丙泊酚及其代谢物的死后分布和死后再分布研究

丙泊酚及其代谢物的死后分布和死后再分布研究目的:1.建立生物样品中丙泊酚及其代谢物的高效液相色谱-串联质谱和气相色谱-串联质谱检测方法;2.建立丙泊酚及其代谢物的死后分布和死后再分布研究动物模型;3.研究丙泊酚及其代谢物在实验动物体内的死后分布和死后再分布规律,为涉及丙泊酚麻醉相关案件的法医学鉴定提供实验依据。方法:1.样品处理:丙泊酚和4-羟基-丙泊酚利用气相色谱-串联质谱进行定性、定量检测,葡萄糖醛酸丙泊酚利用高效液相色谱-串联质谱进行定性、定量检测。待检生物样品匀浆后添加内标百里酚,经环己烷萃取后水浴中氮气流下吹干,色谱甲醇复溶后使用气相色谱-串联质谱检测丙泊酚;待检生物样品匀浆,经乙腈萃取后水浴中氮气流下吹干,残渣中分别加入吡啶和MSTFA,严密封口后置于50℃水浴30min,待降至室温后,反应液使用气相色谱-串联质谱检测4-羟基-丙泊酚衍生化产物;待检生物样品匀浆,经乙腈萃取后水浴中氮气流下吹干,色谱甲醇复溶后使用高效液相色谱-串联质谱检测葡萄糖醛酸丙泊酚。以上化合物均采用MRM模式扫描,利用保留时间、定性离子对比例定性,丙泊酚采用内标工作曲线法定量,葡萄糖醛酸丙泊酚和4-羟基-丙泊酚采用外标工作曲线法定量。2.动物模型:丙泊酚及其代谢物的死后分布研究动物模型:雄性SD大鼠,分别以临床治疗极量（6.3×2mg/kg）和LD₅₀剂量（42mg/kg）经尾静脉注射丙泊酚,观察记录注射后表现,LD₅₀剂量组大鼠待其死亡后迅速解剖,临床治疗极量组大鼠于LD₅₀剂量组大鼠平均死亡时间处死解剖,取心血、心脏、肝脏、肺脏、肺脏、肾脏、大脑、肌肉、睾丸置于-20℃保存待检。丙泊酚及其代谢物的死后再分布研究动物模型:巴马小型猪,以临床治疗极量经颈静脉插管注射丙泊酚（1.1×2mg/kg）后处死,迅速解剖取材,分别于死后不同时间（6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h）取心血、周围血、心肌、肝脏、肺脏、肾脏、大脑、肌肉置于-20℃保存待检。3.统计学分析:生物样品中目标物质含量以均数±标准差（x?±s）表示,使用SPSS进行正态性分布和方差齐性检验。各组织脏器内目标物质含量用Graphpadprism6.0进行分析,P<0.05时,认为各组物质含量间具有统计学差异。结果:1.生物样品中丙泊酚及其代谢物的检测方法血液和肝脏中丙泊酚的最低检测限为2ng/mL或ng/g,最低定量限为8ng/mL或ng/g,线性范围为0.0625μg/mL或μg/g-10μg/mL或μg/g;4-羟基-丙泊酚的最低检测限为1ng/mL或ng/g,最低定量限分别为4ng/mL或ng/g,线性范围为0.0625μg/mL或μg/g-10μg/mL或μg/g;葡萄糖醛酸丙泊酚的最低检测限为0.25ng/mL和0.5ng/g,最低定量限分别为1ng/mL和2ng/g,线性范围为0.03125μg/mL或μg/g-5μg/mL或μg/g。回归方程相关系数R²均大于0.99;日内精密度为1.74%-9.14%,日间精密度在2.17%-9.11%,回收率为92.11%-109.4%。2.丙泊酚及其代谢物在大鼠体内的死后分布规律LD₅₀剂量丙泊酚经尾静脉注射染毒致死大鼠体内丙泊酚含量由高到低为:血液>心脏>大脑>肾脏>肝脏>肺脏>肌肉>睾丸>脾脏;4-羟基-丙泊酚含量由高到低为:肺脏>肾脏>肝脏>心脏>血液>脾脏>睾丸>肌肉>大脑;葡萄糖醛酸丙泊酚含量由高到低为:肝脏>肾脏>血液>睾丸>肺脏>脾脏>心脏>肌肉>大脑。临床治疗极量丙泊酚经尾静脉注射染毒大鼠体内丙泊酚含量由高到低为:肝脏>肾脏>大脑>心脏>睾丸>肺脏>肌肉>血液>脾脏;4-羟基-丙泊酚含量由高到低为:肾脏>肺脏>血液>肌肉>睾丸>肝脏>心脏>脾脏>大脑;葡萄糖醛酸丙泊酚含量由高到低为:肝脏>肺脏>肾脏>睾丸>血液>脾脏>心脏>肌肉>大脑。不同剂量给药后丙泊酚在大鼠体内的死后分布规律存在剂量依赖性,代谢物的死后分布规律无剂量依赖性。3.丙泊酚及其代谢物在巴马小型猪体内的死后再分布规律在常温、4℃和-20℃保存条件下,临床治疗极量注射丙泊酚后,丙泊酚及其代谢物在巴马小型猪尸体内均会发生死后再分布现象。在不同保存条件下,死后再分布的规律不完全相同:常温保存条件下,心血中丙泊酚浓度在死亡6h有明显下降,之后浓度随死亡时间保持稳定,变化不显著;肌肉和大脑中4-羟基-丙泊酚浓度随死亡时间变化不显著;心脏和肌肉中葡萄糖醛酸丙泊酚浓度随死亡时间变化不显著;4℃保存条件下,心血中丙泊酚浓度随死亡时间保持稳定,变化不显著;肌肉和大脑中4-羟基-丙泊酚浓度随死亡时间变化不显著;心脏和肌肉中葡萄糖醛酸丙泊酚浓度随死亡时间变化不显著。-20℃保存条件下,心血中丙泊酚浓度随死亡时间相对稳定,变化不显著;心血中4-羟基-丙泊酚浓度随死亡时间变化不显著;心脏和肌肉中葡萄糖醛酸丙泊酚浓度随死亡时间变化不显著。结论:1.本研究建立了生物样品中丙泊酚及其代谢物的高效液相色谱-串联质谱及气相色谱-串联质谱检测方法,可应用于涉及丙泊酚麻醉相关案件的法医学鉴定和法医毒物动力学研究。2.本研究建立了丙泊酚及其代谢物的死后分布和死后再分布研究动物模型,可应用于涉及丙泊酚麻醉相关案件的法医学鉴定和法医毒物动力学研究。3.LD₅₀剂量和临床治疗极量丙泊酚经大鼠尾静脉注射后,大鼠体内各组织中均检出丙泊酚、4-羟基-丙泊酚和葡萄糖醛酸丙泊酚,丙泊酚及其代谢物在体内分布不均匀,丙泊酚的死后分布规律存在剂量差异,代谢物的死后分布规律无剂量差异。4.在常温、4℃和-20℃保存条