出血性卒中致脑组织纤维化机制实验与临床研究

出血性卒中致脑组织纤维化机制实验与临床研究研究背景、目的及意义转化生长因子-β₁（Transforminggrowthfactorbeta1，TGF-β₁）是近十年来发现的参与机体许多生理病理过程、启动和终止组织损伤修复的一种主要细胞因子。人体组织器官纤维化的病理基础是胶原的合成和沉积，TGF-β₁通过刺激胶原基因过度表达及其自分泌调控等多种机制在纤维化病变过程中发挥关键作用。大量周围组织损伤研究表明，正常低水平表达的TGF-β₁出现过度表达，可导致细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）过度产生与沉积而成为许多慢性疾病如肾小球硬化、肝纤维化、肺纤维化、硬皮病等疾病的致病因子。近年来TGF-β₁过度表达在中枢神经系统（centralneuralsystem，CNS）损伤后的炎性反应、组织纤维增生及胶质瘢痕形成中的重要作用也逐渐受到关注，尤其是蛛网膜下腔出血后并发交通性脑积水者。交通性脑积水发生机制依然不明，除了先天性与原因不明外，大多并发于蛛网膜下腔出血（subarachnoidhemorrhage，SAH）与CNS感染。出血及炎性变使脑膜广泛纤维化粘连致脑脊液回吸收受阻、蛛网膜粒变性致脑脊液回静脉通路受阻是较为认可的病理机制，但脑膜纤维化发生机制及脑脊液循环与重吸收途径至今不甚明了。Maillot等提出了脑脊液引流的上行途径（颅蛛网膜下腔途径）、淋巴途径和静脉途径，后两条途径虽无确切的形态学证据，但是注入到椎管内的药物很快以高浓度出现在静脉系统的事实，提示从脑脊液到静脉系统之间有直捷通道存在。脑脊液无论经何种途径吸收，蛛网膜下腔脑膜组织都是脑脊液与静脉系统间建立循环与重吸收的基础结构组织。目前，对其生理及病理学改变仍存有许多未知，尤其是在遭受出血及炎症侵袭时脑膜纤维化病理改变发生机制不明。随着周围组织纤维化机制的不断深入研究，以TGF-β₁为主要细胞因子参与的组织损伤与修复的一系列信号转导机制被不断认识，TGF-β₁在中枢神经系统疾病中的作用也开始被人们所关注。已发现在脑出血、SAH、脑缺血与缺氧等疾病中，TGF-β₁有明显异常表达，有报道重组TGF-β₁鞘内注射及转基因大鼠均发生脑脊液引流障碍，表明该因子在脑积水形成中的重要作用。胶质疤痕是CNS受损或病理过程的普遍性结果，其致密屏障可阻碍神经轴突再生及功能重建。随着神经干细胞移植的深入研究，许多问题亟待解决，神经细胞的再生阻碍也渐为人所关注。星形胶质细胞（astrocyte，As）是组成胶质疤痕的主要胶质细胞成分，在遭受损伤后，可产生各种生长因子及细胞调节因子，包括TGF-β₁。因TGF-β₁的生理功能多样，直接抑制会导致许多负面效应，而结缔组织生长因子（connectivetissuegrowthfactor，CTGF）是介导TGF-β₁促纤维化作用的一个重要的下游因子，生物学效应单一，直接抑制它的表达也许可以避免在TGF-β₁上游阻断带来的副作用。因此，CTGF可能作为神经干细胞移植治疗CNS疾病中抑制胶质增生负性作用的靶点。凝血酶是血肿成分中最特殊的物质，随着不同凝血酶受体相继发现，凝血酶被当作一种细胞外信号分子，具有广泛的细胞生物学效应，凝血酶对神经细胞的保护与毒性双重作用与出血量密切相关而在出血性脑损伤中倍受关注。用小剂量凝血酶（1～2u／ml）预处理可明显保护神经元和胶质细胞免受低血糖、缺血缺氧等损伤引起的细胞死亡；较高浓度的凝血酶可使神经元的轴突和树突退变，轴突回缩、细胞聚集，胶质细胞星形化受阻，并破坏细胞间的相互作用以及和毛细血管间的联系；而微克分子浓度的凝血酶便可导致体外培养的神经元和胶质细胞程序性死亡；加入水蛭素（hirudin）、蛋白酶连素-1等凝血酶特异性抑制物时，这些效应会逆转。在周围组织研究发现，凝血酶和TGF-β₁共同介导对SMalphA基因的表达增加，造成人成纤维母细胞过度分化，刺激肾近曲小管上皮细胞分泌和产生金属蛋白酶，促进Ⅳ型胶原合成，而在中枢组织方面的相关性研究未见报道。探讨凝血酶在出血性脑血管病中与TGF-β₁的相关性，研究在中枢组织损伤修复中的作用，并在此层面进行有效抑制，不仅为防治SAH后交通性脑积水找到有效的作用靶点，也可能成为治疗脑细胞水肿、炎性改变、胶质瘢痕形成共同的作用靶点。周围组织有研究表明细胞因子TGF-β₁在皮肤增生性瘢痕形成中起到相当重要的作用，它可增加胶原基因的转录及胶原合成，而糖皮质激素可通过多种途径抑制胶原的转录、合成。但有关糖皮质激素作用的确切分子生物学机制及与TGF-β₁之间的相互关系仍不明确。Ghahary等以胶原基因的调控序列为研究对象，在转录水平探讨地塞米松与TGF-β₁之间的相互作用及对人a1（Ⅰ）前胶原基因启动活性的影响。实验显示：在正常成纤维细胞中，TGF-β₁能明显上调Ⅰ胶原基因的启动活性，而地塞米松则能显著抑制Ⅰ胶原基因的启动活性，提示它们能在转录水平调控Ⅰ胶原基因的转录，这与它们在胶原基因mRNA水平的作用相一致。同时，地塞米松能拮抗TGF-β₁对人a1（Ⅰ）前胶原基因启动活性的上调作用，在转录水平进一步证实了Meisler的研究。由此可见，在转录水平地塞米松抗纤维化作用不仅表现为能直接抑制胶原基因的启动转录，而且能拮抗TGF-β₁的致纤维化作用。广泛纤维化、胶质增生是CNS损伤的标志，研究TGF-β₁在神经系统疾病中的异常表达机制，探讨CNS组织损伤后纤维化修复机制。利用RT-PCR、Western-blotting、RNA干扰、转染等分子生物学技术，研究TGF-β₁、凝血酶等对大鼠星形细胞形态学变化、软脑膜纤维化、星形细胞的CTGF表达和胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）表达等；提出凝血酶可能作为启动因子参与TGF-β₁的过度表达，可能由TGF-β₁诱导，CTGF介导星形细胞反应性胶质化理论；揭示组织纤维化机制，偿试解决神经损伤修复过程中的再生阻碍及组织纤维化粘连中的关键问题，为防治中枢组织粘连性疾病如交通性脑积水（communicatinghydrocephalus）等寻找新思路，为促进神经干细胞移植轴突的再生修复、抑制胶质胶质瘢痕的负性作用、最大限度地保存和恢复神经功能寻找有效的干预位点。目的1．研究凝血酶与TGF-β₁过度表达的相关性，探讨SAH后交通性脑积水的发生机制。2．研究TGF-β₁对培养的新生SD大鼠星形细胞胶质化及CTGF表达的影响。采用体外培养的大鼠星形胶质细胞，以TGF-β₁为刺激因子，建立脑损伤的细胞模型，观察星形胶质细胞形态学变化，以及该细胞骨架蛋白胶质纤维酸性蛋白（GFAP）与CTGF基因翻译水平和蛋白质合成水平的变化，探讨CNS损伤后反应性胶质化的发生机制。3．研究SAH后脑室扩大的影像学改变，探讨地塞米松蛛网膜下腔炎性抑制对交通性脑积水发生的预防作用。方法1．选用体重200g～300g雄性Wistar大鼠，随机分组，实验组21只，对照组15只。采用经枕骨大孔蛛网膜下腔注药法。实验组大鼠用10％水合氯醛（3ml／kg）腹腔麻醉，取侧卧头低体位，经枕骨大孔穿刺成功抽出0.2ml脑脊液后，将大鼠凝血酶（3u，0.3ml）注入蛛网膜下腔。完成后拔针，按压穿刺点3min并保持头低位30min，后放入鼠笼观察。对照组大鼠用0.3ml生理盐水替代大鼠凝血酶以相同方法注入蛛网膜下腔。按照注入药物后的时间点1d，10d和20d，实验组和对照组各又随机分为3组。各组大鼠到达相应时间后再次麻醉，分别留取各大鼠脑脊液200μl，即刻以2000r／min离心20min，取上清液置于-60℃冰箱保存待测。然后即刻打开胸腔，经左心室至升主动脉插管，剪开右心耳引流，用生理盐水冲洗至引流液清亮，以4％多聚甲醛液（4℃，pH7.4）缓慢灌注固定约30min，取脑浸入4％多聚甲醛固定液中，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，每份标本经额、顶、枕部作冠状切片，切片厚度5μm。采用Masson’s三重染色后封固。将组织于40×10倍光学显微镜下观察，并用计算机显微图像采集分析系统进行分析测量软脑膜平均厚度。使用大鼠转化生长因子定量ELISA试剂盒，按使用说明测定脑脊液TGF-β₁浓度。2．体外培养大鼠星形细胞：参照McCarthy的培养方法并加以改良，多次差速粘附处理及传代，传三代，进行GFAP免疫荧光染色鉴定细胞。用不同浓度TGF-β₁孵育培养As24h，倒置相差显微镜下观察As形态，半定量RT-PCR测GFAPmRNA的相对表达量，Western-blotting进行GFAP蛋白定量，观察TGF-β₁诱导As反应性胶质化。对不同浓度TGF-β₁孵育培养的反应性胶质化As，半定量RT-PCR测CTGFmRNA的相对表达量，Western-blotting进行CTGF蛋白定量，在转录和翻译水平研究TGF-β₁对星形胶质细胞CTGF表达的影响。3．按急性期CT显示蛛网膜下腔的出血量参照Hijdra方法评分，选取积分为4分以上的SAH患者，常规治疗组（对照组）和常规治疗加地塞米松鞘内注射组（治疗组），分别于病程的初期和20d后在头颅CT上行脑室各值测量，包括哈（Huckman）氏值、三脑室宽度、侧脑室体宽度和最大颅内横径，并计算前角指数和侧脑室体宽指数。4．采用SPSS13.0软件包进行统计分析。各组数据以（?）±s表示，采用析因方差分析，实验组、对照组内各个时间点之间的比较采用单向方差分析，各时间点内两组间比较用独立样本t检验；脑脊液TGF-β₁浓度（pg／ml）与软脑膜平均厚度（μm）两项指标间采用线性相关分析；不同浓度TGF-β₁致GFAPmRNA、CTGFmRNA及蛋白表达量变化采用单因素方差分析，组间采用LSD法多重比较；影像学资料分析组内病程前后对比采用独立样本t检验，组间病程前后对比采用配对样本t检验。检验水准a=0.05。结果1．大鼠脑脊液TGF-β₁浓度值检测结果经析因方差分析显示，脑脊液TGF-β₁浓度值实验组和对照组差异有显著性（F=60.743，P=0.000）；不同时间之间差异无显著性（F=0.128，P=0.881）；组别同时间两因素无交互作用（F=1.223，P=0.309），即两组随时间变化趋势差异不显著。实验组1d、10d、20d三个时间点组所测脑脊液TGF-β₁浓度分别是239.02±129.40、309.07±57.30、283.16±128.87（pg／ml），与各相应时间点对照组相比，分别经两独立样本t检验，显示差异均有显著性意义（P均＜0.05），实验组均高于对照组。各组内不同时间之间比较，经onewayANOVA分析，对照组内脑脊液TGF-β₁浓度随时间变化有差异，经LSD法组间多重比较，第1d组高于第10d和第20d组。可能为穿刺损伤，血液破入蛛网膜下腔，血小板释放TGF-β₁所致，如图1所示，而实验组内脑脊液TGF-β₁呈持续高浓度（表1）。2．大鼠软脑膜平均厚度值测定结果经析因方差分析显示，软脑膜平均厚度值实验组和对照组差异有显著性（F=32.178，P=0.000）：不同时间之间差异有显著性（F=9.763，P=0.001）；组别同时间两因素有交互作用（F=6.798，P=0.004），即两组随时间变化趋势是不同的。实验组软脑膜平均厚度值在1d、10d、20d三个时间点组所测值分别为3.68±0.43、4.29±0.52、5.67±0.77（μm），与各相应时间点对照组相比，分别经两独立样本t检验，除了1d外（t=0.564，P=0.585），其他两个时间点，两组间差异均有显著性意义（P均＜0.001），实验组均高于对照组（表2）。各组内不同时间之间比较，经onewayANOVA分析，显示软脑膜平均厚度值实验组内不同时间之间有显著差异（F=20.858，P=0.000）；经过LSD法组间多重比较，20d组高于1d组和10d组。如图1-2所示，10d组、20d组软脑膜平均厚度值的增加随时间延长逐渐明显。3．经Spearman相关分析显示脑脊液TGF-β₁浓度和软脑膜平均厚度呈现正相关关系（r_s=0.541，P=0.001）。4．经过处理培养的细胞传三代，进行GFAP