川芎基于抗血小板聚集作用与药效成分的质量评价

川芎基于抗血小板聚集作用与药效成分的质量评价中药川芎来源于伞形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根茎,具有“活血行气,祛风止痛”之功效。传统鉴别经验以“个大、饱满、质坚实、断面黄白色、油性大、香气浓者”为佳。在2015年版《中国药典》中,川芎以乙醇提取物(12%)和阿魏酸的含量(0.1%)为质量评价指标。显然,这两项指标难以有效地评价川芎的质量。现代研究表明,抗血小板聚集能够反映川芎活血化瘀的功效。川芎的主要药效成分(阿魏酸松柏酯、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A等)大多数为油状物,不稳定,难标化。为此,本论文建立以欧当归内酯A为内参物的川芎一测多评法和抗血小板聚集作用的生物检定法,对川芎的药效成分和抗血小板聚集活性进行比较,以期为川芎的质量评价提供依据。研究内容包括以下三部分:第一、川芎抗血小板聚集作用的定量测定:(1)通过考察体外定量测定抗血小板聚集作用的各个影响因素,建立了定量测定川芎抗血小板聚集作用的方法,即家兔血液经800rpm二次离心(每次10min)得到富血小板血浆(PRP),经3500rpm离心得到贫血小板血浆(PPP);加入300μmol/LADP的诱导血小板聚集,供试品溶解加入15%助溶剂二甲基亚砜(DMSO),从取血到测定血小板聚集率的整个实验操作在3h内完成。以阿魏酸钠为阳性药,在15~60mg/mL浓度范围内与血小板抑制率呈良好的线性关系(r=0.9934,n=4)。川芎粉末用水提取4次,以水溶液为供试液,根据量反应平行线法(2.2)法,测定次数不少于4次,可靠性检测(回归项P值<0.01,偏离平行项P>0.05)满足《药典》的要求,重现性实验RSD值为3.43%(n=6),精密度实验的RSD值为6.98%(n=6),可信限率为23.90%(n=6),小于30%。说明该方法的测定结果准确,重复性良好。(2)从不同产地和药材市场、饮片公司和药店收集了13份川芎药材样品、2份川芎饮片(川芎饮片和酒炙饮片)、2份川芎相关的中成药(速效救心丸和乐脉颗粒),测定其抗血小板聚集活性。结果表明,川芎药材、饮片及其相关中成药的抗血小板聚集活性分别为0.957U/g(n=13)、0.713(n=2)、0.646(n=2),说明建立的方法可以测定川芎药材、饮片及其相关中成药的抗血小板聚集活性。(3)根据川芎气味,断面颜色,将13份川芎药材中的10份样品分为一、二、三等:一等品香气浓郁、断面黄白色;二等品香气浓郁、断面黄色;三等品香气较淡、断面黄褐色。测定其抗血小板聚集活性,分别为1.306U/g(n=4,一等)、0.914U/g(n=3,二等)、0.722U/g(n=3,三等)。表明川芎抗血小板聚集活性的强弱与其气味、断面颜色的相关性强。第二、一测多评法测定川芎药材中7种药效成分的含量:(1)通过优化色谱条件,考察一测多评法的相关影响因素,建立了以欧当归内酯A为内参物测定阿魏酸、洋川芎内酯I、H、A、魏酸松柏酯、Z-藁本内酯和欧当归内酯A共7种药效成分的方法。欧当归内酯A与其他6种药效成分的相对校正因子分别为1.14、1.46、1.44、0.54、0.30、0.81。通过在3台色谱系统、2种色谱柱、3种流速和3种柱温条件下测定的相对校正因子的RSD值均小于5%,表明方法的重现性良好。42份川芎样品经外标法和内标法测定6种药效成分(阿魏酸、洋川芎内酯I、H、A、阿魏酸松柏酯、Z-藁本内酯)含量的RSD值均小于5%,表明建立一测多评法可准确地测定川芎中这7种药效成分的含量。(2)从不同产地和药材市场收集了44份川芎药材样品,根据药材的气味和断面颜色分为三个等级。测定其7种药效成分含量,并计算主成分分析的综合得分。结果表明,一、二等品之间没有显著性差异(P>0.05),一、二等品与三等品之间有极显著性差异(P<0.01),且一等品(﹣15.192,n=7)、二等品(﹣17.290,n=25)>三等品(﹣7.062,n=10);系统聚类分析可以将三等品与一、二等品分开,但一、二等品之间无法分开。分别以酚酸类成分、苯酞类成分、酚酸类和苯酞类成分总和的含量为指标,一、二等品之间没有显著性差异(P>0.05),一、二等品与三等品之间有极显著性差异(P<0.01),且一、二等品>三等品。以单一药效成分的含量为指标,Z-藁本內酯的含量与不同等级川芎药材呈正相关,一、二、三等品之间有极显著性差异(P<0.01),即一等品(13.492mg/g,n=7)>二等品(9.899mg/g,n=25)>三等品(5.818mg/g,n=9)。(3)从不同产地收集了31份川芎药材(四川都江堰7份,四川彭州13份、四川眉山11份),测定7个药效成分的含量。根据主成分分析的综合得分结果表明,四川彭州(6.11,n=13)>四川眉山(5.44,n=11)>四川都江堰(5.28,n=7);经方差分析结果表明,四川眉山与四川都江堰之间没有差异(P>0.05),四川眉山、四川都江堰与彭州之间有差异(P<0.01),即四川彭州>四川都江堰和四川眉山。酚酸类成分、苯酞类成分、酚酸类和苯酞类成分总和的含量在3个产地之间没有显著性差异(P>0.05);以单一药效成分含量为指标,Z-藁本内酯的含量在四川都江堰与四川彭州之间没有显著性差异(P>0.05),而在四川都江堰、四川彭州与四川眉山之间有极显著性差异(P<0.01);洋川芎内酯A的含量在四川彭州与四川眉山之间没有显著性差异(P>0.05),在四川彭州、四川眉山与四川都江堰之间有极显著性差异(P<0.01);其余的药效成分的含量在这3个产地的样品之间无显著性差异(P>0.05)。说明不同产地川芎药材Z-藁本内酯和洋川芎内酯A的含量不同。第三、川芎药效成分与抗血小板聚集活性之间的相关性研究:(1)建立了川芎经不同浓度(100%、70%、50%、30%、0)乙醇提取的提取物的HPLC指纹图谱,根据对照品的保留时间和紫外光谱,鉴定了9个色谱峰,分别为阿魏酸、洋川芎内酯I、H、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、E-藁本内酯、Z-藁本内酯、丁烯基苯酞,欧当归内酯A。经灰色关联度分析,这9种药效成分与抗血小板聚集活性的关联系数从大到小依次为0.6492(E-藁本内酯)、0.6316(洋川芎内酯H)、0.6198(阿魏酸)、0.6163(洋川芎内酯I)、0.6101(阿魏酸松柏酯)、0.6071(洋川芎内酯A)、0.5588(丁烯基苯酞)、0.5703(Z-藁本内酯)、0.5230(欧当归内酯A)。说明这9种药效成分与抗血小板聚集活性之间的相关性相近。苯酞类和酚酸类成分之和、酚酸类成分、苯酞类成分与抗血小板聚集活性之间的关联系数分别为0.6105、0.6099和0.6098,说明这几类成分与抗血小板聚集活性之间的相关性也相近。(2)测定了川芎药材水提物中的药效成分(阿魏酸、洋川芎内酯I、H、A)的含量,对不同等级川芎水提取物中的药效成分含量与其抗血小板聚集作用的生物效价进行曲线估计,只有阿魏酸与川芎水提物的抗血小板聚集活性的曲线估计通过t检验,呈现S形变化