茶树吸收累积四种重金属离子的耐抗特性及超微定位表征

茶树吸收累积四种重金属离子的耐抗特性及超微定位表征茶叶质量安全是当前茶学研究的热点课题,而茶叶重金属离子含量过高或“超标”成为影响质量安全的重要危害因素之一。在茶叶重金属污染已有相关研究中,多数从应用技术层面查找其成因、分析其来源、调查茶园环境背景值；部分从应用基础层面进行了茶树的吸收累积状况、茶叶含量水平及其影响因素等研究；本论文从理论层面将树体累积量和分布率的状况与树体相关生理特征开展关联研究,系统研究了茶树吸收铅、铜、铬和镉等四种重金属离子在树体器官中累积、分配与分布的规律特性,评价茶树的耐受、抵抗特性,并从亚细胞水平开展超微定位表征,深入探讨茶树逆境生理与解毒生化机制。本课题研究工作直接涉及茶叶质量安全,并为“源头消除”和“全程管控”等技术领域提供基础理论依据,属于相关研究领域中的重要应用基础课题。本研究首先使用原子吸收光度法系统检测茶树体器官、组织中重金属离子的累积含量和分布率；在此基础上,采用水培茶树系统试验,研究重金属离子的耐受、抵抗特性；进一步运用密度梯度离心、冷冻超薄切片、透射电镜-X射线能谱(TEM-EDS)和扫描电镜-X射线能谱(SEM-EDS)等先进手段,研究铅在茶树组织、细胞及亚细胞中的超微定位与表征；探索运用基因表达谱差异技术(DDRT-PCR),探讨茶树耐重金属抗性机制及其逆境防御的分子机制。主要取得以下研究成果：1.研究表明,田间栽培茶树新梢中铅、铜有向生长旺盛的幼嫩新梢中累积趋势；而铬、镉有向生长稳定的成熟新梢中累积的趋势。茶树幼嫩新梢(1芽2、3叶)中4种重金属离子累积量分别为2.72±0.42mg/kg(rPb=0.97**)、12.04±0.58mg/kg(rCu=0.84**)、0.23±0.01mg/kg(rCr=0.97**)和0.29±0.02mg/kg(rCd=0.97**);随着茶叶生长期、采摘嫩度、季节和品种不同,茶树重金属离子累积量会随之明显变化或显著差异,这将为控制茶叶重金属残留提供有效技术路径。2.不同茶树器官对土壤中不同重金属离子的累积能力具有显著差异性,树体器官的累积量变幅分别为：3.93～16.45%(Pb)、5.23～13.09%(Cu)、0.37～25.17%(Cr)和1.58～33.01%(Cd)；树体中的重金属离子能在各器官之间发生一定程度的转移、再分配,这是由各器官累积量的相关性所反映的,具体关系是：叶片与全株(rPb=0.71**、rCu=0.93**、rCr=0.61*)、与侧根(rCu=0.79**、rCr=0.79**)、与主根(rCr=-0.66*)的累积量显著正相关,主根与侧根(rcu=0.61*)铜累积量间显著正相关。树体各器官对土壤重金属离子的富集系数顺序为根>叶>茎,变幅为0.13～1.42(Pb)、0.18～3.07(Cu)、0.08～1.59(Cr)和0.32～3.59(Cd)。研究认为,茶树重金属累积量以蓄积能力较强的吸收根最高,其次是以贮存为主的侧根、老叶、成熟叶等较高,以转运功能为主的主干及骨干枝的重金属累积量相对较低。3.茶树主要从土壤中吸收重金属离子,各器官累积量与土壤中全(有效)量之间相关性为：生产枝铜累积量与土壤有效铜含量(r-O.78**)、侧根铜累积量与土壤有效态铜含量(r=0.69**),镉累积量与土壤有效态镉含量全株(r=O.67**)、叶片(r=O.62**)、生产枝(r=0.57**)。研究认为,茶树主要吸收利用土壤中有效态重金属,土壤酸碱度降低利于铅、铜和铬离子的释放及活度提高,相反会使镉离子的钝化及活度降低。4.水培茶树树体各吸收铅、铜、铬和镉累积与分布存在各自特性,不同器官累积量随浓度而变化的四种典型相关模型：Hill模型、线性模型、Gaussian模型和Boltzmann模型；水培茶树根系吸收94.31%(Pb)、74.21%(Cu)、70.11%(Cr)和85.89%(Cd),主要累积在根部,叶片分布率约为0.57%(Pb)、24.20%(Cu)、1.03%(Cr)和3.01%(Cd)；而水培茶树叶片吸收时其在叶片中的分布率27.27%(Pb)、31.98%(Cu)、82.98%(Cr)、41.31%(Cd),根部分布率21.59%(Pb)、17.22%(Cu)、2.36%(Cr)、13.54%(Cd)。表明茶树器官中重金属离子累积主要分布于吸收器官内,只有部分向其它树体器官转移、分配与分布。5.水培茶树吸收累积铅、铜、铬、镉,35d树体表观未受害临界浓度值差异很大,分别为：Pb2+400mg/L、Cu2+200mg/L、Cr3+20mg/L、Cd2+2mg/L,这是由培养浓度和时间共同决定的相对值。且该浓度条件下,叶片SOD、POD和CAT活性上升,表明茶树抗氧化酶活性被诱导增强,对重金属表现出一定适应、耐抗性；当Pb2+≥800mg/L、Cu2+≥400mg/L、Cr3+≥30mg/L、Cd2+≥3mg/L,水培35d,树体表现出不同程度的受害症状,叶片的POD和CAT酶相对活性下降,MDA含量和CMP升高；受重金属离子危害叶片细胞膜脂质过氧化程度改变,可能对细胞膜结构和功能造成部分损伤,表现为叶片的光合作用受到一定抑制,导致叶片净光合速率下降58.01%(Pb)、32.92%(Cu)、54.09%%(Cr)、58.72%(Cd)。6.研究表明,各亚细胞组分铅累积分布差异性与其结构功能及组成成分有关。根、茎和叶的亚细胞组分中分布率高低为：细胞壁及残渣(70.43%)>可溶物及细胞膜(17.93%)≈细胞器(14.26%)>细胞核(1.37%)。研究表明,细胞壁复杂结构和成分组成有较强滤阻沉积作用,其中累积分布最多；而细胞核为生命信息载体核糖核酸存在的主要部位,受到保护,其中累积分布最少。7.研究认为,茶树组织累积铅受其组织结构功能影响而产生区镉化分布。结果表明：根中铅累积量为木质部(15.78%)>表皮(12.44%)>皮层(3.51%)；叶中为韧皮部(25.82%)>形成层(18.08%)>上下表皮(16.59%)>木质部(12.76%)>栅栏组织(11.21%)>海绵组织(5.43%)。8.研究认为,SEM-EDS和TEM-EDS能够有效对亚细胞内铅分布精准定位表征,本研究构建了茶树亚细胞内重金属元素的超微表征,研究等级具有方法创新性。定位结果表明,茶树吸收根中铅主要分布于细胞壁、质膜和液泡膜；茎中铅主要分布于细胞壁、叶绿体、质膜、液泡膜上；但累积量明显降低；叶中铅主要分布在质膜和细胞质中,而细胞壁及其他部位则基本没有观察到铅的颗粒,含量很少。9.对铅水培茶树叶片中蛋白质总量与游离氨基酸组分比较,推测认为游离氨基酸组分的含量增减各异与氮代谢改变有关。低浓度的铅可以促进茶树体内氨基酸和蛋白质的合成以增强耐受力；超过一定浓度时会