态势，已成为大农业的一个重要组成部

分⑴。

食用菌中蛋白质、氨基酸、多糖、维生素及微量元素含量丰富，是一类珍贵

的保健食品⑵。近年来，国内外对食用菌中活性物质的研究取得了一些成果，学

者们的研究主要在食用菌中蛋白质的抗病毒、抗肿瘤和多糖抗肿瘤及作为癌症辅

助治疗药剂等方面⑶。

1.翘鳞香菇的概况

1.1翘鳞香菇的分类地位

翘鳞香菇是一种新近开发的具有很大市场潜力的食用菌新品种，它属真菌

界(Eumycota)、担子菌亚门(Basidiomycotina)、担子菌纲(Eubasidiomycetes)、

层菌亚纲(Hymenomycetiae)、多孔菌目(Polypo-rales)、香菇科(Lcntinaceae)、香

菇属(Lentinus),Lentinussquarrosulus»翘鳞香菇，又称獐子菌、仲

帽、獐头菌，子实体中等至大型。

1.2翘鳞香菇的形态特性和分布

翘鳞香菇的菌盖初期突起，后扁平，中部脐状或下凹，有时呈浅漏斗状，

浅粉灰色，表面有暗灰色到黑褐色瓦状大鳞片，趋向中央特别大并翘起，呈同

心环状排列，菌盖直径6-10cm,故称翘鳞香菇。菌肉近白色，菌柄中生或稍偏

生，上下等粗或基部膨大，中实、平滑、淡白色，后期变淡褐色。翘鳞香菇属

于近裸香菇I’】(白斗菇，八担柴菇，翘鳞香菇，白菇，白香菇，鳞斗菇)生于

混交林或阔叶林的腐木、木桩及铁道枕木上。是热带国家例如马来西亚、尼日

尼亚等国较为常见的一种天然食用菌，翘鳞香菇在我国主要分布于贵州、云南、

广东、广西、海南、福建、西藏、台湾。

东华大学硕I:论文

1.3翘鳞香菇的栽培现状

翘鳞香菇是新近开发的具有很大市场潜力的食用菌新品种，鉴丁翘鳞香菇在

热带地区雨季（4-10月）才可见，野生较多，大规模为其人工培养的很少见。

1.4翘鳞香菇的食药用价值

尼日尼亚学者Gbolagade⑸指出翘鳞香菇子实体有降低血中胆固醇的作用，

并含有较丰富的多糖类物质，其含有的蛋白质可以是动物蛋白的替代品，在尼R

尼亚的乡村居民和买不起肉的人群中非常受欢迎。翘鳞香菇在幼嫩时味道鲜美，

但老后或雨多浸湿者带苦味。

本课题组人员用体外细胞模型，对翻鳞香菇的菌丝体和子实体的醇提物和水

提物进行了肿瘤细胞抑制实脸和免疫活性调节实验，显示翘鳞香菇菌丝体和子实

体的醇提物体外抑制肿瘤细胞生长有一定作用。目前，对翘鳞香菇的研究正处在

起步阶段，我们深信，随着研究的不断深入，翘鳞香菇将更加受到人们的关注，

并展现出更广阔的前景。

2.食用菌育种技术概况

优良品种是保证食用菌产业稔步，健康发展的基础。随着人们对食用菌营养

价值和药用价值认识的提高以及食用菌产业所带来的经济效益的增加，育种工作

便成为受关注的热点之一，主要的育种手段有人工选择育种，杂交育种，原生质

体融合及基因工程育种。

2.1人工选择育种

本实验室现阶段的翘鳞香菇育种方法就是人工选择育种进行驯化栽培。人工

选择育种是指采用人丁方法，定向选择自然条件下发生的有益变异并使其不断积

累，从而获得获得所需的新品种。

人工选择育种可以通过收集野生资源，对其进行驯化栽培，或者对引进品种

进行适应性栽培试验，尽而筛选优良菌株并加以保存和推广应用。我国福建三明

真菌研究所于1993年首次从台湾农业试验所的彭金腾教授处引进原产欧洲的杏

鲍菇菌株，之后又收集和分离了10个来自世界各地的杏鲍菇菌株⑹，把杏鲍菇自

然季节栽培技术推广至我国。王淑芳等⑺通过定向驯化试验选育出了杏鲍菇优良

品种HRX。优良的香菇品种7401、7402、7405、广香5号、广香7号、广香9号、

241和8210等均是通过人工选择法筛选得到的⑻。

需要指出的是人工选择不能改变个体基因型，它只是利用并积累自然条件下

发生的有益变异。此外，山环境条件引起的非遗传变异，并不能得到保留，而且

此种方法既费时又费力。但是，人工选择育种是食用菌发展初期选育优良品种简

单而有效的方法之一，是各种育种方法的基础。

2

东华大学硕I论文

今后乃至很长的一段时间，充分利用新技术和新方法，全面系统地对我国丰

富的食用菌野生资源和栽培品种进行调查、采集、分离、保臧和种性研究（包括

外部形态、生理习性、营养价值、遗传特性），以满足人工选择育种需要足够的

野生菌种资源和选择可遗传的有益变异的需要阴，也是一个很重要的研究方向。

以下几种方法虽然在食用菌育种工作中已经比较普遍，但是目前还没有关于

下述育种方法在翘鳞香菇育种中的报道。

2.2诱变育种

诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理样品细胞群体，提高其突变率，然后

从群体中选出符合育种目标的突变株。物理诱变剂有非电离辐射类的紫外线、激

光以及能引起电离辐射的X-射线、丫一射线和快中子等；化学诱变剂主要是烷化

剂、碱基类似物、口丫唯类化合物，它们的诱变机理均为引起基因突变〔此⑴。目前，

以菌丝片段和原牛质体为诱变材料,通过y-射线、紫外线、激光和太空辐射后，

食用菌生理生化和遗传特性发生变化及新品种选育研究的报道较多。

辐射诱变育种技术相对人工选择育种来说操作要简单一些，且提高了食用菌

遗传突变的机率，为选育高产、优质、高抗的食用菌品种提供了新的途径。但由

于整个基因组在诱变时都接受同样处理，也会产生一些不利突变，有益变异的机

率相当小，选育工作量还是相当庞大，目前在食用菌高产菌株的诱变育种中，成

效特别显著的例子还为数不多。

2.3原生质体融合育种

20世纪60年代出现了原生质体融合技术，是指通过破壁得到的不同遗传类型

的原生质体，在融合剂的诱导下融合，最终达到部分或整套基因的交换和重组，

从而获得重组子，产生新的品种和类型。它在食用菌品种选育上的应用，能使食

用菌远缘杂交、相同交配型杂交及共生菌根菌的驯化栽培成为可能。它为利用野

生种质资源、扩大现有栽培种基因、缩短育种周期、提高工作效率开辟了一个新

途径。但是，食用菌原生质体融合育种技术的进展同其他生物相比，要落后很多，

食用菌不同科、属或种间原生质体融合研究只不过是最近15年左右的事情。

原生质体融合技术是在细胞水平上使亲缘关系较远的不同种属间物种的遗

传物质进行交换，扩大了遗传物质交流的范围，增加了变异创造的途径和选择范

围。但属间融合子稳定性差、生产性能不佳，在目前甚至今后较长的一段时间内

要获得突破有一定的难度［⑵。

2.4基因工程育种

基因工程是在基因水平上的遗传操作，它是采取一定的方法从某一供体生物

中提取所需要的基因，在离体条件下用适当的限制性核酸内切酶切割，再与载体

连接起来并一起导入受体生物细胞中进行复制和表达，从而选育出新品种，它是

3

东华大学侦I:论文

人们在分子生物学理论指导卜自行设计基因蓝图，可实现亲缘关系较远的菌株间

杂交，比常规育种优越很多的定向育种新技术。

基因工程育种的大致过程为先利用DNA分子标记技术进行杂交亲本的选

择、杂交种的鉴定及亲子遗传相关性分析，再克隆分离目的基因，分析其序列特

征和表达特性，然后进行遗传转化得到转化子口大

基因工程育种技术是在分子水平上对食用菌遗传物质进行操作，它所创造的

新物种在自然演化中不一定能出现，作为一种可控的育种手段，必将在食用菌育

种中发挥重要的作用。食用菌产量、品质、抗性和耐贮等相关重要基因紧密连锁

的分子标记的寻找、基因的克隆、表达与功能验证，适宜载体的构建和高效稳定

遗传转化体系的建立等方面是今后食用菌育种的主要研究课题【⑷。

2.5杂交育种

杂交是指不同遗传类型之间的交配，使遗传基因重新组合，创造出兼有双亲

优点的新品利％杂交育种是目前食用菌新品种选育中使用最广泛、收效最明显的

育种手段。杂交是遗传物质的一种在细胞水平上的重组过程，由于食用菌能产生

有性抱子，因此，原则上都可以像高等植物那样通过有性杂交进行育种，从而获

得综合双亲优良性状的新品种。潘迎捷【⑸（1993）等发现原生质体单核化是香菇、

平菇、金针菇等异宗结合食用菌的菌丝体在原生质体制备过程中的一个普遍现

象，并认为原生质体单核体不仅是一个重要的遗传材料，而且这一技术的应用为

食用菌育种研究开辟了一个新的途径，扩大了杂交材料的范围。用于杂交育种的

材料主要有单核体菌株和双核体菌株两种，其中单核体应用较多，又分为原生质

体单核体和抱子单核体两种。杂交育种的方法有对称杂交和非对称杂交两种〔⑹。

2.5』对称杂交

用于杂交的单核菌丝可通过担抱子单抱分离获得，亦可采用双核菌丝原生质

体单核化的方式获得。对称杂交的基本遗传特征是两个单核体亲本的核基因和细

胞质基因均等的重组在一个新形成的杂交细胞中。由两个遗传组成不同的亲本杂

交产生的后代，在菌丝长势、抗逆性、产量和品质上表现出与双亲不同的连续变

异，从这种变异中，我们可以筛选出符合育种目标的优良菌株。这是食用菌菌种

改良中产生新的种质资源的一个主要方法和手段。此法要求杂交后代能表现出较

强的杂种优势，所以要通过对亲本多种性状遗传差异进行综合分析，选择具有较

大遗传差异的双亲。通过对称杂交实现亲本遗传物质的组合和交换以产生新的种

质，在我国香菇菌种的选育上成就瞩目。目前，我国香菇生产中相当数量的菌种

都来源于对称杂交育种，其中最为典型的是由福建省三明真菌研究所蔡衍山等选

育的Cr02、Cr04''0

252非对称杂交

4

东华大学硕I:论文

非对称杂交方法是建立在布勒现象基础上，其主要原理是以需改良菌株的原

生质体单核体为受体，以能提供改良菌株所需性状的双核菌株为供体进行杂交。

在这种杂交中，供体和受体的遗传物质不均等的分配在后代中，形成了一个同质

异核的基因组后代，它是一个具有一套完整的受体细胞质和分别来自供体和受体

两个异核的遗传重组体。

非对称杂交是针对已具备多种优良性状但需进一步改良的菌种而建立的一

种育种方法。该法除具对称杂交优点外，后代遗传性状和表型更接近受体，受体

一方可以完全地保持其全部遗传性状。因此，非对称杂交具有独特的遗传背景与

优势，而且由于只需一个亲本进行单核菌丝的制备，另一亲本为正常双核菌种，

减轻了工作量。此法也为一些优良食用菌菌种在有限的遗传范围内进行提纯复壮

提供了一条新的途径。在食用菌育种工作上，利用非对称杂交方法也成功培育出

了优良新品种。优质、高产、抗逆性强、栽培适应性广的香菇品种申香10号就是

迪世半以氽父世EF皿感,tf'J由T超驻菅姑具内莉温出姑的荷TI,怅如好一特‘住，

可以设计出以翘鳞香菇双核体为供体，以其他近缘菌株单核体为受体的非对称杂

交实验，以期改良菌种耐高温性。

但是，杂交育种也有一些局限性，它虽能够产生新的基因组合，但不能产生

新的基因，杂交育种步骤较繁琐，工作量较大。今后，应利用最新的分子生物学

手段进行食用菌种质资源遗传多样性和亲缘关系评价鉴定，寻找与优良性状紧密

连锁的分子标记，将DNA分子标记辅助选择与杂交育种技术相结合，减少以往

杂交育种工作中亲本选择的盲目性，提高育种效率【皿。

3.食用菌品种鉴定方法

用于食用菌菌种鉴定的方法主要有：形态学鉴定、以DNA多态性为基础的

分子标记。如果能将各种鉴定方法相结合使用，可给菌株一个尽可能详尽的定义。

3.1形态学鉴定

形态学特征在真菌分类鉴定中占据着重要地位，特别是大型担子菌的分类，

最初多用宏观性状，即外部形态，如子实体的形状、大小和颜色、表面是否平滑、

粗糙或有毛，菌肉的质地和气味，菌盖与菌褶或菌管分离的难易程度以及孩子印

的色泽等除此之外，细胞学性状等也可以作为分类依据。该方法简便直观，容易

操作，在食用菌品种鉴定中是一个重要的指标。

但是由于真菌的某些形态特征和生理生化指标易受外界环境和栽培条件的

影响，许多检验结果难以量化，并且难以区分变异来源，影响品种遗传特性的判

断。在食用菌生产过程中，同一个品种不同栽培方式产生的子实体形态特征有差

异，覆土栽培和非覆土栽培产生的子实体形态也有差异。因此单纯利用形态特征

进行真菌菌株分类鉴别容易产生分歧〔2叫

5

东华大学硕I:论文

3.2DNA分子标记

-

.I..LZ»U*/、，，L人、rT1­»v*I♦Vft”■*I-Lff.▼r«1*「「1-t*--4=4-n-1，》•，-L―I—izAr/\J.''—I

小丁I陀畛且按以灰艮Hi国UNA小r歹念旺仲「苹四/E包兄也E，7厂厂4小七

技术在食用菌遗传图谱构建，遗传多样性，育种及菌株鉴定等方面的应用倍受亲

睐。DNA分子标记通常也称为DNA指纹图谱，是指能反映生物个体或种群间基

因组中某种差异特征的DNA片段，狭义的分子标记特指DNA标记。所以DNA分

子标记是继形态标记和生化标记之后发展起来的一种理想的遗传标。

日前一口"，后山粉了十种分子林岸一i甬堂一过叱仆彳烷汜相捉苴其水质理可

r-t，■-'«»，I，/、.1・>/T^、7I(IXWY，•y••I•••-^―».，—・・》■、・I/、I.|•—V

分为三大类，分别是以分子杂交为基础的分子标记，如RFLP；以PCR技术核心

的标记，如RAPD、ISSR等；以DNA序列为基础的标记技术，如SCAR标记技

术。不同的分子标记在种质资源评价、菌种菌株鉴别方面的研究均有报道，并取

得了成效，这里不一--赘述。

3.3木亥糖彳本DNA(rDNA)

核糖体作为蛋白质合成机器，是所有细胞最基本的细胞器，核糖体RNA是

核糖体的基本组成部分。rRNA作为细胞中最古老的分子之一，具有功能和进化

上的同源性，是研究生命起源和早期生物进化以及分子系统学的“活化石”。编码

rRNA基因的核糖体DNA(rDNA)在进化上相当保守，近年来成为研究高级分类

再I，元J，分J子•»李结学4i的j,隹、、、占,、、、【21】。

真菌核糖体DNA是由转录单位和非转录的间隔区组成的重复单位，在基因

组中串联排列。如图1所示，一个真菌核糖体DNA重复单位包括：18S、5.8S、

26S、5s四个基因,以及两个内部转录间隔区(internaltranscribedspacer,ITS)

和两个转录单位间隔区(intergenicspacer,IGS)共八个部分。

图1真菌rDNA位点图示

其中，内转录间隔区(ITS)的进化较快，常用于属内种间系统发育研究［22-23】。

Alvarez调查近几年发表的关于植物属或属以下水平系统发育的文献，其中66%

文章应用了ITS的序列，更重要的是，34%的文章是完全建立在单独的ITS序列

分析的基础上的123由此可见ITS序列分析在系统发育研究中的重要性。

目前,，用于扩增ITS不同区域的一系列保守引物已经设计成功3】，如图2

所示。在真菌遗传研究中被广泛应用的是通用引物对ITS1/ITS4»

6

东华大学硕I:论文

ITS1F

ITS5

ITS1ITS3

SR6R5.8SR

5.8S

5.8SLR1

ITS2ITS4

ITS-1ITS-2

ITS4R

图2用于ITS扩增的引物

陈春涛等用RFLP研究工香菇主栽品种的ITS区段及线粒体DNA(mtDNA)

的小区段，结果表明同种内菌间的rDNA具有相对的遗传稳定性；菌株间在所研

究的区段有很高的遗传相似性囤。秦莲花等用ITS和SSR分子标记技术结合鉴

别香菇生产用种DI,这些都为ITS技术应用于食用菌菌株快速准确鉴定提供了技

术依据。

4.担子菌交配型因子的研究进展

4.1担子菌的典型生活史

担子菌是以担子为有性剂子、担抱子独特地形成于担子外面的菌类总称。担

子菌的减数分裂发生在抱子台这个特殊的细胞中，所产生的担抱子在细胞外发

育。这与其他主要的蕈菌有所不同，例如子囊菌的减数分裂是在子囊细胞进行

的，所产生的囊泡子在细胞中发育。

灰盖鬼伞(Ccinereus)作为担子菌的模式菌株,‘它的生活史是最具有代表性

的。有性担抱子萌发形成具有单核细胞的无性单核菌丝〔2叫两个可亲和的单核菌

丝通过融合，质配进而形成有性双核菌丝体。紧接着是进行核的交换：引入的核

迅速迁移并穿过它的交配细胞进入到一个新的单核顶端细胞，在新的单核顶端细

D/tr-U.nI、AAt4•+J壬!]-r^占八.WrUX/I.r=nih-AA✓\T*r号山Z4TJU/tAA/\右11FlA九A人'-k/口

〃巴十，*71，、口次刁案IJI、口'JT*及±1吗少1PJ刀-冏。J火乂血的〃巴tTJTT衣7E'厂及狂，

它包括了锁状联合结构的形成。锁状联合确保了每个双核菌丝细胞保持它的“双

核分配”的核，一个核进入锁状联合细胞并进行分裂，另一个核在双核菌丝细胞

的主要部分中进行分裂。隔膜使得它们产生3个细胞，一个新的双核细胞和两个

单核细胞[2叫每个细胞含有不同的核。当锁状联合细胞顶端与近顶端细胞融合时，

核分裂也就完成了。分裂的核迁移并进入到它的可亲和体中。这在每个顶端细胞

的分离的过程中反复着。当受到环境刺激时，双核发育成有组织分化的子实体，

核融合也最终完成。但是紧接着发生减数分裂和有性担抱子的形成。担抱子弹射,

7

东华大学硕I:论文

待环境条件适宜时，担抱子萌发又开始新的生活周期。

图3灰盖鬼伞的生活史

另外还存在一些有隔担子菌纲，它们的生活史和灰盖鬼伞有区别，产生裸露

的抱子，我们可以用玉米黑粉菌（U.may出s）生活史来描述这一类担子菌的生活

史特征。玉米黑粉菌中，是一种寄生于玉米上的致病菌。它存在由出芽生殖得到

的寄生单抱子，具有不同a交配型基因的担孩子可以融合，融合之后菌丝变长，

在尖端形成接合管，如果b位点也是亲和的，那么就可以形成双核菌丝了。双核

菌丝在宿主中生长到一定阶段之后，感染宿主，双核菌丝分化成二倍体的池子，

经减数分裂形成四种单倍体细胞，四倍体细胞形成原菌丝，原菌丝出芽形成担抱

子。至于玉米黑粉菌的双核体是不是会有锁状联合以及宿主植物在玉米黑粉菌的

双核体形成及核配过程中起到的作用现在还不清楚，但是同其它担子菌一样，a、

b交配型基因在双核体形成和维持过程中都是必须的13”

8

东华大学做I论文

图4玉米黑粉菌的生活史

交配型基因在担子菌中的作用是阻止自交从而维持种群中的遗传多样性。在

担子菌中，不需要特殊的生殖细胞融合，只要体细胞可以融合就满足了交配的条

件。交配型基因控制遗传本质上不同的个体中的核相互融合形成双倍体核。双倍

体核再进行有性抱子形成之前的减数分裂。自身不育的物种被称为异宗结合，而

那些能自交的物种被称为同宗结合⑶］。担子菌绝大多数是异宗结合，并且具有一

个明显的特征就是含有多对等位交配型基因。

4.2交配型系统的类型和交配型因子研究进展

4.2.1交配型系统

大多数担子菌是异宗配合进行有性生殖的，该过程有一个或两个遗传因子决

定，由一个因子决定交配型的机制称为二极性交配系统卬】；由两个独立分配的因

子控制的交配称为四极性交配系统用］。二极性交配系统的遗传结构相对简单，A

因子是唯一的控制因子，它实际上由两个紧密连锁的基因簇组成，四极性交配系

统中，A和B因子分别对应位于不同染色体上的两个交配型位点(Matingtype

locus),两个单核菌丝相遇，只有当它们形成AaApBaB。型时，才能产生具有锁

状联合的双核体，完成整个有性生活史。

在担子菌模式菌种中，交配型是由两个不连锁的位点上的基因所决定的

例如食用菌中的A和B,玉米黑粉菌中的a和b。一般认为A因子控制核配对与

锁状联合的形成，B因子控制核迁移与锁状联合的融合可亲和的交配也就是

交配位点上不同的等位基因相结合的一个过程。例如灰盖鬼伞和裂褶菌中的

A1B1XA2B2,玉米黑粉菌U.maydis中的alblxa2b2。

9

东华人学硕I:论文

Indr|)endcnlofMatingType

llyphalFusion

itfiviivCmiif<>l

NuclearMigraiion

SeptalDissolucion

AGeneControl

NuclcaiPairing

ClampCellTonnation

Co-ordinatcNuclearDivision

ClumpCellSeptalion

BGeneControl

ClampCellF?usion

.1andBGeneControl

Maintenanceof(heDikaryron

图5A、B交配型基因对灰盖鬼伞的双核体形成和维持的调我作用

4.2.1交配型因子研究进展

通过对灰盖鬼伞的交配型因子的研究得出，A因子由3个功能独立的亚单位

所组成，每个亚单位是编码2种不同的同源结构域蛋白［36］。B因子同样由3个功

能独立的亚单位所组成，每今-亚单位编码1个信息索受体和2个信息素"71。

(a)TheAlocusofCopnnuscuiereus(b)TheBIccusofCopnnuscm^reus

Group1Group2Group3Group1Group2Group3

HOIHD2HD1HD2HC-1HD2

—(■»»<■■■I.■■■——4-8Hocus

Encode

Honieodomamproteins

Heterodimerize

todikaryon-specific

transcriptionfactor

Activationdomain

Nuclearlocalization

signal、HD2

DNA-bmdmg

HD1-----domain

DNA-bmding<DNA

domain

Recognition

dimenzation

domain

Transcriptionalactivation

图6灰盖鬼伞交配型A、B位点的结构

根据同源结构域序列的不同，A位点的交配型蛋白分成两个具体的亚组；HD1

和HD2oHD1类的同源结构域被认为是非典型的，主要是因为它偏离保守

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东华人学硕I:论文

的同源结构域序列（尤其在识别螺旋中）并在螺旋的空隙处发生变化。HD2类的

蛋白具有序列的特征结构，这使得它们更相似于保守序列.只有当来自于一个交

配异二聚物的HD1蛋白与另一个交配异二聚物中的HD2蛋白相结合时，才发生

细胞内的有性亲和的识别，并形成一个功能性的控制蛋白【3”这个异二聚物被推

定为转录因子，能够结合前体基因中唯一的靶位点。它会使得细胞完成一个新的

发育途径。不进行交配的细胞不能形成转录因子，因此也就不能进行有性发育。

很明显，细胞内的可亲和蛋白的识别是很重要的。一个HD1蛋白不能与由相

同的不交配细胞编码的任何HD2蛋白异二聚化。否则A因子的控制途径不需要

交配就可以激活了。同源结构域的氨基酸末端区域是用来区分可亲和与不可亲和

作用的，在识别的区域内，用关键的残基来代替会影响蛋白的特异性13叫

信息素信号对食用菌的交配与有性发育起着必要的作用。在交配型8位点中，

编码信息素和7次跨膜信息素受体的多等位基因是相互隔开的RO1。研究已经分离

出灰盖鬼伞的交配型8位点。序列分析和转化分析鉴定了编码3个7次跨膜受体

基因和6个信息素前体基因，共9个基因，长度总共为17kb。9个基因的排列显

示出该位点山三个功能独立的亚单位所组成。

像A位点一样，B位点具有特异性是取决于3个功能独立的基因。而且，这

些基因属于独立的亚单位。亚单位内的每个等位基因是由一个“盒”组成，其中包

括了个受体和两个信息素基因⑷］。两个种交配只需个亚单位的盒不同，并是

可亲和的。

blocusalocus

图7玉米黑粉菌交配型a、b位点的结构

在玉米黑粉菌中，交配型位点的定义先于对交配型基因的性质了解，后来的

研究发现食用菌中的A基因相当于玉米黑粉菌中的b基因，B基因相当于玉米

FFI业八-dttrL!~,AA.七七rn/OCTr\

忐仍国十TJd圣⑷、国/7o

在每个b位点上有两个基因。分别定义为bE和bW,两者的转录是不同的HL

bE基因编码HD1蛋白，bW编码HD2蛋白。仅两个多肽就足以满足交配〔4叫这

一对多肽必须包括一个HD1蛋白和一个HD2蛋白。例如一个bE蛋白和一个bW

蛋白。多肽必须来自于不同的交配型。例如bEl和bW2或者是bE2和bWl。尽

管这样，食用菌中的A位点上的基因比玉米黑粉菌b位点匕的基因多，相应地

在细胞内更多的可亲和的与不可亲和的交配体基因产物需要加以区分开来1的。

a位点的两个等位基因，al和a2,它们是由不相似的DNA序列所组成，序

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东华大学硕I:论文

列中间具有同源区域口式每个位点含有两个基因，这两个基因编码一个交配特异

性信息素基因和相应的受体基因口”编码信息素受体的基因分别为pral和pra2o

编码信息素或交配因子的基因分别为mfal和mfa214。而且a2位点含有两个基

因Iga2和rga2,这两个基因的功能还不清楚，但是是由信息索反应途径所激活〔4叫

5.课题的提出及意义

食用菌产业，随着市场竞争的FI趋激烈，其产量和质量成为决定企业能否生

存的关键。作为一种农产品，食用菌的产量和质量不仅仅取决于生产条件，更取

决于作为生物学基础的菌种。目前，传统加工技术和工艺，限制了大部分菇农的

生产，在盛夏时期由于天气炎热不得不停止生产，这样难以适应多样化的社会需

求以及消费者对加工品的质量要求。因而在引进适宜在高温条件下出菇的新种，

并对其进行深入研究，扩大食用菌品系资源，增加优质高产菌株势在必行。

本研究先从翘鳞香菇的形态学着手，首先对8株翘鳞香菇菌株进行出菇实验，

证实其可以在较高温度下出菇，具有驯化应用前景。分析其形态特征，从外部特

征对菌株进行鉴定，再通过ITS序列分析分类鉴定，最后结合通过对交配型因子

B位点信息素受体基因的克隆和分析。为制鳞香菇的进化分类提供一些参考依

据，对其交配型B位点进行解析，指导今后的育种工作。本研究将传统的形态学

鉴定方法与分子生物学研究方法相结合，从系统分类学角度为判断翘鳞香菇的分

类地位提供实验证据。

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东华大学硕I:论文

第二章翘鳞香菇的形态学特征分析

2.1引言

形态学特征在真菌分类鉴定中占据着重要的地位，特别是大型担子菌的分

类，最初多用宏观性状，即外部形态，如子实体的形状、大小和颜色，菌肉质地

和气味，菌盖与菌褶或菌管分离的难易程度以及抱子印的色泽甚至是有无锁状联

合等。但是真菌的形态学特征易受到外界环境和栽培条件的影响，如空气湿度、

温度等因素，从而影响品种特性的判断，因此单纯利用形态特征进行真菌菌株分

类鉴定容易产生分歧。虽然不能单纯利用形态学进行品种鉴别，但该方法的优点

是简便直观，容易操作。

对于野生菌株在不了解其生物学背景下，对其出菇观察，可以作为品种鉴定

中的一个辅助指标。本研究对8个野生菌株进行出菇实验，对子实体外部特征进

行分析，并根据池子单核体的分离结果，对翘鳞香菇的交配型进行初探。

2.2材料与方法

2.2.1供试菌株

表1供试菌株

菌株序号保藏中心编号一菌株源地

1.0825上海

2.0826美国

3.0827美国

4.丽水浙江

5.0182上海

6.MQL马来西亚

7.QL7-4海南

8.QL7-6海南

2.2.2供试培养基

(1)PDA培养基

PDA培养基：去皮马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,蒸镭水1000mL,

pH自然。用于母种培养、担抱子分离和杂交培养。

(2)栽培培养基

木屑(85%)、熟皮(15%)、每瓶干重(240克)、含水量(60%-62%)。

2.2.3主要仪器

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东华大学做I论文

灭菌锅、超净工作台、培养空、栽培房、生化培养箱、光学显微镜等。

2.2.4栽培方法

采用850mL袋栽，每袋装湿料600g（含水量60〜62%）后盖上海绵盖，⑵C高

压灭菌2h。灭菌后放入冷却室，待瓶体完全冷却、中心料温低F25c后接种，

接种量为3%（v/v）,然后置于室温24-25C,培养50d左右菌丝可长满袋。

当在培养料和塑料袋间出现一些零星的隆起物：培养料表面出现褐色色素且

有淡黄水珠分泌；手握菌袋感觉重量明显减轻且稍有弹性时.说明菌丝发育已经

成熟，可以移出培养室，栽培出菇。

选择最高气温维持在28-32C时移至栽培房出菇，菇房内温度要求保持在

80%以上，自然环境的温差刺激使其现蕾，出菇。菇蕾形成后，子实体逐渐长大

至适度成熟时采收。

2.2.5栽培性状观察

跟踪子实体的生长情况，观察栽培的子实体的菌盖、菌柄、菌褶的形态特征。

2.2.6抱子的采集

采用池子印法收集抱子。挑选发育成熟的子实体，剪去菌柄，让带有菌褶的

一面平贴在平板上，置于25℃培养箱24h后收集泡子，置于4℃下备用。

2.2.7狗子单核体的分离和单核体菌丝的确认

刮取少量的抱子用无菌水稀释抱子至104个/mL（血球计数板法），每皿涂布

100uL于PDA平板中（培养皿直径为9cm,培养基量约为20mL/皿）。25℃下

黑暗暗室中倒置培养8-10d,在平板上形成肉眼可见微小联成片的菌落后，用接

种针挑取适当大小的菌丝块转接于PDA平板上.继续培养5d（条件同上），重复

挑取转接1~2次，直到获得纯培养菌落,最后在菌落边缘挑小菌丝块压制水玻片于

显微镜下（放大300倍）观察菌丝有无锁状联合，菌丝有锁状联合的为双核体。

2.2.8翘鳞香菇原生质体的制备和再生方法

将翘鳞香菇接种在PDA平板上活化约五天后，无菌条件下将平板表面菌

丝刮卜（可携带少量培养基），置于均质仪中，加入约50mlpD液体培养基，高

低速间隔打碎约30s,分别倾倒在两个盛有25mlpD液体培养基的三角瓶中，每

瓶约倒20ml,25℃静置培养。

菌丝培养3-5d后，用带有滤膜的漏斗过滤，经无菌水冲洗，用灭菌吸水纸

吸干水分。用0.6mol/L的甘露醇配制1.5%的溶壁酶溶液6ml,经孔径为0.45R《

的细菌过滤器过滤除菌后，将菌丝转移到酶液中，使其均匀散开.35c酶解3h,

间或摇晃，使菌丝与酶液充分接触。

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东华大学硕I:论文

酶解结束后，用带有棉塞的注射器过滤除去残留菌丝，3000r/min离心lOmin,

倾去上清液，原生质体沉淀用0.6mol/L的甘露醇洗涤1-2次后用血球计数板镜检

计数，将悬液稀释到最佳浓度（一般为IO,个/ml）,梯度涂布于再生培养基PDMS

平板上（303，W，50似），25c恒温培养6-7天后可见星芒状再生菌落。挑

每H出现的较小菌落转移到PDA平板中，每个平板放7-8个，直到不再有再生

菌落出现或无法挑到单菌落为止。所挑菌落长到直径0.5cm以上时，挑其边缘菌

丝镜检，无锁状联合的为单核体，编号保臧，有锁状联合的为双核菌丝，弃之，

一般双核菌落较大，可通过肉眼进行粗筛。

2.2.9交配型分析

从获得的单核菌株任选一个为测试菌株T1,并初定其交配型为A1B1,让T1

与所有的单核菌株进行第一轮配对，从与T1交配亲和（形成锁状联合）的单核菌

株中选一个T2作为第二轮的测试菌株，与所有的单核菌株进行第二轮配对，则

T2的交配型为A2B2,从与Tl、T2都不亲和的单核菌株中选一个T3作为第三轮测

试菌株，与所有的单核菌株进行第三轮配对，最后再从与T3亲和的单核菌株中选

一个T4与所有的单核菌株进行第四轮配对。通过此法把翘鳞香菇的单核菌株分为

四组；让Tl、T2、T3和T4进行两两配对，再根据亲和反应（发生锁状联合），

平贴反应和栅栏反应等现象，来确定T3和T4的交配型，如果T3的交配型为A1B2,

T4的交配型为A2B1,Ar（A因子的重组型）既能与T1亲和又能与T4亲和，Br（B

因子的重组型）既能与T1亲和又能与T3亲和，从而确定含有Ar或Br的交配型。

2.3结果与分析

2.3.1形态学鉴定

对8株翘鳞香菇的出菇进行了跟踪观察，记录了它们的菌丝体时期、后熟时

期、转色时期、子实体发育期，开伞期的形态特征。部分图片见下：

图8菌丝体时期

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图9后熟图10转色

图11子实体发育