定量PCR方法及数据分析

定量PCR原理、应用及数据分析ZJW原理：PCR（多聚酶链式反应)：一种体外扩增特异DNA片段的技术。反应分为变性（denaturation）、退火（annealing）、延伸（extension）三步。PCR扩增理论方程：起点定量与终点定量：起点的DNA量为“天然”的含量，更有意义；终点的DNA量为经过PCR过程“加工”的量，存在部分“失真”。（终点定量存在更大的误差）定量PCR：通过实时监测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量或者定性的分析化学原理：荧光染料嵌合法,探针法SYBRGreenI（不饱和型），EvaGreen/LCGreen（饱和型），与dsDNA小沟部位嵌合，具有绿色激发波长。游离时不发光。缺点：需用meltingcurve检测产物特异性。探针法：可用于多重PCR及基因分型

TaqMan探针：检测积累荧光

一种寡核苷酸探针,探针两端各锚定一个基团，淬灭剂则在3‘末端。

Taqman探针识别并结合特定的靶序列；探针完整时，报告基团R发出的荧光被淬灭基团Q吸收；在进行延伸反应时,Taq聚合酶的5’外切酶活性将探针切断,使得荧光基团与淬灭剂分离,发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。基线：扩增曲线中的水平部分阈值（Threshold):指扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检测界限。Ct值：从基数到指数增长的拐点所对应的循环次数定量PCR数学原理定量PCR技术的应用定性分析：病毒病原菌检测、生物品种鉴定、SNP分析等、基因突变分析等绝对定量：基因拷贝数分析，病毒病原菌定量分析等相对定量：mRNA表达分析，siRNA表达分析等定量PCR实验流程目标基因的查找、比对引物、探针的设计与合成反应体系和条件的优化数据分析定量PCR引物设计的要求：①Tm=55-65℃②GC=30-80%③PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp之间都可。④引物的退火温度要高，一般要在60℃以上。内参基因的选择：内参：用于去除不同样本在RNA的产量、质量以及逆转录效率差异对目标基因表达的影响。稳定表达于不同类型的组织和细胞中（如正常细胞和癌细胞），而且其表达量无显著差异；高度或中度表达，排除太高或太低表达；表达水平与细胞周期、细胞是否活化无关，且不受任何外源性和内源性因素的影响。常见几种内参基因的优缺点：GAPDH：在不同癌组织（包括肺癌、乳腺癌、肾细胞癌）中表达升高，在不同个体间、妊娠期间以及细胞周期的不同阶段，以及多种因素刺激下（包括低氧、胰岛素、地塞米松、丝裂原、表皮生长因子等）表达存在差异；β-actin：细胞恶性转化时表达水平增加；18SrRNA:rRNA合成的调节独立于mRNA。rRNA不包括PolyA尾，在以OligodT作为引物的cDNA合成中不能被转录。rRNA高丰度表达，远高于目标基因，较其他内参基因稳定，且受RNA降解的影响比较小。反应体系的配制

（25ul体系）组分加量模板cDNA2uL10uM引物F/R各0.5uL2xSYBRGreenmix12.5uLddH2O9.5uL熔解曲线绝对定量：从荧光强度到拷贝数相对定量的数据分析

(2-ΔΔCt法/comparativeCtmethod)Livak,K.Jetal."Analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2(-DeltaDeltaC(T))Method."目标基因表达量（处理组/非处理组）的差异Livak,K.Jetal."Analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2(-DeltaDeltaC(T))Method."Livak,K.Jetal."Analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2(-DeltaDeltaC(T))Method."Livak,K.Jetal."Analysisofre