川西獐牙菜醇提物对HepG2细胞膜转运蛋白MRP3、BSEP表达的影响

川西獐牙菜醇提物对HepG2细胞膜转运蛋白MRP3、BSEP表达的影响研究背景及目的：胆汁酸具有重要的生理功能，可参与多种物质的运输代谢，但同时胆汁酸也是胆汁淤积情况下导致机体损伤的原因。肝内胆汁酸大量的异常聚集，导致肝细胞损伤是胆汁淤积的主要发病机制。生理情况下，多种肝细胞膜转运蛋白参与肝内胆汁酸稳态的精密调节，主要包括：分布于基底侧膜面如MRP3、MRP4等，胆管膜面如BSEP、MRP2等。多药耐药相关蛋3(multidrugresistanceprotein3,MRP3)是具有ATP结合域的MRPs(multidrugresistance-assocatedprotein)超家族中的一员,是位于肝细胞基底外侧膜面最重要的胆汁酸转运蛋白。MRP3主要的生理功能是转运有机阴离子，如二价胆汁酸(葡萄糖醛化和硫酸化的胆汁酸)、GSH(还原型谷胱甘肽)和某些药物。生理状态下肝脏中MRP3不表达或低表达，但在胆道结扎和LPS诱导的胆汁淤积大鼠模型中，MRP3代偿性增高，有利于胆汁酸、胆红素等毒性物质及时被转运出肝细胞。胆盐输出泵(bilesaltexportpump，BSEP)属ABC(ATP-bindingcassette)家族蛋白，是位于肝细胞毛细胆管面的重要胆酸转运蛋白，主要功能是介导胆汁盐依赖性的胆汁流动，能将各种一价胆汁酸如牛磺胆酸和初级胆汁酸如鹅去氧胆酸等从肝细胞转运到毛细胆管中。BSEP基因缺陷可导致多种临床疾病的发生，如妊娠肝内胆汁淤积病、胆囊胆固醇结石和Ⅱ型家族性肝内胆汁淤积症等。多种核受体/核转录因子参与了MRP3和BSEP基因的转录和/或转录后水平的调控。多个药物如利福平、熊去氧胆酸(ursodeoxycholicacid，UDCA)和苯巴比妥等可作为核受体的配体直接激活核受体或者与核受体的配体结合间接调控核受体的表达。研究表明，核转录因子SP1(specificityprotein1transcriptionfactor，SP1)及核受体孕烷X受体(pregnaneXreceptor，PXR)、CYP7A启动子结合因子(CYP7Apromoter-bindingfactor，CPF)均与MRP3的表达上调有关。而BSEP的表达调控与RXRα密切相关，RXRα不仅可直接作为BSEP的配体上调BSEP的表达，也可与其他核受体形成异二聚体，间接起作用。如FXR可诱导BSEP表达，RXRα可作为配体与FXR形成异二聚体，催化FXR对BSEP的调控作用，显著提高FXR对BSEP的刺激效用，提高FXR的工作效率。目前临床上可有效治疗淤胆的药物十分有限，熊去氧胆酸虽被广泛使用，但也存在疗效个体差异大、总体疗效不理想、副作用较大等缺点。因此，现今急需解决的问题是寻求一种更有效、更安全的治疗胆汁淤积的药物。川西獐牙菜(swertiamussitiifranch)是生长于高原地区的珍贵中药，系獐牙菜属，龙胆科植物。藏医里常常单方治疗肝脏和胆囊疾病，临床上多可用于治疗急、慢性黄疸性肝炎，但其作用机制还不十分明确。本研究的重点是川西獐牙菜能否调控细胞膜转运蛋白MRP3和BSEP的表达，且何种核受体参与其调控，从而探讨其对治疗胆汁淤积的效果和机制。本实验通过川西獐牙菜醇提物体外刺激HepG2细胞，观测其对MRP3和BSEP在mRNA和蛋白水平的影响，并观测核转录因子SP1和核受体CPF、PXR、RXRα的变化状况。目的是为治疗胆汁淤积的临床用药提供理论依据。研究方法：1.不同终浓度的川西獐牙菜醇提物体外刺激HepG2细胞，运用MTT法检测不同浓度药物对HepG2细胞生存率影响。目的是寻找对HepG2细胞生长、增殖影响最小的浓度，即为最佳作用浓度。2.选用最佳浓度川西獐牙菜醇提物于不同时间点(0h、12h、24h、48h、72h)体外刺激HepG2细胞，同时设立DMSO处理组为阴性对照，UDCA处理组为阳性对照组。RT-PCR检测在不同时间点HepG2细胞膜转运蛋白MRP3、BSEP，核转录因子SP1及核受体PXR、CPF、RXRαmRNA表达的变化情况；Westernblot检测不同时间点HepG2细胞内膜转运蛋白MRP3、BSEP、核转录因子SP1及核受体PXR、CPF、RXRα蛋白表达的变化情况。结果：1.MTT实验结果表明，浓度为25～50uM的川西獐牙菜醇提物对细胞生长增殖无明显影响。2.RT-PCR结果显示：同DMSO组相比，药物刺激后HepG2细胞膜转运蛋白MRP3mRNA水平表达增高，但对BSEP作用不明显，可能是通过转录后调节起作用，同时上调相关核受体PXR、CPF、RXRαmRNA的表达(P<0.05)。3.Westernblot结果表明：与阴性对照组相比，药物处理组可明显促进膜转运蛋白MRP3、BSEP及相关核受体PXR、CPF、RXRα蛋白的表达(P<0.05)。其中，对MRP3、BSEP蛋白水平的上调作用均强于UDCA处理组(P<0.05)。结论：1．川西獐牙菜醇提物可刺激HepG2细胞膜转运蛋白MRP3mRNA和蛋白水平的表达，且其表达增高可能与核转录因子SP1及核受体