分子生物学课件

原核生物基因表达的调控8.1乳糖操纵元lactoseoperon8.2色氨酸操纵元8.3基因转录的时序调控8.4小分子RNA的翻译调节8.1.1DiscoveryofOperon

1961年,F.Jacob&J.Monod提出,此后不断完善。获1965年诺贝尔生理学和医学奖1940年，Monod发现：细菌在含葡萄糖和乳糖的培养基上生长时，细菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源转变期，细菌的生长会出现停顿。即产生“二次生长曲线”。文献：细胞中存在两种酶，即组成酶与诱导酶1947年，报告：“酶的适应现象及其在细胞分化中的意义”FrancisJacob

JacquesMonod

8.1乳糖操纵元1951年，Monod与Jacob合作，发现两对基因：Z基因：与合成β-半乳糖苷酶有关；I基因：决定细胞对诱导物的反应。Szilard：I基因决定阻遏物的合成，当阻遏物存在时，酶无法合成，只有有诱导物存在，才能去掉该阻遏物。

Jacob：结构基因旁有开关基因（操纵基因），阻遏物通过与开关基因的结合，控制结构基因的表达。乙酰基转移酶半乳糖苷透性酶ß-半乳糖苷酶操作位点乳糖操纵元结构调节基因操纵元是一种完整的具有特定功能的细菌基因表达和调节的单位，包括调节基因，操纵位点，结构基因，组成一个控制单元结构基因：产生mRNA,合成蛋白质操纵位点promotor,operator：启动子结合位点调节基因：产生调节蛋白（与操纵位点结合）→结构基因不转录诱导物存在时，可与阻遏蛋白结合→结构基因转录ControlelementStructuralgenes8.1.2酶的诱导现象B-半乳糖苷酶分解底物的酶只有在底物存在时才出现！无乳糖时，几个B-gal/cell

加入乳糖时，5000个再去掉乳糖，lacmRNA下降

乳糖能激发lacmRNA的合成

乳糖的诱导作用是由酶前体转化而来，还是诱导新酶合成？培养基（35S-aa,无乳糖）→E.coli繁殖→培养基（无35S-aa,加入乳糖）→β-gal(无35S)8.1.3调控机理1调控区结构lacI,1045bp，独立PiP,82bp，－82～＋1O,35bp，－7～＋28lacZYA体外结合竞争实验:

阻遏物＋RNApol,off

RNApol＋阻遏物，on2.阻遏状态3诱导状态诱导物诱导作用：在可诱导的操纵元中，加入对基因表达有调节作用的小分子后，开启基因的转录活性4诱导物不是乳糖生成lac诱导物乳糖代谢Allolctose异构乳糖别乳糖细胞内β-半乳糖苷酶来源?gratuitousinducer

安慰诱导物

义务诱导物可诱导半乳糖苷酶产生，但不是其底物IPTG，异丙基半乳糖苷TMG，巯甲基半乳糖苷ONPG,O-硝基半乳糖苷在研究诱导作用时，很少使用乳糖8.1.4阻遏蛋白的作用机制1阻遏蛋白结构38KD，4聚体，一个亚基结合一个IPTG分子lacI

组成型转录

Pi弱启动子，

5－10个／cell具有二重性阻止转录（与lacO结合）开始转录（与诱导物结合）

阻遏蛋白的结构域

头段，-NH2端，lacO结合区绞链区

核心段，-COOH，诱导物结合区4个亚基的核心片段接触形成四聚体

对称轴，+11对称序列，6bp

阻遏蛋白的结合位点－－lacO的结构3阻遏蛋白对RNApol功能的影响阻遏蛋白和RNApol可同时与DNA结合

RNApol与启动子结合的平衡常数1.9X107

有阻遏蛋白时,2.5X109结合着的RNApol不能转录.但加入诱导物后,释放出阻遏蛋白,变为开放型启动子复合物.阻遏蛋白实际上使RNApol贮存在启动子上。这一模式是否存在于其它操纵元系统中？+glucose-glucoseTime(hr)Unitsof-galactosidase+lactoseGlucoseadded8.1.5lacoperon的正调控

1代谢物阻遏效应实验，在lac＋Glu培养基上

E.coli只利用G，只有G

耗尽时，才会利用lac葡萄糖抑制lacmRNA的转录：

可阻止诱导物引起的阻遏物失活效应仅去掉阻遏物并不能启动lac基因表达,有其它因素参与葡萄糖对lac操纵元表达的抑制是间接的

葡萄糖的降解是通过cAMP与CAP结合起作用的

cAMP:环化腺苷酸CAP,cataboliteactivatorprotein

由crp编码CRP,catabolitereceptorprotein2CAP结合位点CAP为二聚体，45KD，被cAMP激活结合位点～22bpI-70~-50II-50~-40由于序列的差异，使不同基因受cAMP激活的水平不同结合位点序列保守3CAP的结合对DNA构型的影响DNA弯曲弯曲点位于CAP结合位点二重对称的中心弯曲使CAP能与启动子上的RNApol接触（1）CAP结合位点与转录起始点的位置CAP与转录起始点的距离，相距数个整双螺旋CAP结合位点在启动子的上下游，都能发挥作用4

CAP对转录的影响（2）基因转录对cAMP—CAP系统的依赖性，

与启动子本身的效率有关cAMP-CAP复合物的结合，使位点II附近的富含GC区域双螺旋结构稳定性降低，因而-10区的熔解温度降低，促进开放型启动子复合物的形成（3）CAP激活转录的方式CAP直接作用于RNApola亚基缺失RNApola亚基的—C末端时，失去受CAP激活的能力作用于DNA，改变其结构8.1.6lacoperon的其它问题lacoperon的功能是在正负两个调控体系的协调作用(coordinateregulation)下实现的。阻遏蛋白封闭转录时，CAP不发挥作用；如没有CAP加强转录，即使阻遏蛋白从P上解聚仍无转录活性CAP组成型合成，所以cAMP－CAP复合物取决于cAMP含量腺苷酸环化酶位于细胞膜上，其活性与葡萄糖运输的酶有关，因此cAMP－CAP调控乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等糖类代谢有关的酶降解物敏感型操纵元：只要有葡萄糖存在，这些操纵元就不表达

2.A基因及其生理功能编码B-半乳糖苷乙酰基转移酶，使半乳糖苷乙酰化。该酶不参与乳糖代谢！生理意义：在细胞中有许多能被半乳糖苷酶降解的半乳糖苷类物质，其分解产物不能进一步代谢，积累，抑制细胞生长。半乳糖苷乙酰化后，即无毒.所以lacA虽不在乳糖降解中起作用，但可抑制有害物质的积累3.lac基因产物数量，1：0.5：0.2

不同酶的数量差异,是由于在翻译水平上的调节.方式有二:核糖体脱离:多顺反子的差别性翻译

内切酶作用:在lacmRNA分子内部，a基因比z基因更易受内切酶作用SummarySummaryoflacoperonregulationGlucosecAMPLactoseTranscriptionoflacmRNAHighLowPresentlowrateofexpressionHighLowAbsentessentiallynoneLowHighAbsentessentiallynoneLowHighPresenthighrateofexpression8.2Trpoperon生物细胞中的氨基酸合成，也受操纵元的调节。细胞需要某种氨基酸时，其基因即表达，不需要时基因关闭，达到经济的原则。trpR,阻遏蛋白P，-40~+18O,-21~+1L,+1~+162结构基因t,A下游36bp,不依赖pt’,t下游250bp，依赖p8.2.1基因组成sne2988.2.2Trpoperon的阻遏系统1TrpR四聚体阻遏蛋白＋trp

→

有活性的阻遏物SNE299＋trpO→不转录2阻遏蛋白的结合位点

trpO-21~+1，反向重复序列trpP-40~+18活性阻遏物与trpO的结合与RNApol与启动子的结合发生竞争SNE2993阻遏系统主管转录是否启动，在缺乏Trp时，mRNA起始合成，但不能自动延伸，一般在trpE之前终止转录

粗调开关8.2.3弱化作用

attenuation1弱化子，衰减子，α前导RNA，140bpα弱化子，衰减子，α序列分析发现，其中4个片段进行配对，形成不同的二级结构Terminator

S312POE4321LDNARNAATGTGA2trpcodons14322前导肽14aa3转录弱化作用LackoftrpLackofaminoacyltRNARibosomepauseattrpcodons,occludingsequence1Form2:3hairpinanti-terminator

TranscriptionintotrpEandbeyondHightrpTrpisinsertedatthetrpcodonsTranslatetotheendofleadermessageRibosomeoccludesequence2Terminatetranscriptionat(3:4formterminator)弱化子对转录调控的关键空间结构，10thand11thcodonsencodetrpresidues(rareAA)时间，核糖体停顿在2个Trp密码子上时，产生延宕，此时4区未转录出来Theleaderpeptideistodeterminertrpavailabilityandtoregulatetranscriptiontermination14–amino-acid(encodedby27-68oftheleaderRNAsummary8.2.4阻遏作用与弱化作用的协调

阻遏效率启动子的转录起始频率在R+和R-相差70倍弱化作用

trp存在时，约有10％的RNApol侥幸转录

-trp

活性阻遏物－－－－→无活性阻遏物

←－－－－

+trptrp操纵子具有双重调节体系？Negative—repressibleoperon可以被最终合成产物所阻遏RPOleadingseq.EDCBAtrp+为什么需要阻遏体系？当大量Trp存在时，阻遏系统起作用。阻遏物与之结合，阻止先导mRNA合成。

经济仅有少量trp时，RNApol启动，但在L.S.处脱落，转录中断RPOleadingseq.EDCBA少量trp+不足以结合

O

位点为什么需要弱化系统？当trp浓度低时，阻遏物从有活性变为无活性，速度极慢，不能很快引发trp合成。因此需要一个能快速作出反应的系统，以保持培养基中适当的Trp水平。8.2.5细菌演化出弱化系统的生物学意义

通过tRNA荷载与否进行调控，更为灵敏氨基酸的主要用途是合成蛋白质，因而tRNA荷载为标准进行调控更为恰当两个调控系统，避免浪费提高效率阻遏系统高水平trp时，不转录低水平trp时，转录至LS

弱化系统细调原核生物细致的精细调控机制增强原核生物对环境的适应性8.2.6正控制系统和负控制系统1负控制系统：在没有调节蛋白质存在时基因表达，加入调节蛋白后基因表达活性被关闭阻遏蛋白：负控制系统中的调节蛋白Addsignalmol.

OperonoffCo-repressor辅阻遏物Addsignalmol.

OperononInducer诱导物(inducibleoperon)(repressibleoperon)2正控制系统：没有调节蛋白质存在时基因关闭,加入这种调节蛋白质后基因活性被开启诱导蛋白8.3基因转录的时序调控概念：原核生物在生长发育的各个阶段，基因的表达是按照一定时间顺序进行的意义有效利用能源避免不适当的表达，造成的危害途径

亚基的更换（枯草杆菌，E.coli，T4phage）

T7噬菌体生长过程中RNApol的替代噬菌体基因表达的调控

亚基的更换8.3.1枯草杆菌噬菌体SPO1早中晚基因表达的转换SPO1，烈性噬菌体如何实现早中晚基因表达的转换?通过更换亚基，使SPO1的早中晚基因有条不紊地表达

因子的负责识别启动子的保守序列，是转录起始唯一需要的因子。许多细菌能生产多种可取代的因子，以识别不同的启动子。当细胞从基本的转录机制转入各种特定基因表达时，需要不同的因子指导RNA聚合酶与各种启动子结合早期，

2

‘55，产生gp28gp28

取代

55中期，gp28取代55产生gp33,gp34晚期,gp33,gp34取代

gp28，

55枯草杆菌中每个

因子都能识别具有特征性的一致序列的一组启动子调节蛋白质相互取代的原因，可能是它们与核心酶的亲和力所决定的8.3.2E.coli热休克基因的表达热激反应（热休克，热震惊）正常情况下，

70

高温下，

32

，32kDrpoH

识别热休克基因的启动子70S304不同热休克基因识别的启动子序列不同Q:70，热激反应中不需要，但大量表达！?从E.coli到人类，都有热休克基因不同种属中，热激蛋白的氨基酸序列高度相关A:70中含有

Phs(热休克启动子),能在高温下表达为恢复正常秩序作准备.Phs70大多数热休克基因，在细菌适应较高温度后，停止表达。如大肠杆菌，42度20分钟后,开始表达常规基因8.4小分子RNA的翻译调节8.4.1干扰mRNA的互补RNAmRNA－interferingcomplementaryRNA1983年，Mizuno,Simon几乎同时发现RNA可作为调节因子，与调节蛋白一样，RNA合成后，可扩散到靶位点。RNA也可作为调节物质？！反义RNA，可与mRNA结合结合位点是S-D,AUG,部分N端密码子与RNA形成双螺旋结构，作为内切酶底物与转录产物结合，使转录提前终止例，Ecoli中外膜蛋白ompF的表达调控λ噬菌体，cII蛋白抑制晚期基因转录Tn10中转座酶翻译的调节8.4.2Ecoli中ompF

基因的翻译调节Env，编码渗透压感受器的受体蛋白ompC低渗时，ompC关闭，ompF增加高渗时，ompC增加，ompF下降ompC与ompF是外膜蛋白，受培养基渗透压的调节RNAi技术1998年2月，AndrewFire等将单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。将这一现象称为RNA干扰1984年，抗病毒药物的开发1988年,转基因番茄（PG酶的反义RNA）延缓成熟的转基因西红柿ACC，1-氨基丙环烷羧酸氧化酶，乙烯合成途径酶类PG，半乳糖醛酸酶第一个上市的转基因植物思考题概念：操纵元、诱导物、阻遏物、降解物敏感型操纵元、弱化子、正控制、负控制、RNAi请说明乳糖和色氨酸操纵元的调节机制葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌优先利用哪一种糖，为什么？

DNA的结构

第一节遗传物质的本质第二节核酸的化学组成第三节DNA的二级结构第四节DNA的物理化学性质第五节超螺旋和拓扑异构第一节遗传物质的本质

1、遗传物质必须具有的特性a、贮存并表达遗传信息b、能把信息传递给子代c、物理和化学性质稳定d、具有遗传变化的能力DNA的特征

各异的碱基序列储存大量的遗传信息

碱基互补是其复制、转录表达遗传信息的基础

生理状态下物理、化学性质稳定

有突变和修复能力，可稳定遗传是生物进化的基础1kbDNA序列41000

种遗传信息一、DNA携带两类不同的遗传信息2、DNA携带两种遗传信息a、编码蛋白质和RNA的信息(编码tRNA、rRNA)64个三联体密码子三个终止密码子编码氨基酸的61个密码子由简并性、通用性b、编码基因选择性表达的信息

*

原核生物的结构基因占Genome的比例很大

Φx174phage5386bp结构基因用去5169bp

比例达96％*真核生物的结构基因占Genome的比例很小

哺乳动物中结构基因只占10％～15％其余80％以上的DNA起什么作用目前还无法精确解释，但可以肯定其中大部分DNA序列是编码基因选择性表达的遗传信息

表现在：细胞周期的不同时相中个体发育不同阶段不同的器官和组织不同的外界环境下各种基因的表达与否以及量的差异

所以又称－－调控序列二、RNA也可作为遗传物质

*RNA病毒传染媒介是病毒颗粒（病毒基因组RNA、蛋白质外壳）

TobaccoMosaicVirus(TMV)

*类病毒（viroid）:使高等植物产生疾病的传染性因子只由RNA组成三、是否存在核酸以外的遗传物质Prion(proteinaccousinfectionsparticle)引起的风波朊病毒－－－蛋白质样的感染因子羊搔痒病(scripie)Prion

复制?转录?翻译?

人类库鲁（

kuru）病牛海绵状脑炎(疯牛病)…

均由传染性病原蛋白颗粒引起统称Prion(朊病毒)

上节课内容回顾:

基因概念的演变:五种关于遗传的认识

基因概念的发展:顺反子理论操纵元理论

经典的基因概念:

第二章内容DNA携带的两类遗传信息DNA以外的遗传物质:RNA

蛋白质??第二节核酸的化学组成嘧啶Pyrimidines嘌呤Purines

一、含氮碱基、核苷、核苷酸☉碱基NitrogenousbasesUracil(U)☉核苷（nucleotide）糖苷键Glycosidicbond嘧啶的1位N原子、嘌呤的9位N原子核糖是戊糖RNA－核糖核苷

DNA－脱氧核糖核苷1’9☉核苷酸（nucleotideacid）核苷的磷酸酯脱氧核糖核苷酸核糖核苷酸Deoxynucleotides

其中α和β、β和γ之间是高能磷酸键αβγdNTPRibonucleotides核糖核苷三磷酸缩写为NTP

二、DNA分子的一级结构

(DNAsequence)1、多聚核苷酸链

主链是核糖和磷酸侧链为碱基由3’,5’磷酸二酯键连接2、链的方向：同一个磷酸基的3’酯键到5’酯键的方向

(5’→3’)5’-UCAGGCUA-3’=UCAGGCUA

默认书写顺序5‘→3’3’5’3、DNA一级结构的特点a、脱氧核糖是其显著特点－－－－DNA极其稳定的根本原因DNA在高pH值时磷酸酯键非常稳定只是碱基存在构像的变化变化酮式烯醇式酮式烯醇式RNA在高pH时则稳定性很差OH自由的5’-OH2’,3’-环式单核苷酸碱由于2‘－OH导致的水解b、磷酸呈四面体构型，脱氧核糖呈折叠的五元环，碱基是平面的C、主链是亲水的，侧链（碱基）是疏水的

主链的脱氧核糖的羟基能与水形成氢键，而磷酸基团在生理条件下离解为负离子

这些特点保证了多核苷酸链可形成稳定的构象4、一级结构的概念指DNA分子中的核苷酸排列顺序

不同生物借此贮存遗传信息决定DNA的二级结构和高级结构第二节DNA的二级结构

一、DNA双螺旋模型的提出（doublehelixmodel）

*

依据a、1938.W.T.Astbury首次用X－射线分析DNAb、1950ChargaffA+G/T+C=1A+T≠G+Cc、1952AlexanderTodd

发现了核苷酸和核苷酸之间由磷酸二酯键联接d、1952M.H.F.Wilkins&RosalindFranklin

得到了高度定向的DNA纤维的X-射线照片发现原子长轴存在0.34和3.4nm两种周期性

此外，之前的密度测定表明螺旋由两条多核苷酸链组成，且直径恒定（2nm)。*

提出1953.Watsosn&Crick

右手B-DNADoublehelixModel

每一单链具有

5‘3’极性两条单链极性相反反向平行两条单链间以氢键连接以中心为轴，向右盘旋（直径2nm）双螺旋中存在

大，小沟

*

双螺旋的主链PhosphodiesterBackboneC-GT-A

碱基互补·直径20Å

*双螺旋模型参数·螺距为34Å（任一条链绕轴一周所升降的距离）·每圈有10个核苷酸（碱基）·有大沟和小沟配对碱基并不充满双螺旋空间，且碱基对占据的空间不对称

·两个碱基之间的垂直距离是3.4Å。螺旋转角是36度Pitch34ÅRise3.4ÅWidth20ÅMajorGrooveMinorGroove10.4bp/turnTwist36°◘大、小沟的差异⊕大沟中碱基差异容易识别，往往是蛋白质因子结合特异DAN序列的位点⊕小沟相对体现的信息较少二、影响双螺旋结构稳定性的因素

l

氢键

(Hydrogenbond4~6kc/mol)

消除DNA单链上磷酸基团间的静电斥力

弱键,可加热解链氢键堆积,有序排列(线性,方向)

l

磷酸酯键(phosphoesterbond80~90kc/mol)l

0.2mol/LNa+

生理盐条件

强键,需酶促解链

*维持稳定性的因素l

碱基堆积力(非特异性结合力)

(1kc/mol—0.6kc/mol)×n

☆

范德华力（Vandewaalsforce）

(1.7A°/嘌呤环与嘧啶环作用半径)(0.34nm/碱基对间距)3.4A°☆疏水作用力(Hydrophobicinteraction)

不溶于水的非极性分子在水中相互联合,成串结合的趋势力.

即熵值(Entrophy)ΔS上升-----热力学上的稳定态成为碱基间的部分堆积力

(磷酸骨架,氨基,酮基周围水分子间的有序排列

)非极性分子间（嘌呤和嘧啶碱基）的相互成串结合熵值上升(ΔSgoingup)

l

磷酸基团间的静电斥力

碱基内能增加(温度),使氢键因碱基排列有序状态的破坏而减弱

*不稳定因素三、双螺旋结构的基本形式

·B-DNA资料来自相对湿度为92％所得到的DNA钠盐纤维·

此外人们还发现了A、C、D、E等右手双螺旋和左手双螺旋

Z构象等形式DNA结构的多态性：几种不同的DNA双螺旋结构以及同一种双螺旋结构内参数存在差异的现象原因：多核苷酸链的骨架含有许多可转动的单键磷酸二酯键的两个P-O键、糖苷键、戊糖环各个键戊糖的构象ADNABDNAABZHandednessBaseInclinationABZ大沟宽小沟窄小沟窄大沟变深小沟宽深大沟不存在小沟窄而深1、反向重复序列与二级结构

反向重复序列（invertedrepeatitivesequenceorinvertedrepeatsIR）又称回文序列（廻文）：指两段同样的核苷酸序列同时存在于一个分子中，但具有相反的方向有时也有不完全相同的情况RNA和DNA中都可能存在

此外还可有directedrepeatitivesequence---正向重复序列四、一些DNA序列的不寻常结构C反向重复序列间间隔较短或无间隔反向重复序列间间隔较长

上节课内容回顾:1、碱基、核苷、核苷酸的化学组成2、核酸的一级结构书写方向3、Watson＆Crick的DoubleHelixModel

参数大小沟二级结构的多态性4、影响二级结构的作用力：稳定因素不稳定因素5、DNA序列的不寻常结构：反向重复序列

*较短的回文序列可能是作为一种信号如：限制性内切酶的识别位点一些调控蛋白的识别位点2、三螺旋DNA(TribleHelixDNA,T.SDNA)

例如限制性内切酶EcoRⅠ的识别位点

5‘－－GAATTC－－3’3‘－－CTTAAG－－5’

（1）发现和证实

1953年Watson&CrickD.SDNAmodel

证明沿大沟存在多余的氢键给体与受体潜在的专一与DNA(蛋白质)

结合的能力形成T.SDNA可能性

这些发现促进了三螺旋DNA的研究

（2）形成条件

¤

第二股中间链必须是嘌呤链

¤

第三股链至少长于八个核苷酸

1957Felsenfeld等发现一股为嘌呤，另一股为嘧啶的核苷酸双链能够形成三链如：polyA/polyUpolydA/polydTpolyd(AG)/polyd(CT)

1987年Mirkin.S.M

证明plasmidDNA在pH=4.3的溶液中,

有T.SDNA的存在

三螺旋DNA的概念提出PolyT/A

TTTTTTTTTTT

AAAAAAAAAA

PolyT/A

TTTTTTTTTTT

AAAAAAAAAATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAa、D.S.DNA+D.S.DNAT.S.

DNA+

S.S.

DNA

（3）组成形式三链螺旋双链螺旋

双链DNA的同源回文序列形成的三链DNA（镜向重复）Mirkin(1987)pGG332plasmidDNA

b、

分子组成

☆

PY/PU+PU(偏碱性介质中稳定)G＊G、A＊A、

G＊A＋

☆PY/PU+PY(偏酸性介质中稳定)常见类型

G＊C＋

A＊T第三条链位于B-DNA的

Majorgroove中H-DNA

两种异构体

T.S.DNA的连接键

Watsonbonding

A＝TG≡C(D.S.DNA)H+Hoogsteen氢键G＝C+(质子化)(第三链,pH小于7)三股螺旋DNA结构特点总结第三条单链DNA分子位于B-DNA大沟内

与B-DNA以Hoogsteen键连接AT,GC两氢键配对，C必需质子化

poly(Py):(Pu):(Py)为常见类型TriblehelixMajorgroovePy:Pu:Py3ed*可能功能可能与基因调控区域的功能和染色体重组有关3、四股螺旋DNA

(tetraplexDNA,TetrableHelixDNA)

发现

1958.

Poly(G)X-rayphotograph

碱基形成环状氢键连接结构TetrableHelixDNA

均有形成四股螺旋DNA的可能

5’---TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’3’---AATCCCAATCCC-5’

Poly(G),4(dG)

染色体端粒高度重复的DNA序列

着丝点附近的高度重复序列

形成条件－－串联重复的鸟苷酸

已有实验结果表明－－真核细胞端粒中存在四链结构

结构特点碱基之间靠Hoogsteen键连接GGGG基本结构单元－－鸟嘌呤四联体可能的功能

A、稳定真核生物染色体结构

B、保证DNA末端准确复制

C、与DNA分子的组装有关

D、与染色体的meiosis&mitosis有关

HoogsteenBonding

5’-----TTAGGGTTAGGGTTAGGGT

3’-----AATCCCAATCCC

GGG

TA

第四节DNA的物理、化学性质一、DNA分子的变性

DNA双股链的互补是其结构和功能上的一个基本特征，也是DNA研究中一些实验技术的基础

变性（denaturation或融解melting）：DNA双螺旋区的氢键断裂，使双螺旋的两条链完全分开变成单链，这一链分离的过程叫做变性1、条件：加热,极端pH,有机溶剂（尿素、酰胺)，低盐浓度等

2、变性过程的表现

¤

是一个爆发式的协同过程，变性作用发生在一个很窄的温度范围

¤

导致一些理化性质发生剧烈变化※熔液黏度降低

※沉降速度加大

※浮力密度上升

※此外吸收值升高（A260nm），即增色效应指在DNA变性的过程中，他在260nm的吸收值先是缓慢上升，达到某一温度时及骤然上升

天然DNA和变性DNA的吸收值相差可达34％D.SDNAA260=1.0S.SDNAA260=1.37dNTPsA260=1.60

当浓度为50μg/ml时：1.1851.01.37OD℃

Tm=

℃ofCt=C0/2

=OD增加值的中点温度(一般为85-95℃)或DNA双螺旋结构失去一半时的温度3、熔解曲线与Tm值

缓慢而均匀地增加DNA

溶液的温度（现可做到

0.1℃／分）可根据各点的A260值绘制成DNA

的熔解曲线

这也是一般PCR实验技术中把变性温度定为94℃的原因1、影响Tm值的因素

（1）在A,T,C,G随机分布的情况下，决定于GC含量（2）GC%含量相同的情况下GC%愈高→Tm值愈大GC%愈低→Tm值愈小

AT形成变性核心，变性加快，Tm值小

碱基排列对Tm值具有明显影响5`GC3`CGn＞＞5`CG3`GCn5`TA3`ATn＜＜5`AT3`TAn36.7℃57.02℃

Tm136.12℃72.55℃

※

嘌呤嘧啶的排列顺序对双螺旋结构（稳定性）的影响

即－－氢键数目相同，但相邻碱基的堆积力不同

从嘌呤到嘧啶方向的碱基堆积力作用显著地大于同样组成的嘧啶到嘌呤方向的碱基堆积作用Pyrimidine-PurineStepsHaveLittleBaseStacking5’3’3’5’CGAT5’CA3’3’GT5’Purine-PyrimidineStepsHaveExtensiveBaseStacking5’3’3’CATG5’5’AC3’3’TG5’

生物体内仅UAA为最有效的终止密码子

因为：UAAAUU

的Tm值是最低的一个，即使生理温度下也不稳定（3）大片段D.SDNA分子之间比较片段长短对Tm值的影响较小,与组成和排列相关（4）小于100bp的D.SDNA分子比较片段愈短，变性愈快，Tm值愈小（5）变性液中含有尿素，甲酰胺等尿素，甲酰胺与碱基间形成氢键改变碱基对间的氢键

Tm值可降至40℃左右

（6）盐浓度的影响

思考题：室温下蒸馏水中的DNA会如何？pH~12酮基→烯醇基pH~2-3NH2→NH2+(质子化)

改变氢键的形成与结合力（7）极端pH条件的影响一切减弱氢键，碱基堆积力的因素均将使Tm

值降低2、常用的变性方法☆热变性☆碱变性应用广泛，特别是用于变性动力学研究缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链pH11.3时，全部氢键被淘汰无热变性的缺点，为制备单链DNA的首选方法

◎保存单链DNA的条件

保持pH大于11.3

盐浓度低于0.01mol/LD.SDNAS.SDNADenaturation▲▼Renaturation

复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞

(DependsonthecollisionofcomplementaryS.S.DNA)

二、DNA分子的复性（annealorrenaturation）

概念：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又可以重新地合成双螺旋结构的过程（退火）

1、影响DNA复性过程的因素：

阳离子浓度0.18~0.2MNa+

可消除polydNt间的静电斥力

复性反应的温度低于Tm值25℃左右(60-65℃)

S.S,DNA的初始浓度C0

DNA分子中,dNt的排列状况(随机排列,重复排列)

S.S.DNA分子的长度（片段的大小）S.S.DNA愈长S.S.DNA愈短→分子扩散愈慢→复性愈慢→分子扩散愈快→复性愈快3’-ATCTATGCTGTCAT-5’5‘-TAGATACGACAGTA-3’5‘-TAGATACGACAGTA-3’3’-ATCTATGCTGTCAT-5’3’-ATATATATATAT-5’5‘-TATATATATATA-3’3’-ATATATATATAT-5’5‘-TATATATATATA-3’5‘-TATATATATATA-3’3’-ATATATATATAT-5’3’-ATATATATATAT-5’5‘-TATATATATATA-3’2、复性动力学的研究方法

Hydroxyapatitecolumn

羟基磷灰石柱LowCofPHighCofPabsorbD.S.DNAreleaseD.S.DNA三、C0t曲线－－复性发生过程的讨论

遵循二级反应动力学dCt/dt=-KC02

反应初始t=0

单链DNA的随机碰撞过程（randomlycollision

）单链DNA浓度=C0反应达t时单链DNA浓度=CtK＝复性速度常数dCt/dt=-KC02积分Ct/C0=1/(1+KC0t)当Ct/C0=1/2

时Ct/C0=1/2=1/(1+KC0t(1/2))K=1/Cot(1/2)Cot(1/2)

=1/K(mol.Sec/L)

常数

Ct/C0是C0t的函数按此公式作图得C0t曲线C0t(1/2)值对DNA具有特征性，其中与DNA的碱基对数目成反相关在控制反应条件相同的前提下,两种DNA分子的C0t(1/2)值,

取决于dNt的排列复杂性

(复性动力学的复杂性,Kineticcomplexity,K.CX)AAAAAAAAK.C.=1C0t(1/2)=2×10-6ATCGATCGATCGK.C.=4K.C.=5×105C0t(1/2)=1Ct/C0

0101C0t(1/2)C0t(1/2)

Fractionreassociated因此－－

*

C0t曲线提供了一种测定DNA分子量的方法

*同时也能解释单一来源的DNA所具有的不同复杂性部分复杂性P74图－16

上节课内容回顾:1、DNA的不寻常结构：三螺旋DNA

四链DNA2、第四节DNA的物理化学性质变性：溶解曲线Tm影响因素（GC、化学试剂、盐、pH）复性C0t曲线C0t（1／2）Ct/C0

0101C0t(1/2)C0t(1/2)

Fractionreassociated纵坐标1－Ct／Co四、杂交（hybridization）概念：不同来源的两个互补核酸序列通过相互退火形成双螺旋结构的反应DNA与RNADNA与DNA杂交分子DNA／RNADNA／DNA※用途检测DNA的缺失、插入，考察不同生物种类在进化中的关系其中不连续基因的发现就是通过mRNA与DNA杂交试验而发现的※杂交形式固相杂交（滤膜）液相杂交※检测方法电子显微镜观察放射性自显影＊固相分子杂交（1975E.M.Southern）

五、富含A－T序列和DNA双螺旋结构的呼吸作用●

高等生物染色体的某一区段，A·T含量变化很大

很多有重要调节功能的的DNA区段都富含A·T

（原核、真核－－复制起点、启动子、终止子等区域）●

DNA双螺旋结构的呼吸作用：DNA双螺旋结构内部，配对碱基的氢键的迅速断裂和再生的过程这已通过甲醛变性试验得到证实1.01.45A260小时24

*甲醛只能和自由氨基起反应含4％甲醛的DNA溶液的变性图（T为25℃）

*并且甲醛能使DNA发生不可逆变性

甲醛要与全部的氨基反应需要相当长的时间●

DNA内富含A·T区段呼吸作用尤为明显

这对于某些特殊的蛋白质与DNA发生反应并阅读链内部的信息具有重要作用第五节超螺旋和拓扑异构一、超螺旋（superhelixORsupercoil）●

最早在SV40和多瘤病毒中发现●

超螺旋是所有线性或环形DNA的共有的重要特征ThesupercoilsoftheSV40minichromosomecanberelaxedtogenerateacircularstructure,whoselossofhistonesthengeneratessupercoilsinthefreeDNA.1、超螺旋结构的方向性B-DNA紧缠overwinding(右旋)

正超螺旋（positivesupercoiled）导致左手超螺旋以一根绳子做实验：原来的绳子的两股以右旋方向缠绕；在绳子的一端向紧缠方向捻转，再将绳子的两端连接起来，则产生一个左旋的超螺旋以解除外加捻转的协变B-DNA松缠unwinding(左旋)

负超螺旋（NegativeSupercoiled

）导致右手超螺旋在绳子的一端向松缠方向捻转，再将绳子的两端连接起来，则产生一个右旋的超螺旋以解除外加捻转的协变

超螺旋的形成总是要向着抵消初级螺旋改变的方向发展所有生物的DNA几乎有5%为NegativeSuperhelix

二、超螺旋状态的描述1、可用数学公式描述Vinograd方程式L=T+W(α=β+γ)？L

连接数（Linkingnumber）

双链DNA的交叉数，不发生链断裂时，L为定值T

盘绕数（Twistingnumber）双链DNA的缠绕数，初级螺旋圈数W超盘绕数（Writhingnumber）直观上为双螺旋在空间的转动数W=负值（negativesuperhelix）W=正值(positivesuperhelix）

420bp*B-DNA是力学上稳定的结构(10bp/helix)*

螺旋数改变的结果之一是产生超螺旋

或是在B_DNA中保留一单链区域，但须能量的功给

＊

DNA在水溶液中,构型偏B型状态＊

DNA以10.5bp/helix为最稳定构型＊

小于10.5bp/helix向正超螺旋发展(紧缩态)＊

大于10.5bp/helix向负超螺旋发展(松弛态)

天然的DNA都是负超螺旋但一些生命活动过程中存在正超螺旋B-DNA的变化情况：basebase3.4埃EB7.0埃basebasebasebase局部DNA的紧缩2、体外可产生正超螺旋

溴化乙锭（EthidiumbromideEB）放线菌素Da、EB的插入只改变盘绕数T－－使其降低但L值不变W＝L－TL值不变T值降低W＝正值产生正超螺旋360o/helix360o-26o/helix/0neofEBinserted负Superhelix

OC,L,DNA

正Superhelix

EB对超螺旋结构的影响三、拓扑异构酶

拓扑异构体：只在连接数上有差别的同种DAN分子称为这种DNA的拓扑异构体

拓扑异构酶（topoisomerase）：催化DNA由一种拓扑异构体转变成另一种拓扑异构体的酶类拓扑异构酶的类别和特性被切割的DNA链1122对ATP的需求否否是是依赖于DNA的ATP酶否否是是产生负超螺旋否否是否松弛负超螺旋是是否是松弛正超螺旋否是是是性质Ⅰ型Ⅱ型原核生物原核生物真核生物真核生物改变超螺旋的方式结合到一条链上形成复合物切断一条链形成酶和蛋白的复合体共价连接Tyrosine-5’P一条链穿越重新连接L=2L=3

1、拓扑异构酶Ⅰ

(topoisomeraseI)

结果：连接数增加一个增加一个负超2、拓扑异构酶Ⅱ

－TopII

旋转酶(gyrase)TopⅡ亚类之一引入负超螺旋作用于双链涉及双链的断裂和连接－－每次使DNA的连接数改变23、拓扑异构酶的生物学功能b、防止细胞DNA的过度超螺旋多种拓扑异构酶的作用严格控制体内负超螺旋维持在5%水平所以－－一种拓扑异构酶的单向突变对细胞来说是致命的因而一般两种拓扑异构酶的突变水平相当a、恢复由一些细胞过程产生的超螺旋如：复制叉前面正超的消除转录酶前正超的消除，后面负超的产生本章内容结束，谢谢！复习题1、名词解释反向重复序列DNA链的呼吸作用Cot曲线DNA变性

DNA的熔解温度DNA复性2、简答题＊DNA是否唯一的遗传物质？＊如何确定DNA一级结构的方向性？＊决定DNA双螺旋结构状态的因素如何？＊B-DNA中出现的大沟、小沟有何差别？＊DNA结构多态性及其产生的原因。＊室温中蒸馏水中的DNA变化如何？为什么？＊三螺旋、四螺旋DNA的形成条件如何？各自的基本结构情况＊说明SV40的CCCDNA分子与EB结合过程中CCC的变化情况＊Ⅰ、Ⅱ型拓扑异构酶的作用方式和结果的情况TopoIReactions

真核基因表达的调控9.1DNA水平的调控9.2染色质水平上的基因活化调节9.3转录水平的调控9.4转录后水平的调控9.5翻译水平调控9.6翻译后水平调控9.7原核与真核基因表达调控差异原核与真核生物基因表达的差异RepeptitivegeneOverlappinggeneSplittinggenenointronPost-transcriptiontranscription&translation

RNAprocessingsynchronizelyEukaryoteProkaryote

DNA+histon→chromatin

NakedDNA回顾enhancer&silencerAttenuatermonocistronpolycistron(operon)m5C

geneofftransfactoracetylationphosphorylationmethylationglucosylationactiveformEukaryoteProkaryote9.1.1基因丢失在细胞分化过程中，通过丢掉某些基因而去除其活性。例如某些原生动物，线虫、昆虫、甲壳类动物，体细胞常丢掉部分或整条染色体，只保留将来分化产生生殖细胞的那套染色体。例如在蛔虫胚胎发育过程中，有27％DNA丢失。在高等动植物中，尚未发现类似现象。许多生物各类不同的细胞或细胞核都具有全能性totipotency9.1DNA水平的调控9.1.2基因扩增

在没有发生细胞分裂，整条染色体几乎没有复制的情况下，细胞内某些特定基因的拷贝数专一性增加的现象9.1.2.1为满足正常的生长发育需要如两栖类和昆虫卵母细胞rRNA基因的扩增:卵母细胞中的rDNA拷贝数比体细胞中增加了4000倍，用于转录合成卵裂期所需要的1012个核糖体。在果蝇滤泡细胞中，编码卵壳蛋白的卵壳基因的扩增9.1.2.2外界环境因素引起基因扩增

基因扩增与肿瘤形成及细胞衰老有关。在原发性的视网膜细胞瘤中，含myc原癌基因的DNA区段扩增10－200倍。许多致癌剂可诱导DNA扩增。9.1.3基因重排特异性调节，发生在特殊的细胞类型中例如：酿酒酵母接合型哺乳动物免疫球蛋白编码区的连接无序的，发生在肿瘤细胞基因组中9.1.3.1酿酒酵母接合型的决定Saccharomycescerevisiae单倍体细胞,aor

接合型不同接合型的细胞可以接合相同接合型的细胞不能接合MATa,MAT接合型可互变a←→

需要HO基因，编码内切酶S3419.1.3.2Cassettemodel匣子模型1接合型互变的匣子模型一个单倍体细胞中同时存在MATa和MAT在同一染色体上，活跃匣子MAT

沉寂匣子HML,HMRS341活跃匣子表达，HML和HMR保持沉默？Sir(silentinformationregulator)，编码阻遏蛋白,其结合位点在HML和HMR启动子上游1500bp以外，在MAT上无结合位点

sir如何控制转录？影响RNA聚合酶的结合通过染色质浓缩，改变基因转录

DNaseI超敏感位点不存在于HML/R上与活跃匣子不同类型的沉寂匣子可以取代活跃匣子，改变接合型3接和型互变

接合型的改变，实际上是DNA序列的代换，依赖于序列同源性与活跃匣子不同类型的沉寂匣子可以取代活跃匣子，改变接合型

匣子WXYZ1Z2totalHML

723704747