分离工程课件

绪论

Part1

化工分离工程及其研究内容分离工程什么是化工分离工程？化工分离工程是化学工程学科的重要组成部分。化工分离工程是研究化工及其它相关过程中物质的分离和纯化方法的一门技术科学。许多天然物质都以混合物的形式存在，要从其中获得具有使用价值的一种或几种产品，必须对混合物进行分离。在许多加工工业中，例如化工、石油化工、炼油、医药、食品、材料、冶金、生化等，必须对中间体和产物进行分离和提纯，才能使加工过程进行下去，并得到符合使用要求的产品。分离过程还是环保工程中用于污染物脱除的一个重要环节。分离工程生产实践是分离工程形成与发展的源泉早期的化学工厂是由化学家根据实验室研究结果直接建立的。通过生产实践发现，生产用的大装置中的化学或物理过程与实验室玻璃器皿中的现象有很大的不同。而在不同产品的生产过程中，却有许多过程遵循相似的原理。由此提出的单元操作原理奠定了化学工程学科最初的理论基础。分离工程即使是在一种产品的生产流程中，也有原理相似的不同操作步骤。分离工程

早在数千年前，人们已利用各种分离方法制作许多人们生活和社会发展中需要的物质。例如，利用日光蒸发海水结晶制盐；农产品的干燥；从矿石中提炼铜、铁、金、银等金属；火药原料硫磺和木炭的制造；从植物中提取药物；酿造葡萄酒时用布袋过滤葡萄汁；制造蒸馏酒等等。这些早期的人类生产活动都是以分散的手工业方式进行的，主要依靠世代相传的经验和技艺，尚未形成科学的体系。

早期人类生产活动中的分离过程分离工程

近代化学工业是伴随着十八世纪开始的工业革命而崛起的。于十九世纪末开始了大规模的发展。当时，三酸二碱和以煤焦油为基础的基本有机化工等都有了一定的规模。在生产中，需要将产品或生产过程的中间体从混合物中分离出来，才可供使用。例如，当时著名的索尔维制碱法中，使用了高达二十余米的纯碱碳化塔，在其中同时进行化学吸收、结晶、沉降等分离过程，这是一项了不起的成就。但在当时，这项成就是由化学家在进行化学工艺过程开发的同时完成的，他们并没有意识到他们同时在履行着化学工程师的职责。这时的分离技术是结合在具体的化工生产工艺的开发过程中，单独而分散地发展的。近代化学工业的兴起分离工程

随着大量的工业实践，人们逐渐认识到，各种化工生产工艺，除了其中的核心即反应过程外，大都是由为数不多的一些基本操作组成的。这些基本操作的知识对于化工过程的正确开发和化工流程、装置的正常运行及经济性有重要的作用。在二十世纪初提出的单元操作的概念指出：任何化工生产过程不论规模如何，皆可分解为一系列名为单元操作的过程，例如粉碎、混合、加热、吸收、冷凝、浸取、沉降、结晶、过滤等。单元操作的概念包含了流体动力过程、传热过程、传质分离过程、热力过程、粉体工程等许多化工生产过程中常见的操作和过程，传质分离过程是其重要组成部分。化学工程学科的雏形单元操作和化学工程理论的形成G.E.戴维斯，《化学工程手册》(1901)C.S.鲁宾逊，《精馏原理》(1922)W.K.刘易斯，W.H.麦克亚当斯，《化工原理》（1923）W.K.刘易斯的《化工计算》(1926)T.K.舍伍德的《吸收与萃取》(1937)分离工程

单元操作概念的建立对化学工程的发展起了重大的作用。它对用于不同的化学工艺中的同样的操作，以单元操作的概念抽象出来，对其共同规律进行研究。通过对其基础研究、单元操作所用设备的结构、操作特性、设计计算方法及应用开发等多方面的研究，为分离过程在化工工艺开发、化工过程放大、化工装置设计和在化工生产中的正确应用提供了较为完整的理论体系和经济高效的分离设备，对促进化学工业的发展起到了重要的作用。同时，以此为基础发展起来了以因次分析和相似论为基础的实验研究方法和以数学模型方法为基本的理论结合实际的化学工程研究方法，也对化学工程学本身的发展作出了很大的贡献。分离工程

自二十世纪五十年代以来，通过对化学工程的深入研究，提出了三传一反（动量传递、热量传递、质量传递、化学反应工程）的概念。使分离工程建立在更基本的质量传递的基础上，从界面的分子现象和基本流体力学现象进行分离工程中各单元操作的基础研究，并用定量的数学模型描述分离过程，用于分析已有的分离设备，并用于设计新的过程和设备。由于计算机技术的飞速发展，使得从较基础的理论角度出发对分离过程和设备进行研究成为可能，减少了误差和失真。对一些复杂的数学模型的开发并用于分离过程的优化，使化工过程更趋成熟和完善。

分离操作是怎么实现的？平衡分离过程：根据当体系处于平衡时物质在不同相态（气液、气固、液固等）中浓度不同而实现分离，如蒸馏、吸收、萃取、吸附、结晶等速率分离过程：根据物质分子在外力作用下迁移速率不同而实现分离，如膜分离、电泳等重力和离心分离：根据物体密度不同而实现分离，如重力沉降、旋风分离等机械分离过程：根据物体颗粒大小不同而实现分离，如筛分和过滤等其他分离过程分离工程举例：蒸馏蒸馏是分离液体混合物的主要方法之一。当对液体混合物加热时，其中沸点较低（或挥发度较大）的组分更容易汽化，因此汽相中低沸点组分含量较高，将其冷凝，就得到低沸点组分含量较高的液体，从而实现了高低沸点组分的部分分离。要实现蒸馏分离，必须是部分蒸发，而不能完全蒸干。分离工程高效的蒸馏设备：

带回流的直立多级精馏塔简单的一级蒸馏往往只能实现液体混合物的部分分离。要提高分离的效果，可以多次重复上述部分蒸发－冷凝过程，即采用多级蒸馏。实现多级蒸馏的设备就是精馏塔：带回流的直立多级蒸馏设备。一般来说，只要有足够的级数，就有可能达到所希望的分离效果。分离工程蒸馏技术的应用和发展历史早在二千余年前人们即用蒸馏的方法制酒和芳香油。十四世纪已有较具规模的酒精生产。十八世纪从煤焦油中用蒸馏提取油品。十九世纪中叶第一个石油炼厂投产。早期的蒸馏设备能耗大、分离效果差，十九世纪中叶，人们设计了直立多级、采用回流技术的精馏塔，被认为是蒸馏技术发展中的重大突破。精馏采用回流技术，在塔内实现充分的汽、液两相多级逆流接触传质，能实现混合物的高纯度分离。目前，精馏广泛应用于炼油、化工和石油化工、轻工、食品、空气分离等工业中，是非常重要的分离技术之一。二十世纪以来，化学工业特别是石油化工的迅速发展，在生产规模和分离难度上对蒸馏提出了更高的要求，各种生产能力大、分离效率高、流动阻力低的新型蒸馏设备不断出现，常用的是各种板式塔和填料塔。不同的蒸馏方法也得到了迅速的发展，出现了恒沸精馏、萃取精馏、盐精馏、反应精馏、分子蒸馏、水蒸汽蒸馏等各种复杂蒸馏方法。分离工程一些典型的分离单元操作蒸馏吸收吸附萃取结晶干燥过滤膜分离（透析、反渗透、电渗析、超滤、微滤、纳滤、渗透蒸发、气体膜分离等）新型吸附技术（模拟移动床吸附、扩张床吸附、变压吸附）层析超临界萃取分子蒸馏分离工程Part2

分离工程的发展促进了化学工业等过程工业的进步分离工程

分离过程作为化工生产中的一个不可缺少的环节，在化学工业的发展中起着重要而不可替代的作用。分离技术的发展和不断取得的技术进步不仅促进了化学工业的发展，也促进了其他相关过程工业的发展，提高了生产和技术水平。炼油和石油化工分离工程

炼油和石油化工是现代人类工业文明中最重要的基础加工工业之一。石油炼制工业通过炼油过程把原油加工为汽油、喷气燃料、煤油、柴油、燃料油、润滑油、石油蜡、石油沥青、石油焦和各种石油化工原料等石油产品的工业。为现代人类文明提供了重要的能源和工业原料。石油化学工业以上述原料生产种类极多、范围极广的各种化学品，例如塑料、合成纤维、合成橡胶、合成洗涤剂、溶剂、涂料、农药、染料、医药和各种中间体等重要产品。目前，国际上石油化学工业产品的销售额已占到全部化工产品的45%。在大型石油化工联合企业中，炼油和石油化工过程是紧密结合在一起的。各种分离操作是其生产过程必不可少的组成部分。分离工程

蒸馏是炼油和石化工业的最主要的基本操作过程之一。早期的炼油工业即是简单的利用釜式蒸馏将石油的轻重组分加以分离，以生产汽油、煤油和重质油等产品的过程。现在，原油仍借常压蒸馏及减压蒸馏按沸程不同进行分离。蒸馏技术的发展，例如精馏技术的开发、泡罩塔的应用，提高炼油生产中原油的分离效率，使大规模连续化的分离操作得以实现，明显降低了设备投资、操作能耗和分离成本。二十世纪中叶以来各种生产能力大、分离效率高、流动阻力低的新型塔器的出现，进一步促进了炼油工业的技术进步和发展。在炼油和石化等工业的应用中取得了明显的经济效益，例如，美国在1950～1970年之间，通过对蒸馏设备的改进就创造了近二十亿美元的经济效益；在我国，用网板波纹填料对数百座旧式板式塔进行改造，使分离能力和通量均增加了30～50%。分离工程

除此以外，现代炼油和石化工业中还广泛应用着其它分离单元操作。例如：萃取用于溶剂脱蜡、润滑油精制、溶剂脱沥青和芳烃抽提等。吸附用于分子筛脱蜡、C8芳烃分离、烯烃和烷烃的分离等。冶金和资源工业分离工程

核工业最初是在第二次世界大战期间由于战争的需要而获得超常规的高速发展的。其中，为了提取和纯化铀，对溶剂萃取技术，主要是萃取剂和萃取设备进行了大量的研究。铀是在工业上第一个使用溶剂萃取法提取和纯化的金属元素。在铀的溶剂萃取法提取过程中，使用的萃取剂有磷酸三丁酯（TBP）、TBP-D2EHPA-煤油混合溶剂、胺类萃取剂等。在萃取设备的研究中，开发了各种萃取设备如各种转动塔、脉动塔、振动塔和混合澄清槽等，为萃取过程的工业实现提供了可靠、经济、高效而生产能力大的分离设备。铀、钍、钚等的萃取分离过程和气体扩散法等同位素分离方法的工业实现，为核工业在战后的迅速发展提供了坚实的基础。由此而发展起来的湿法冶炼技术后来成为有色金属和无机矿产的生产的重要方法之一。分离工程

由于矿物资源的贫化，湿法冶炼，即利用酸、碱等水溶液浸取矿物，然后其中的有用组分进行分离或净化，受到了越来越多的重视，其中常用萃取进行分离和提纯。用溶剂萃取从铜矿浸取液中提取铜，是在二十世纪七十年代在湿法冶炼中取得的一项重要成就。一般认为，只要价格相当或超过铜的有色金属，都有可能用溶剂萃取方法进行提取。目前萃取已用于钴、镍、钨、钼、金、稀土等元素的生产过程。湿法提取过程也用于磷和硼等无机矿产的生产过程。例如，磷酸生产通常用热法过程，产品纯度高。但生产中能耗很高，成本高，要求磷矿的品位高。磷酸的湿法生产过程可以处理低品位的磷矿，生产成本低，因而得到了日益广泛的重视。在湿法磷酸净化的萃取法由于提取成本低，净化程度高，而得到广泛的研究和应用。分离技术的发展，使人们可以更有效地利用资源，并生产出品种更多、质量更好、价格更低的产品。湿法冶炼中的矿物浸取和萃取分离过程分离工程医药工业分离技术在保证药物生产及其质量中起着关键作用。合成药物的生产类似于精细化工产品，但质量和卫生要求更严格，各种分离技术在生产中扮演着重要的角色。抗生素等发酵类医药产品的生产中，大量应用着过滤、萃取、吸附、膜分离、离子交换、结晶、干燥等分离技术。在现代基因工程产品的生产过程中，分离成本有时甚至要占到其总生产成本的90％以上，并为此发展了许多新型的高精度分离技术。在天然药物（如中药等）生产现代化过程中，超临界萃取、膜分离、先进的过滤、干燥、结晶等分离技术大有用武之地。分离工程其他食品、乳品和饮料工业环境保护空气分离水处理、海水淡化、纯水制备材料工业分离工程Part3

二十一世纪的化工分离工程：机遇与挑战分离工程

二十世纪下半叶掀起的新技术革命浪潮在人类文明和社会发展上将具有重大的意义。在现代生物技术、环境科学、资源与能源科学、信息技术与材料科学等高新科技的发展对分离工程提出了新的、更高的要求，有许多是传统分离技术所无能为力的，分离工程发展与高新科技的结合是现实的迫切需求，也是分离工程面临的新的机遇和挑战。

现代科学技术的迅速发展向分离工程提出了许多新的课题：现代生物技术产品的商品化在很大程度上取决于能否将具有生物活性的产品从组成复杂的、具有许多性质相似的杂质的稀溶液中经济有效地加以分离纯化；信息工业、生物技术和医药工业、材料工业的飞速发展向分离工程提出了前所未有的纯度要求和分离精度要求；由于石油和天然气资源的逐渐枯竭，能源结构在未来几十年内将面临重大的变化。新能源的发展要求分离工程提供新的、经济有效的大规模分离方法；资源的开发向贫矿的利用转化以及海洋资源的开发利用需要更经济有效的分离技术；环境保护对分离技术提出了持续的、不断提高的需求；为了节约能源、降低设备投资和分离操作成本，对传统分离过程的改造或以新分离方法取代。分离工程现代生物技术产品的分离和纯化分离工程

以重组DNA技术为标志的现代生物技术近三十年来取得了迅猛的发展。作为当代高科技的核心之一，现代生物技术将改变医学、农业、食品、能源、化学、环境保护等领域的传统面貌，促进人类社会生产力和科学技术的巨大进步。现代生物技术的迅速发展对其下游过程，即生物技术产品的分离纯化技术提出了迫切的需求。通过发酵和动、植物细胞培养等生成的目标产物需通过一系列的分离和纯化等步骤才能获得最终的产品。据报道，生物技术产品生产中分离提纯成本一般要占其总成本的40%～90%。可见，分离过程在基因工程产品生产中的重要性。以基因工程产品为代表的现代生物技术产品的分离提纯技术的开发研究是分离技术的前沿研究方向，它有着与传统化工分离技术极为不同的分离对象、系统和特点：分离对象是具有特定的生物活性的生物大分子产品，分离过程设计中不恰当的物理和化学环境等（如温度、pH值、缓冲液选择、有机溶剂、搅拌和剪切力等）皆有可能引起其蛋白质分子结构发生改变，从而使之失活；所需要的目标产物往往存在于含有许多性质十分相似的杂质的稀溶液中，如何从这样一种复杂的稀溶液中经济有效地提取产物是生物分离技术面临的重大课题；从卫生和安全角度出发，对于治疗用基因工程产品，有着极高的纯度和同一性要求，对其中的有害杂质去除率要求极高，对分离设备材质和分离过程中引入的分离介质也有着严格的限制；基因工程中所表达的外源蛋白在宿主细胞（如大肠杆菌）中往往以不溶解的无定形蛋白聚合体即包涵体的形式存在，如何使之分离纯化并按正确的次序和结构复性为具有活性的最终产品是一个全新的分离技术研究领域。分离工程分离工程

通常，生物分离过程包括以下几个处理阶段：（1）培养液（或发酵液）的预处理和固-液分离；（2）产物提取；（3）产物纯化（精制）和（4）成品加工。许多适合于生物技术产品特点的分离技术在近几十年来得到了迅速的发展，例如离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等层析技术；超速离心分离技术；电泳技术、双水相萃取、反胶束萃取等。为生物技术产品的生产提供了适用的分离技术。分离工程

然而，现在的生物分离过程往往相当复杂，步骤很多，造成分离成本高和收率下降。因此，基于经济和大规模高效分离为目标的许多新的生物技术产品组合分离技术，例如亲和膜分离、亲和超滤技术、扩张床技术、高效层析技术等，已受到重视，其中有些已成功地用于生产。可以预见，随着科学技术的发展，现有的生物分离技术将不断完善，新的生物分离技术还将不断涌现，以适应不断增多的生物技术产品的产业化的需要。日益增长的能源需求对分离技术的挑战分离工程

目前，现代人类文明的进步和发展是建立在以化石燃料为主的一次性能源的基础结构上的。然而，地球上的一次性能源资源都是有限的，由于工业生产和人民生活的需要而进行的大规模开采，已经使部分能源资源日趋枯竭，尤其是既作为能源又作为基本化工原料的石油和天然气资源。使能源和资源能持续满足未来发展的需要是放在科研工作者面前的紧迫任务。目前来看，这些任务包括，现有资源的充分利用，贫化资源的开采利用；煤、页岩油等资源的清洁、经济和有效的综合利用；新能源的开发，如太阳能、核聚变、生物能源等。分离工程的进步将对这些领域研究目标的实现和应用起到至关重要的作用。

煤等固体矿物能源资源的清洁利用分离工程

煤和油页岩是除石油以外的储藏量较为丰富的矿物能源和化工原料资源。其使用不如石油方便，且对环境污染更严重。其有效利用及其向液态燃料转化等方面，分离工程面临着许多新的课题。由于资源的分散和含量、组成的复杂和处理过程的环境保护要求，使得对分离过程的开发提出了更高的要求。在用煤合成生产液态燃料的大规模应用中，也面临着许多新的、不同于石油化工的分离问题。分离工程

现已普遍使用的许多化工分离技术如萃取、吸附、离子交换、膜分离等仍是大有用武之地的。对此，一个重要的方向是加强对使用于分离过程的高分离因子、高选择性、高容量、使用寿命长易于再生循环使用的质量分离剂（分离介质）的研究，热力学和化学在其研究中有重要的作用。另外，加强对传质和传递现象、界面现象的研究，自动控制及计算机辅助过程应用于分离工程的研究，对于强化分离过程的分离效果也具有重要的意义。生物能源的利用分离工程

目前使用的化石燃料实际上是亿万年前通过生物转化的太阳能，按目前的消耗量，其储藏终有枯竭之时。从可再生的生物资源中获得液体燃料将是今后能源结构中的重要组成部分。甘蔗等富含糖份和淀粉的植物是将太阳能转化为化学能的理想植物。实际上，通过甘蔗制糖、发酵生产的乙醇，在一些国家已作为汽油的代用品用于汽车燃料。然而要使这种燃料真正具有经济上的竞争力，必须要解决从发酵产生的乙醇稀溶液中经济而低能耗的提取乙醇的分离技术，以降低生产成本和提高净能量产出率。虽然对此的持续研究不断地取得进步，但仍有待于更大的突破。可控核聚变能源的开发应用分离工程

核聚变有可能成为二十一世纪的主要能源之一。可控核聚变将使轻核元素聚变成较重元素过程中释放出的巨大能量可以利用。主要的核聚变燃料是氘和氚。氚由锂和中子反应产生；氘在自然界以重水形式存在，可以从海水中提取得到。据估计海水中共约有200万亿吨重水，由此推算每升海水中含有的核聚变能约相当于300升汽油的化学能。因此可控核聚变如能实现，将成为几乎用之不竭的能源。对此，分离工程面临的任务是：如何以巨大的处理量经济地从海水中提取浓度很低的重水，这需要对高效、高通量、低成本的同位素分离富集方法进行持续的开发研究。环境保护对分离工程提出的挑战分离工程

环境保护是工业化社会中人们面临的严峻问题。过去一百年中，随着工业化进程的发展，人类活动对环境的破坏显著加剧，对人类生存环境的危害越来越大。对于工业生产中排出的废气、废液、废渣等污染物，常用的处理方法是生物降解、化学降解和污染物的分离脱除。分离工程在环境保护中起着重要的作用。由于污染物种类繁多、性质复杂，环保分离技术必须针对这些特点进行开发研究。许多分离单元操作已用于环境保护中，例如吸收用于从工业燃烧废气中脱除二氧化硫；萃取用于从工业废水中脱除酚和其它有害有机物以及重金属离子等；吸附和离子交换用于处理放射性废水；膜分离方法用于处理汽车电泳废水；液膜分离技术用于废水中重金属离子的富集；等等。分离工程

进一步的开发研究还集中在对排放废物的综合利用上。例如对燃烧化石燃料产生的大量二氧化硫、二氧化碳等废气的脱除、回收和综合利用；其中，自工业革命以来，大气中二氧化碳的含量增加了约30％，对地球温室效应的加剧产生了重要影响，是主要的环境污染源之一。同时，二氧化碳也是十分有用的资源。开发其资源化技术，有效降低其排放，是分离工程面临的重大任务。目前已有多种二氧化碳的脱除方法，如吸收法、变压吸附法和膜分离法等，用于各种工业过程中。但这些方法如直接用于环境治理中大量二氧化碳的脱除，还存在处理量小、成本过高等问题。环境治理中脱碳、固碳的问题的解决还有待于更经济有效的分离过程的开发。根除污染物在生产过程中的产生是一种理想的环境保护方法，即所谓的“零排放”生产过程或绿色生产工艺。要做到这一点需要环保研究者、分离工程研究者和各领域的工艺开发研究者共同合作，进行大量的努力。变性与复性

Unfoldingand

Refolding

变性与复性1931年吴宪教授提出蛋白质变性理论。

若溶液中存在变性剂（酸、碱、盐酸胍、尿素、重金属、某些有机试剂等）能引起蛋白质变性。蛋白质变性是因维系其空间结构的次级键被破坏，原有的空间结构解体，蛋白质肽链构型调整以适应新环境。弱变性条件下，蛋白质部分变性，肽链保持一定结型；强变性条件下，蛋白质完全变性肽链伸展成无序随机状态。

变性与复性

变性过程总伴随着蛋白质的物理、化学、生物学性质的变化，如溶解度改变、体积变大、黏度增加、扩散系数降低、生物活性降低或消失等。蛋白质变性时肽链伸展而失去特定的空间结构，这一过程称为肽链的伸展或去折叠。随着这一过程的进行，整个分子也由天然蛋白质紧密的、球状或近球状结构伸展为松散的无一定空间结构的链状分子。许多变性蛋白质在去除变性因素后，可自发地恢复它原来的空间结构和生物活性，这称为变性蛋白质的再折叠或复性。复性有关理论

蛋白质从去折叠状态向折叠状态即天然状态转变的过程中，必须经历一个高自由能的过渡态。

蛋白质复性过程中能量变化示意图复性有关理论

在这个过渡态中蛋白质可有多种构象形式，而天然状态蛋白质可能有一种或有限的几种构象状态存在。蛋白质的再折叠是依据最小能量原则进行的，假设蛋白质的天然构象是能量最小的构象，变性态蛋白质分子会自发的向这个最小能量状态转变。这就是“热力学假说”。该理论认为：蛋白质天然构象形成具有协同性，其能量差别足以区别天然构象和其它构象。大部分蛋白质的天然构象应是能量最小构象。复性有关理论

大量研究还发现，许多蛋白质在体外的变性复性过程并非完全可逆，且体外复性速度远比体内低，多肽链折叠过程中受到许多因素的限制，如S-S键重排和脯氨酰顺反异构等都是折叠反应的限速步骤，实际多肽链在折叠过程受到动力学控制。蛋白质在折叠过程中会有两种途径相互竞争，一种是正确折叠形成天然构象的途径，另一种是错误折叠成稳定的非天然构象的途径。蛋白质多肽链的正确折叠是一些因素在折叠动力学过程中起到控制作用。复性有关理论

“动力学假说”与“热力学假说”并不互相否定，而是互相补充与修正，对不同蛋白质而言，二者在蛋白质多肽链折叠过程中所起的作用大小不同，各有特点。总体上，蛋白质的折叠遵循“热力学假说”，从高能态向低能态转变的过程又受动力学控制。一些小分子单结构域蛋白质的折叠过程相对简单些；热力学控制下能容易地进行可逆的变性、复性；结构比较复杂的蛋白质，特别是涉及S-S键重排，脯氨酰顺反异构限速步骤的折叠反应，总体上受热力学控制，但折叠途径即动力学控制比较重要。复性有关理论

两个理论都认同：蛋白质的折叠是蛋白质自身分子内作用的结果，是由于暴露在溶液中的疏水侧链的疏水作用而互相靠近，形成了具有特定三维空间结构的蛋白质分子。

按拓扑学观点认为：虽然蛋白质内部基团相互作用复杂，使得不同蛋白质的折叠复性过程不相同，但不同蛋白质多肽链穿越空间的形式可能会是相同或类似。实验中也发现，蛋白质拓扑结构的氨基酸序列不改变对蛋白质的折叠速度等参数影响很很少。因此，该理论认为，蛋白质的折叠过程的许多参数及其折叠机理可能与蛋白质的拓扑结构有密切关系。蛋白质结构

蛋白质如何从具有一级结构的肽链形成具有生物功能的三级结构的机制是由DNA到有生物学功能蛋白质之间唯一没有解决的问题。其研究具有重大理论意义，对利用基因工程生产活性蛋白质有重要指导意义。研究蛋白质的溶液构象、折叠途径是揭示新生态肽链折叠过程的基础。蛋白质的较低级的结构是形成更高级结构的基础，而高级结构可能对低级结构有进一步的调整和完善作用。

蛋白质结构

蛋白质的结构层次蛋白质结构

其中，二级结构和折叠中间体的形成直接影响着球状蛋白质的折叠和寡聚体的组装，结构转换和错误折叠往往导致蛋白质的聚合。二级结构转换是指某些蛋白质中的α-螺旋向β-折叠转变，它是改变蛋白质稳定性和聚合的原因。寡聚体组装和蛋白质的聚合遵循不同的分子机理。前者有一定的专一性，后者则是蛋白质分子的随机集合。研究寡聚体蛋白质折叠和装配，能够深入地揭示蛋白质折叠和聚合问题。目前，虽然有关研究取得了很大进展，但对折叠复性还有很多未解之迷。促进与维系蛋白质折叠和天然构象的作用力

蛋白质从伸展的多肽链折叠成特定的天然构象在总体上受到热力学或/和动力学控制。而在折叠的具体过程中是受到各种作用力的综合作用进行折叠。维系蛋白质构象与促进蛋白质折叠的作用力本质上是一致的，二者的区别是前者在维系天然的静态中起作用，而后者在多肽链折叠的动态过程中起作用。总体上看，二者都可分为四种主要类型：疏水相互作用多肽链处于水环境时，其非极性侧链基团为避开极性分子而形成疏水核心，是“疏水折叠”促进与维系蛋白质折叠和天然构象的作用力

过程的主要动力，同时也是维系多肽链折叠状态的主要作用力。另外，全部或部分暴露在水环境中的非极性侧链基团也有明显地疏水相互作用，在多肽折叠的早期中间体中起重要作用。氢键蛋白质内有非常多的氢键，具体某一氢键对蛋白质的构象的贡献很小，但所有的氢键的力量加起来就是一个非常重要的作用，不同氢键对蛋白质构象的影响大小也不同，但，至少在二级结构，如α-螺旋和β-折叠的形成与维系起重要作用。促进与维系蛋白质折叠和天然构象的作用力盐键多肽链上的众多带正负电荷的侧链基团之间或与环境中的正负离子之间的静电作用对蛋白质的稳定性有较大影响，在蛋白质构象形成过程中也起到重要作用。二硫键是侧链基团之间唯一的共价键，对蛋白质天然构象及折叠过程中形成的中间体具有很强的稳定作用，在蛋白质折叠过程中起到关键作用。包涵体

目前用基因工程表达的蛋白质有4000多种，用E.coli表达的占90%以上，在E.coli细胞质内高水平表达的外源蛋白质，尤其是来自真核生物的蛋白质，会形成不溶性聚合物包涵体。

E.coli包涵体

包涵体

包涵体形成原因：使用高计量基因和强启动子；大肠杆菌细胞质环境条件，如pH、离子强度、高还原电位，不同于外源蛋白质正确折叠为最终构象的条件；缺少蛋白质正确折叠的辅助因子。如催化构象互变的折叠酶，脯氨酰基顺/反异构酶，二硫键异构酶，及增强折叠或阻止聚集的分子伴侣等。超表达产生的高浓度新生蛋白质由于多肽链不完全折叠，有利于分子疏水序列之间的相互作用，最终导致这些蛋白质的聚集和错误折叠。包涵体对分离纯化的影响有利方面：蛋白质表达量高；抗剪切和较高温度，对破碎细胞的方法和条件要求低；包涵体密度大，易分离；包涵体的蛋白质纯度较高；后续蛋白质分离纯化较容易。不利方面：需变性复性；活性蛋白质收率低。包涵体的分离破碎细胞，可耐受较高温度和破碎条件；离心沉淀包涵体，离心力较低，除去碎片；洗涤包涵体，包涵体的目的蛋白质含量为80%左右，含有酯类，蛋白，可用含低浓度的变性剂，如尿素、盐酸胍、TritonX-100，脱氧胆酸钠的缓冲液反复洗涤，黏度高时可用DNAse、溶菌酶处理，甚至于可用稀NaOH溶液洗涤，获得较纯的包涵体。包涵体的分离1.用表面活性剂和NaCl

混合物洗两次3.标准蛋白质5.表面活性剂洗两次6.细胞破碎物包涵体的溶解

包涵体的溶解需要打断蛋白质分子内和分子间的共价键（二硫键）、离子键、疏水作用及静电作用等，使多肽链伸展。因此，包涵体的溶解需要强的变性剂，如尿素、盐酸胍或硫氰酸盐，或表面活性剂，如SDS、十六烷基三甲基铵氯化物、肌氨酸、正十二烷基肌氨酸钠等；对于含半胱氨酸的蛋白质，还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫基赤藓糖醇、半胱氨酸、谷胱甘肽等使S-S键断裂。包涵体的溶解

由于金属离子具有催化氧化作用，需加金属离子螯合剂，如EDTA、EGTA。

温度一般25℃~30℃，以促进溶解。也有用70%甲酸溶解包涵体。在细胞周质内形成的包涵体，可采用原位溶解法。即在发酵结束时向培养基中加入变性剂和还原剂，在碱性条件下进行包涵体原位溶解（增加细胞膜的通透性，使包涵体溶解出来），无需采用其它破碎细胞方法，再采用双水相萃取除去细胞碎片，获得包涵体溶解液。

蛋白质的复性

复性简单地说就是脱除变性剂使溶解的包涵体蛋白质的伸展肽链折叠成正确的空间结构。蛋白质的折叠复性过程及聚集体的产生蛋白质的复性

在复性过程中，处于伸展状态的肽链，因暴露在外面的疏水侧链基团之间的相互作用而使这些分子很容易发生聚集反应，形成沉淀，这是大多数蛋白质复性率低的一个主要原因。好的复性方法应能够最大程度的抑制蛋白质的聚集反应，促进蛋白质向折叠成正确的空间结构方向反应。探索高效、方便的蛋白质复性方法对于基因工程产品和理论研究均有重要意义。实践证明，由于蛋白质自身的复杂性和多样性，没有那一种复性方法适用于所有的蛋白质。蛋白质的复性

目前发展的复性方法：稀释复性透析、透滤复性分子伴侣指导复性色谱法复性：凝胶过滤色谱复性、离子交换色谱复性、疏水色谱复性、亲合色谱复性反胶团复性双水相复性蛋白质的复性一个有效、理想的折叠复性方法应具备以下特点：活性蛋白质回收率高；正确复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易放大；复性过程耗时少。就工业应用，要求折叠复性过程要快速、低成本、高效。虽然蛋白质折叠复性方法很多，但就某种蛋白质仍需通过实验确定最佳方法和条件。稀释复性法

这是目前最简单的蛋白质复性方法。将少量的变性蛋白质溶液以一定比例滴加到复性缓冲液中，达到降低变性剂浓度的目的，使处于变性伸展状态的蛋白质分子在溶液中自发地折叠成天然的活性结构。为获得好的复性结果，必须进行复性条件优化。因复性原理不清楚，只能通过实验来确定。一般可采用正交法。影响复性的条件主要有：变性蛋白质溶液组成及浓度、复性缓冲液的组成（离子种类、氧化还原试剂、螯合剂）、离子强度、pH、氧化还原电位、复性温度、稀释倍数、混合方式速度等。稀释复性法正交法优化复性条件稀释复性法变性蛋白质浓度对复性的影响稀释复性法复性缓冲液pH对复性的影响稀释复性法复性温度对蛋白质复性的影响稀释复性法复性时间对蛋白质复性的影响稀释复性法精氨酸浓度对蛋白质复性的影响稀释复性法盐酸胍浓度对复性的影响稀释复性法

不同蛋白质因其结构和变性条件及程度的差异，复性条件和影响因素不同，结果也不同。研究控制复性条件和因素的目的是最大限度抑制聚集反应，促进正确折叠反应，达到最大的复性率。伸展蛋白质分子的聚集反应是两个分子或多个分子之间的反应，在动力学上属于二级以上的反应，而正确折叠反应是单个蛋白质分子的自我组装过程，动力学多属于一级反应。两者相比，聚集反应与蛋白质浓度的关系更大。在低浓度进行复性有利于控制聚集反应。稀释复性法

通常，复性的蛋白质浓度为10~50μg/mL。存在蛋白质浓度低复性率高，蛋白质浓度高复性率低的矛盾。操作方式一次性稀释：操作方式，速度分段稀释：一般采用两步法，先将变性剂浓度降低到一中间浓度，最后再完全除去。连续稀释：变性蛋白质溶液与复性溶液按一定比例连续混合，复性。分段和连续稀释法的复性回收率高于一次性稀释。稀释复性法分段稀释复性时时间间隔对复性率的影响稀释复性法简单稀释和分段稀释复性比较稀释复性法

稀释复性应用于大规模生产的问题：复性缓冲液量大，体积大，设备利用率低；蛋白质浓度低，产物回收困难；稀释复性法是其他复性法的基础。对一个新的包涵体蛋白质复性时，首选的方法是稀释复性法。从中获得的条件和认知可供其它方法参考。蛋白质复性时聚集反应的抑制

复性中最重要的是抑制复性过程的聚集反应。最常用的是使用聚集反应的抑制剂，其原理为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构，降低错误折叠蛋白质的稳定性，增加折叠复性中间体的溶解度，增加非折叠蛋白质的溶解度，减少复性中间体接触发生聚集反应。蛋白质复性时聚集反应的抑制聚集反应抑制剂的种类：可促进蛋白质折叠的小分子添加剂，如盐酸胍或尿素，以及一些离液化合物，如烷基尿素、碳酸酰胺类化合物等。在非变性浓度下，是很有效的促进剂。对于某些需要辅因子才表现活性的蛋白质，辅因子、配基、或底物具有很好促进折叠的作用。

Zn2+

和Cu2+可稳定折叠中间体。浓度为0.5~1.0mol/L的L-精氨酸可大幅度提高折叠效率（使不正确折叠和二硫键不稳定）。蛋白质复性时聚集反应的抑制PEG促进折叠复性，PEG与复性中间体特异形成非聚集的复合物，阻止复性时疏水中间体的聚集，复合物折叠形成第二个中间体，并不再与PEG结合。天然蛋白质即由第二个中间体形成。在有PEG存在下的所有的折叠反应具有相同的速率，复性率与PEG的分子量及浓度相关。认为PEG的作用与分子伴侣的作用机理相似。蛋白质复性时聚集反应的抑制非离子型表面活性剂，尤其是离子型或两性离子表面活性剂。如Chaps、TritonX-100、磷脂、十二烷基麦芽糖苷、磺酸甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用。使用它们的不利是与蛋白质形成胶团，难以去除，影响后续的分离纯化。多离子化合物，如肝素，可促进蛋白质的折叠复性，且有稳定蛋白质天然构型的作用。蛋白质复性时聚集反应的抑制短链醇类、高渗物，如乙醇、甘油等对蛋白质有稳定作用，可有效降低低聚体的形成。如胰岛素生长因子I的复性，除了在复性液中加入Cu2+和Mg2+、2mol尿素、盐类（1mol/LNaCl、DTT）外，还加入乙醇、甘油等。单克隆抗体，待折叠复性的蛋白质的抗体可有效的协助其复性，但只有该蛋白质的特异抗体有效。它可与待折叠复性的蛋白质的远离活性中心的疏水区域结合，有效阻止无活性聚集体的形成。蛋白质复性时聚集反应的抑制分子伴侣和折叠酶，这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白、二硫键异构酶(PDI)、肽酰-脯氨酰顺反异构酶(PPI)、分子伴侣、FK506结合蛋白、Cyclophilin等。分子伴侣和折叠酶不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质折叠复性。由于分子伴侣和折叠酶在蛋白质复性后要除去，且这类蛋白质又十分昂贵，须采用可回收的方法，如固定化方法。人工伴侣，将变性蛋白质首先加到含表面活性剂的溶液中，以防聚集，然后用环糊精除去表面活性剂，促进折叠复性。这称为人工伴侣复性。蛋白质复性时聚集反应的抑制

常用的蛋白质复性添加剂复性添加剂复性蛋白质溶液增熵试剂GdmCl荧光假单孢菌脂肪酶，溶菌酶，碳酸酐酶II，干扰素-β-多肽尿素猪生长激素，溶菌酶，IGF-1，干扰素-β-多肽L-精氨酸荧光假单孢菌脂肪酶，鸡卵清溶菌酶，α-糖苷酶盐类(NH4)2SO4

溶菌酶糖类甘油荧光假单孢菌脂肪酶，溶菌酶，IGF-1蔗糖IGF-1葡萄糖溶菌酶N-乙酰基葡糖胺溶菌酶肌氨酸溶菌酶蛋白质复性时聚集反应的抑制表面活性剂类ChapsTGF-β-类蛋白质，碳酸酐酶IITween人生长激素SDS干扰素-β-多肽月桂酰基肌氨酸钠单链Fv片段十二烷基麦芽糖MHCTritonX-100碳酸酐酶IIPEG碳酸酐酶II十八烯甘油碳酸酐酶II单十二酰基磷酸酯溶菌酶硫代甜菜碱鸡卵清溶菌酶短链醇

正戊醇，正己醇，碳酸酐酶环己醇蛋白质复性时聚集反应的抑制

分子内没有S-S键的蛋白质复性相对比较简单，只需抑制聚集反应，不涉及S-S键的形成。

S-S键的形成需要适当的氧化还原条件，对于稀释复性法，最简单的方法是通入空气，进行氧化形成S-S键，但氧化速度太慢；最常采用的是适当比例的氧化还原对，如GSH/GSSG,形成S-S键，或使错误S-S键重排，促进正确S-S键的形成。蛋白质复性时聚集反应的抑制

影响二硫键重排和组建的因素

如果复性蛋白质含有二硫键，在复性缓冲液中需加入还原型及氧化型低分子量的巯基试剂的混合物，如谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基苏糖醇等，其还原型(13mmol/L)与氧化型的摩尔比为1:1到10:1。这样的氧化还原系统实际上给蛋白质形成一个还原环境，形成游离的巯基，实际上形成正确的S-S键在此环境中也可能被还原。因此，还需在后续步骤加入强的氧化步骤，即加入过量的氧化型巯基试剂，或采用Cu2+诱导的空气氧化，以保证形成正确稳定的S-S键。

巯基氧化还原型试剂比例对复性的影响二硫键重排和组建二硫键重排和组建

在有氧化还原对存在下，复性缓冲液的pH也很重要，形成S-S键的氧化反应，需要碱性条件下进行。透析复性法

透析法也是最传统、应用最普遍的蛋白质折叠复性方法。包括借助超滤实现复性的透滤复性法。由于变性剂均为小分子物质，在透析或超滤时可逐渐透过多孔膜，使变性蛋白质溶液的变性剂浓度逐渐降低，最后除去变性剂，达到使变性蛋白质折叠复性的目的。影响透析和透滤复性的因素与稀释复性复性基本相同。但过程缓慢，耗时间长，效率低。对某些蛋白质复性率高于稀释复性法。色谱复性法

在色谱过程中实现复性，称为色谱复性法。近年发展十分迅速。其优点是：色谱固定相对变性蛋白质吸附能力低，甚至完全消除变性蛋白质在脱离变性剂的环境发生聚集，产生沉淀。提高复性质量和活性收率。在蛋白质复性的同时可使目的蛋白质与杂蛋白质分离，达到复性与纯化同时进行的目的。便于回收变性剂，有利于降低废水处理成本。适合蛋白质复性的色谱有：凝胶过滤色谱(GFC)、离子交换色谱(IEC)、疏水色谱(HIC)、亲合色谱(AFC).凝胶过滤复性

凝胶过滤色谱是以溶液中分子的流体力学体积大小进行混合物分离的技术。物料在色谱柱中的保留体积不会超出色谱柱中的溶剂的总体积，保留时间短，溶质峰相对较窄，容易检出，灵敏度高。溶质的保留时间可粗略估计，能够把握间隔进料的时间，进行色谱柱的连续使用，提高使用效率。溶质分子之间及溶质与分离介质之间无相互作用，活性分子不易变性，活性收率高。凝胶过滤复性

由于上述特点，凝胶过滤色谱近年开始用于蛋白质复性。在凝胶过滤复性时，先用复性缓冲液平衡凝胶柱，变性蛋白质溶液上样后进入柱顶，因有高浓度变性剂存在，变性蛋白质有一个随机构象状态和大的动力学水合半径，不能进入介质内空隙，在柱上不能保留。在用复性缓冲液洗脱时，因变性蛋白质溶液逐步被稀释，变性剂和蛋白质浓度降低，使变性蛋白质处于热力学不稳定的高能状态，蛋白质分子会自发地向热力学稳定的低能态，即蛋白质的天然状态转化，使蛋白质开始复性。凝胶过滤复性

局部复性的蛋白质体积变小，可进入介质内部，开始在液-固两相间分配，随时间推移，当蛋白质分子结构变得更加紧密时，蛋白质在两相中的分配系数会逐渐增加。蛋白质进入介质颗粒内部空隙后，其扩散速度减缓，从而限制了蛋白质的聚集，减少了沉淀产生。蛋白质分子大，先从柱子上洗脱，变性剂分子小，最后流出色谱柱。达到复性目的。凝胶过滤色谱对蛋白质本身性质没有特殊要求，只要选择合适分离范围的凝胶介质即可。因此，方法比较简单。凝胶过滤复性凝胶过滤色谱复性图谱图凝胶过滤复性变性蛋白质溶液中的DTT对凝胶过滤色谱复性的影响A用SephadexG25除去

DTTB未除去DTT凝胶过滤复性除去DTT后酸化变性蛋白质溶液对复性的影响×不酸化直接脱除DTT＋酸化后脱除

DTT凝胶过滤复性凝胶过滤色谱复性时不同介质对复性的影响凝胶过滤复性不同变性蛋白质浓度对凝胶过滤色谱复性的影响凝胶过滤复性尿素浓度梯度凝胶过滤复性A:Tris-HCl0.1m0l/L,EDTA1mmol/L,GSH/GSSG=3/0.3mol/LB:Urea8mol/L洗脱液：B尿素梯度凝胶过滤复性尿素浓度梯度凝胶过滤复性过程尿素梯度凝胶过滤复性尿素梯度对蛋白质复性的影响尿素梯度凝胶过滤复性尿素最终浓度对蛋白质回收率的影响尿素梯度凝胶过滤复性梯度长度对蛋白质复性活性回收率的影响尿素梯度凝胶过滤复性洗脱液流速对复性蛋白质活性回收率的影响尿素梯度凝胶过滤复性

变性蛋白质浓度对稀释复性、凝胶过滤复性和尿素梯度凝胶过滤复性影响的比较尿素梯度凝胶过滤复性三种复性方法的活性回收率的比较凝胶过滤复性尿素浓度和pH联合梯度凝胶过滤色谱复性亲合色谱复性

是利用配体与目标蛋白质之间的特异亲合作用，使变性蛋白质分子保留在柱的顶端与变性剂分离，而后在洗脱过程中进行复性。依使用的配体，用于复性的亲合色谱有：抗体亲合色谱、金属亲合色谱(IMAC)、脂质体亲合色谱和分子伴侣亲合色谱等。因配体与目标蛋白质间的作用特异性强，且不同配体与不同蛋白质之间的作用差别大，亲合色谱作为蛋白质复性的机理比较复杂。亲合色谱复性

单链抗体融合蛋白scFv57P包涵体的复性。以与scFv57P有特异性结合的小肽C19V为配体的亲合色谱复性。亲合色谱复性

以金属离子为配体的亲合色谱复性法

如以Ni2+为亲合配体，可与末端标记有组氨酸的蛋白质分子有特异的亲合作用，而这种作用又不受强变性剂的影响，可用于重组蛋白质的复性。亲合色谱复性

脂质体亲合色谱复性脂质体作为配体用于蛋白质复性的原理可能是：局部变形的蛋白质分子结构类似于融球状态，与具有天然蛋白质相似的二级结构，此时，蛋白质分子仍然具有强的疏水表面，可同脂质体的脂质双层作用，以帮助蛋白质进行复性。比如碳酸酐脱氢酶的复性使用脂质体的柱子，活性收率为83%，不用为58%。亲合色谱复性

伴侣亲合色谱复性分子伴侣是介导表达蛋白质建立天然构象的一类重要蛋白质，也是蛋白质体外折叠复性过程的辅助因子。在复性溶液中加入分子伴侣可提高蛋白质的复性效率，但溶液中引入了杂蛋白，给目的蛋白质分离纯化带来麻烦，且它价格昂贵，而无法应用。而将分子伴侣结合在适当的介质上构成分子伴侣亲合色谱介质，用于目的蛋白质的复性可克服上述缺点。亲合色谱复性

分子伴侣亲合色谱介导的蛋白质复性与它在溶液中的作用一样。为变性蛋白质提供一个中空环状的疏水腔，当变性蛋白质进入空腔后，可部分避免或完全消除变性蛋白质分子间的聚集作用，使蛋白质在疏水环境中进行“结合-释放-再结合”的循环过程，直到恢复其天然的构象状态。利用合成的复杂的固定相体系成功地使一些用稀释法无法复性的蛋白质复性，因此，它又称为“折叠色谱”。疏水色谱复性

当变性蛋白质与变性剂、杂蛋白进入疏水色谱系统时，由于疏水固定相对变性剂的作用较弱，而对变性蛋白质的作用较强，变性剂首先与与变性蛋白质分离，并随流动相一同流出色谱柱；而疏水固定相提供较通常方法高出数十倍乃至数百倍的能量，在变性蛋白质被疏水固定相吸附的同时瞬时除去以水合状态附着在蛋白质表面和固定相表面接触域的水分子，而蛋白质特定的疏水氨基酸残基与疏水固定相表面作用形成区域立体结构，接着形成折叠中间体，随着流动相的不断变化，变性蛋白质不断在固定相表面进行疏水色谱复性

吸附-解吸-再吸附，在此过程中，变性蛋白质逐渐复性，形成与天然蛋白质结构相同的蛋白质，流出色谱柱。在此过程中，不同蛋白质与固定相的作用强弱不同，复性的目标蛋白质可与大部分杂蛋白进行分离。利用疏水色谱复性rhIFN-γ和rhIFN–α，一次色谱复性达到85%的纯度，活性回收率比稀释法高2-3倍。可将浓变性剂从E.coli提取的目标蛋白质直接进行多种变性蛋白质的复性和同时纯化。离子交换色谱复性

变性蛋白质、变性剂及变性液中的其他组分与离子交换介质间的电荷作用，使它们吸附在离子交换固定相表面，由于这些组分与离子交换介质的吸附能力的差别，在洗脱过程中进行不断地吸附-解吸-再吸附的过程，使变性蛋白质与变性剂逐渐分离，并在吸附-解吸的过程中进行复性过程。如单链抗体融合蛋白质HPV16E7MSZ的复性是使用强阴离子交换色谱进行复性。使用0.01mol/LNaOH、1%SDS和8mol/L尿素溶解HPV16E7MSZ包涵体，MonoQ柱进行复性和离子交换色谱复性

纯化；如果使用NaOH溶解包涵体，可直接用MonoQ柱进行复性和纯化。使用DEAE-纤维素为色谱介质，对重组白细胞分泌抑制因子进行复性和纯化，得到的复性蛋白质浓度比稀释法提高6.5倍，复性收率为46%，质量回收率为96%，时间为5min。各种色谱复性方法的比较凝胶过滤色谱(SEC)复性法：复性分离过程中，变性蛋白质分子逐渐变小，柱负荷小，产物浓度低，复性分离时间长，效率较低。离子交换色谱(IEC)复性法：柱负荷大，分离效果尚好，最常用的变性剂盐酸胍在柱保留，影响柱容量，且往往与蛋白质一起洗脱，使盐酸胍的使用受到限制。亲合色谱(AFC)复性法：因蛋白质与介质有特异的相互作用，变性蛋白质分子间聚集反应少，使原不可逆折叠的蛋白质变成可逆，是强有力的复性手段。但使用范围窄，分子伴侣昂贵，时间长。各种色谱复性方法的比较疏水色谱(HIC)复性法：从高浓度盐溶液中吸附蛋白质，与变性剂瞬间分离，大大降低蛋白质分子间的聚集，为复性可提供疏水环境，有利于复性，若采用梯度洗脱，有利复性和分离，活性收率高，90%以上。色谱复性方法的问题：在复性过程中不可避免地还是会产生聚集形成沉淀，造成色谱柱的壅塞，柱压很快升高，报废。较难放大。展望研究蛋白质变性复性机理，开发新的变性复性原理和技术，解决目前的技术关键。完善现有技术，实现现有技术的实用化和规模化。根据现有技术原理，扩大应用范围。开发实用的设备。

超临界萃取什么是超临界流体

超临界流体（SCF）是指物质的压力和温度同时超过其临界压力(Pc)和临界温度(Tc)时的流体。即，T>Tc，P>Pc分离工程超临界流体不是液体，也不是通常状态下的气体，是一种特定状态的流体分离工程1、处于临界点状态的物质可实现从液态到气态的连续过渡，两相界面消失，汽化热为零。2、超过临界点的物质（T>Tc

），不论压力有多大，都不会使其液化，压力的变化只引起流体密度的变化。

超临界流体萃取（SFE，SupercriticalFluidExtraction）是利用流体在临界点附近所具有的特殊溶解性能而进行的一种化工分离过程。分离工程超临界萃取的发展1879年Hanney和Hogarth发表了他们研究非挥发性无机盐，如氯化钴、碘化钾、溴化钾等在超临界乙醇中的溶解现象。1905年，Buchner首先研究了萘在超临界CO2中的溶解。接着人们研究了蒽、菲、樟脑苯甲酸等挥发性有机物在超临界CO2、甲烷、乙烷、乙烯、三氟甲烷等中的溶解现象。分离工程

1955年，Todd和Eling提出超临界流体用于分离的理论，同时出现了相关的专利。20世纪70年代的能源危机，使节能成为热点。无相变的超临界流体萃取迅速发展起来，人们期待用SFE分离醇和水的混合物，替代高能耗的精馏。分离工程1978年，德国建成了超临界流体萃取咖啡因的工业化装置；1979年，美国的Kerr—McGee开发了超临界流体处理渣油的工业化装置。分离工程

1982年，德国建成超临界CO2萃取啤酒花的大型装置，年处理5000吨；我国在八十年代开始超临界流体萃取研究，国家在“八五”期间进行产业化攻关。1994年，广州南方面粉厂从德国伍德（UHDE）公司进口一套萃取器为300升的超临界萃取装置，生产小麦胚芽油。现在最大的生产装置，萃取器体积为1500升。分离工程超临界流体的PVT关系分离工程1822年，Cagniarddelatour首次发现，在一定条件下，物质可实现从液体到气体的连续过渡，这就是最早观察到的临界现象（见图）。

1869年，英国皇家学院的ThomasAndrews画出了CO2的Pr(P/Pc)—Tr(T/Tc)—ρr(ρ/ρc)状态图。在临界点上：对于理想流体，P-V-T的关系表示如下：

PV=nRT对于带压力的体系，1873年J.D.vanderWaals给出了如下的计算式：分离工程分离工程分离工程Soave-Redlich-Kwong方程分离工程Peng-Robinson方程分离工程对于混合物，其混合规则为：分离工程分离工程物质在超临界流体中的溶解度计算分离工程假设物质溶解经历如下过程：（1）溶质分子A由其主流扩散到二相界面；（2）分子A穿过界面进入溶剂相；（3）分子A在界面上或和溶剂相内与溶剂分子B发生缔合作用分离工程

式（1）、（2）的平衡常数可分别表示为：合并式（1）及（2）有(5)其平衡常数K为：分离工程

对于反应式（1）的广义理解为：n=0时，意味着无缔合反应，仅有A的相平衡时，K不是无意义，而是K≡1。若被萃取相中组分的摩尔浓度用x表示，超临界相中组分的摩尔浓度用y表示。分离工程设溶剂为1；溶质为2；溶质与溶剂的反应物ABn为3，且认为y2很小，即溶质在超临界相中基本上以ABn的形式存在。则

（7）令y3=y

则y1=(1-y) （8）分逸度可用下式表示：(9)(10)分离工程将式（9）、（10）代入（6），整理后得： (11）将溶质在系统温度压力下的纯态定为标准态，则

（12）又有 （13）分离工程上式积分得:

(14)将式（12）、（14）代入式（11）得

(15)上式中n可以是小数，因为在缔合时n个溶质分子可以共用一个溶剂分子结合。分离工程当n=0时，即溶质与溶剂不缔合，k≡1。对于纯固体，则x2=1,γ2=1,且，并假设组分2的摩尔体积不随压力变化，则式（15）变为：(16)(17)分离工程

对于纯固体，其蒸汽压较低，所以φ2*≈1，而在常压到100atm范围内。Poynting修正数仍不大于2。因此φ2是导致增强因子增大的主要原因。例如萘-乙烯体系，在压力为10MPa时，萘在气相的逸度系数φ2＜＜1，使增强因子E高达25000。E称为增强因子，E的物理意义为固体溶质在超临界流体相中溶解度增大的量度，含有φ2*和φ2及指数项，指数项称为Poynting修正数。分离工程

增强因子的计算归结为溶质组分在超临界流体中逸度系数的计算，而逸度系数的计算需通过合适的状态方程。如用SRK方程通过计算，得到的萘溶解度值与实验值相当一致。对三元体系也能很好地吻合，且发现，在低挥发性组分中加入挥发度相对较大的组分后，低挥发性组分的溶解度提高，在实际应用中就是加携带剂的作用。部分物质的超临界参数分离工程分离工程由上表中可见：大部分碳氢化合物其临界压力在5MPa左右；对低碳烃化物，如乙烯、乙烷等，其临界温度近常温，而环状的脂肪烃和芳香烃具有较高的临界温度；水和氨具有较高的临界温度和压力，这是因为极性大和氢键的缘故；二氧化碳具有温和的临界温度和相对较低的临界压力，为最常用的超临界流体；对于临界温度在0～100℃范围的流体，适用于提取天然植物有效成分。分离工程(1)

故压力微小变化可引起流体密度的巨大变化(2)扩散系数与气体相近，密度与液体相近。(3)密度随压力的变化而连续变化，压力升高，密度增加。(4)介电常数随压力的增大而增加。 这些性质使得超临界流体比气体有更大的溶解能力；比液体有更快的传递速率。超临界流体的特性分离工程超临界萃取原理分离工程图中：E—S为恒温减压分离过程

D——P为恒压升温分离过程超临界CO2萃取萘过程分离工程超临界萃取通常有四种工艺流程：分离工程等温降压过程是应用最方便的一种流程。流体经升压后达到超临界状态，到达状态点1，流体经换热后进入萃取器与物料接触，溶解溶质，此过程压力保持不变，在状态点2。然后萃取物料通过减压进入分离器，到达状态点3，此时由于减压而使流体的溶解能力下降，溶质析出，减压后的流体经压缩后回到状态点1，进行下一个循环。等温降压过程分离工程等压情况下，通过改变过程的温度也能实现溶质的萃取和分离。但温度对溶质溶解度的变化比较复杂，在转变压力以下，温度增加溶解能力下降；在转变压力以上，温度下降，溶解能力下降。等压变温过程分离工程在分离器内放置能吸附被萃取物的吸附剂，可实现等压、等温下的萃取和分离，此时压缩机只用于克服循环阻力。但由于涉及到吸附剂的再生，故此流程适用于被萃取物较少的去杂质过程。使用吸附剂的过程分离工程超临界流体中加入惰性气体，如CO2中加入氮气或氩气可降低其溶解能力，达到分离溶质。此过程为恒温、恒压，但牵涉到混合气体的分离回收。加入惰性气体的过程植物细胞超临界萃取的传质模型分离工程分离工程

超临界流体从固定床填充的固体原料中提取有效成分的过程，类似于固定床中脱附过程，在吸附/脱附速率较快时，流体经过一段较短的床层后，即达到饱和；当萃取速度快时，超临界流体经过一段较短床层后，即达到萃取溶解饱和。分离工程假设：1)流体通过萃取器内填料层时为一维无返混活塞流；

2)超临界流体接触原料层后便开始溶解溶质，直到流体内溶质饱和。萃取过程中，溶质从固体相进入超临界流体，可以简化成二步：1)溶质分子由其主体相内部扩散到两相界面；

2)溶质分子扩散溶解到超临界流体主流相中。分离工程式中：C*为溶质在CO2中的饱和浓度；Ct为任一时刻的浓度；tR为CO2经过提取过渡层的时间；Ka为总传质系数；a为单位原料体积传质表面积。萃取过程影响因素分离工程压力——当温度恒定时，溶剂的溶解能力随着压力的增加而增加。温度——当压力较高时，较高的温度可获得较高的萃取速率。一方面是物质的蒸汽压随着温度的增加而增加，另一方面，传递速率随温度增加而增加。物料颗粒度——颗粒过大，固体内传质控制，萃取速率慢。在这种情况下，提高压力对萃取速率影响不明显。颗粒过小，细小的颗粒形成紧密的固体床层，影响传质。溶剂比——溶剂比大，溶剂循环量大；溶剂比小，萃取时间长。分离工程超临界流体萃取过程的应用实例超临界萃取装置中药材分离工程钢瓶压缩机储气柜过滤器萃取器分离器吸收器流量计泵恒温器恒温器泵分离器超临界流体提取工艺流程图卵磷脂的提取分离工程丹参有效成分的提取分离工程桂花香料分离工程树兰香料分离工程当归分离工程分离工程

设备投资较高：高压装置和高压设备，投资费用高，安全要求亦高。操作费用高：超临界流体溶解度相对较低，故需要大量流体循环。超临界萃取过程，处理的原料以固体物系居多，需要经常进行固体的装料和卸料，连续化生产较困难。高压下萃取过程，物性数据缺乏。需要对超临界流体热力学的深入研究和基础数据的积累，使得过程的设计和优化得到更多的理论支持。

超临界萃取的局限性

萃取简介

液-液萃取也称为溶剂萃取。是一个重要的传质分离过程。在液-液萃取过程中，含有待分离组分（溶质A）的液相（料液F，为溶质A溶解于载体C的溶液，萃取后成为萃余相），与另一个与之不互溶或部分互溶的液相（溶剂S）接触，由于溶剂S也能溶解溶质A，但不能或极少溶解C，溶质A通过相际传质进入溶剂S，成为萃取相E，从而实现了对溶质A的提取，即A和C的分离。这是一个包含A、C和S的三元体系的萃取过程。

如果料液中含有多种溶质，由于溶剂S对它们的溶解度不同，也可实现对它们的分离。

由于溶质在两个液相中的分配平衡的限制，通常通过一次液-液平衡接触不能完全达到分离或提取率的要求。在这种情况下，需要通过多级逆流接触才能达到要求。

据Derry和Williams研究，最早的液-液萃取实践在罗马时代即有了，当时采用熔融的铅为溶剂从熔融的铜中