发酵工程实验

发酵工程试验2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院试验一发酵培养基配制熟悉发酵培养基配制的要求熟悉玻璃器皿的包扎掌握灭菌方法一.试验目的2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院1.营养琼脂培养基蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，琼脂20g，加水至1000mL，pH7.2-7.4。通过称量、溶解和调节pH等步骤，配制上述培养基；分装成200ml/瓶，每人一瓶，进行灭菌。2.配制45mL无菌水（内装6颗玻璃珠）一三角瓶/人，4.5mL无菌水试管4枝/人，另外包扎好培养皿6个/人，0.5mL和5mL移液管各1枝/人，涂布棒1枝/人。3.将上述配好的培养基，无菌水，培养基，移液管和涂布棒放入灭菌锅灭菌，备用。二.试验内容2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院三.玻璃仪器的包扎2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院1.移液管的包扎ABCD2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院EFGH2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院2.试管的包扎ABCD2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院E2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院四.思考讨论配制发酵培养基时应该注意什么？使用压力蒸汽灭菌锅时要注意哪些问题？2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院实验二发酵菌种的自然选育学习从自然环境中分离工业微生物菌株的方法掌握涂布分离方法一.实验目的2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院1.取试管斜面一接种环，放入装有45mL无菌水的三角瓶中，震荡10min，即为10-1的稀释液；2.取4.5mL无菌水4枝，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5.3.取10-1的稀释液，震荡后静止2min，用无菌移液管吸取0.5mL上层细胞加至一根4.5mL无菌水的试管中，即成10-2的稀释液；同理，振荡2min，用无菌移液管吸取10-2的稀释液0.5mL加至另一根4.5mL无菌水的试管中，即成10-3的稀释液；依次类推，得到10-4，10-5的稀释液。4.在超净台上，吸取10-5、10-4、

10-3的稀释液0.1mL，加至琼脂培养皿平板上，用无菌涂布棒涂布均匀。5.将涂布的培养皿倒置培养于恒温培养箱中，32℃培养2天后观察。二.实验内容2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院实验操作：1.斜面接种无菌操作技术2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院①②③④2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院⑤⑥⑦2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院2.倒平板：按无菌要求，在火焰旁操作，取融化并冷却至不烫手的固化培养基（约50℃），倒入无菌培养皿中，倒量以铺满皿底为限，不超过培养皿高度的1/3。2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院3.平板划线接种：2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院平板划线示意图2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院菌体细胞浓度稀释示意图2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院涂布示意图2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院下一次实验准备50mL生理盐水（0.45gNaCl)/人，包扎灭菌；5.0mL,0.5mL移液管，涂布棒/人包扎灭菌；营养琼脂培养基每组1L,每人200mL分装后，灭菌；4.5mL无菌水4枝/人,包扎后灭菌；2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院实验三发酵菌种的诱变育种一.实验目的了解诱变育种的基本原理掌握突变菌株的分离方法二.紫外线诱变原理2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院1.菌体悬浮液的制备

取单菌落一接种环，放入装有50mL的生理盐水的三角瓶中，用玻璃珠振荡10分钟，制得菌体悬浮液。用显微镜直接计数法计数悬浮液中的细胞数，并通过稀释将悬浮液调整至大约107个/mL。三.实验内容2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院2.诱变

取9cm直径无菌培养皿1只/人，加入制备好的菌悬液5mL和磁力搅拌棒（预先灭菌），然后放于磁力搅拌器上，打开皿盖，在距紫外线30cm处照射90秒，而后，从中取出0.5mL诱变后菌液，加入4.5mL（10-2）试管中，振荡摇匀2min，再稀释至10-3，10-4，10-5，分别取0.1mL涂布平板。3.培养观察

32℃培养箱倒置培养，2天后观察培养结果。2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院思考题诱变育种过程要注意哪些关键步骤？2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院实验四大米淀粉的液化淀粉的液化配制30％的淀粉乳（按200ml升配制），调节pH值至6.5，加入氯化钙(对固形物0.2％)，加入液化酶(12-20U/g淀粉)，在剧烈搅拌下，先加热至72℃，保温15min，再加热至90℃，并维持30min，以达到所需的液化程度，碘反应呈棕红色。液化结束后，再升温至120℃，保持5-8min，以凝聚蛋白质，改进过滤。一.实验目的要求学生掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法。二.实验内容2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院葡萄糖聚合度与碘液的呈色表葡萄糖聚合度与碘液呈色最高吸收波长（nm)葡萄糖无色糊精16淡红色480

21红色510

28红紫色540

34紫色560

41兰紫色580淀粉61兰色600淀粉120兰色620淀粉330兰色6302014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院淀粉遇碘液呈蓝色糊精遇碘液呈紫色2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院思考题：1.淀粉液化时加氯化钙的作用？2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院实验五淀粉的糖化淀粉的糖化液化结束后，将料液用盐酸将pH调至4.2-4.5，同时升温至60℃。加入糖化酶1.0g，60℃保温。若干小时后，当用无水酒精检验无糊精存在时，将料液pH调至4.8-5.0，同时，将料液加热至80℃，保温20min．然后将料液温度降至60-70℃，开始过滤。要求学生掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法。一.实验目的二.实验内容2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院淀粉糊精麦芽糖葡萄糖碘液蓝色紫色碘液原色碘液原色无水酒精白色浑浊白色浑浊微溶澄清淀粉液化和糖化的终点判断糖化酶分解糊精的原理是什么？思考题2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院实验六发酵液中还原糖的测定二.实验步骤1.斐林试剂的标定

准确吸取斐林甲、乙液各5ml，置入250ml锥形瓶，加水10ml，从滴定管中预先加入约20ml0.1%的标准葡萄糖溶液，摇匀，于电炉上加热至沸腾，在沸腾状态下(同时关掉电炉，以便滴定终点时颜色判断）继续滴加标准葡萄糖溶液，至蓝色刚好消失为终点。记录前后总共消耗的标准葡萄糖溶液的总体积。同法平行操作三份，取接近的两次体积的平均值V0。2.滴定

准确吸取斐林甲、乙液各5ml，置入250ml锥形瓶，加水10ml。吸取0.05ml大米淀粉水解葡萄糖液，摇匀后加热沸腾，继续用0.1%的标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失。记录消耗的标准葡萄糖液的总体积V。3.计算

还原糖(g/100ml)=（V0-V)×0.1%×1/0.05×100一.目的：掌握可发酵性还原糖的测定方法作出发酵过程的糖耗代谢曲线2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院实验七发酵罐结构与空气管道灭菌1.掌握发酵罐的基本结构和操作方法2.掌握空气管道灭菌的方法3.掌握发酵罐灭菌方法一.实验目的2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院二.发酵罐结构和基本条件2.1发酵罐的基本条件1.结构上具有适宜的径高比。发酵罐的高度与径高比一般为1.7~4，罐身越长，氧气的利用率越高。2.有一定的刚度与强度，由于发酵罐在灭菌过程和工作时，罐内有一定的压力和温度。因此需要一定的强度。3.搅拌通风装置使之气液充分混合，保证发酵液一定的溶解氧。4.足够的冷却面积。5.尽量减少死角。6.轴封严密。7.维修操作检测方便2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院2.2发酵罐的结构组成好气性机械搅拌发酵罐是密闭式受压设备，主要部件包括罐体、搅拌器、轴封、消泡器、传动装置、空气分布器，挡板、冷却装置、人孔和视镜等。2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院通用的机械搅拌通风发酵罐主要部件有罐体﹑搅拌器﹑挡板﹑轴封﹑空气分布器﹑传动装置﹑冷却管(或夹套)﹑消泡器﹑人孔﹑视镜等。底部排污阀空气分布器内冷却盘管叶轮夹套人孔齿轮箱轴封视镜搅拌器切向高度液体高度图4发酵罐结构图及术语2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院实验八液化型淀粉酶活力的测定掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法一、实验目的2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院二、实验原理

淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一类酶，包括α-淀粉酶，淀粉1，4-麦芽糖苷酶（β-淀粉酶），淀粉1，4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1，6-葡萄糖苷酶(异淀粉酶)。α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1，4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，使淀粉的黏度下降，因此又称为液化型淀粉酶。

淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院三、实验步骤1、酶液稀释用pH6.0缓冲液将粗酶液作适当稀释。2、标准曲线的制作:将可溶性淀粉稀释成0.2%，0.5%，1%1.5%和2%的稀释液；吸取淀粉稀释液2.0ml加至试管中，再加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.0ml，40℃水浴保温5min；加蒸馏水1mL，40℃保温30min后加入0.5mol/L乙酸10ml;吸取反应液1mL，加稀碘液10mL,混匀，在660nm下测得吸光度A[用2.0mL蒸馏水代替步骤（2）中的淀粉稀释液作为对照]；以淀粉浓度作为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院3、淀粉酶活力测定

用2%可溶性淀粉溶液按3(2)操作，用稀释后的粗酶液1mL代替3(3)中的蒸馏水，测吸光度A660,从标准曲线中查出相应的淀粉浓度，求出被酶消耗的淀粉量(表1-3)。2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院管号1234567(样品)淀粉稀释液/mL2(0%)2(0.2%)2(0.5%)2(1.0%)2(1.5%)2(2.0%)2(2.0%)缓冲液/mL111111140℃水浴保温5min蒸馏水/mL1111110粗酶液/mL0000001

40℃保温30min，然后加入0.5mol/L乙酸10ml，混匀吸取反应液1mL稀碘液/mL10101010101010A660表1-3液化型淀粉酶活力测定2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院4、酶活力计算

酶活力以每毫升粗酶液在40℃,pH6.0的条件下每小时所分解的淀粉毫克数来衡量。四、思考题1、是否可直接用蒸馏水作对照?2、糊精与碘反应生成的颜色（如红色）是否会对结果产生影响？用糊精溶液作一试验。2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院实验九麦芽汁的制备1.熟悉麦汁的制备流程，为啤酒发酵准备发酵培养基.2.制备酵母菌繁殖培养基一.实验目的2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院二、实验原理麦汁制备包括原料糖化、麦醪过滤和麦汁煮沸等几个步骤。糖化一般分阶段进行：先将糖化醪调至35℃，使麦芽中的酶最大限度地溶出,利用麦芽磷酸酯酶水解菲汀成酸性磷酸盐。在麦芽酶类中，肽酶分解蛋白质为多肽和氨基酸，一般温度为45-50℃，这一过程也叫蛋白质休止。α-淀粉酶和β-淀粉酶是两种关键的酶，它们的最适pH均在5.6左右。α-淀粉酶最适作用温度70℃左右，50℃以下活性很弱，至80℃是失活，其作用方式为不规则地切断淀粉的α-1，4糖苷键，产物大部分为糊精，也生成少量麦芽糖、异麦芽糖及葡萄糖。β-淀粉酶的最适作用温度为60~65℃,能从淀粉及糊精的非还原末端依次切下麦芽糖，同时发生瓦尔登转位反应，即构型翻转，α构型转变为β构型。2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院三、实验步骤1、麦芽粉碎

称取100g麦芽，用谷物粉碎机粉碎，注意调节粉碎颗粒度，使粗细粉比例控制在1：2.5，同时使麦皮破而不碎。必要时可稍稍回潮后再粉碎。2、糖化

糖化是利用麦芽中所含的酶，将麦芽和辅助原料中的不溶性高分子物质，逐步分解为可溶性低分子物质的过程。制成的浸出物溶液就是麦汁。

浸出糖化法：纯碎利用酶的生化作用进行糖化的方法。在糖化锅内加入约200ml纯净水，边搅拌，边将粉碎后的麦芽粉缓慢倒入糖化锅内，让麦芽粉分散均匀。然后按下述流程糖化。

35~37℃pH5.2,保温30min→45~50℃pH5.3,60min→65℃pH5.6,30min(碘液反应完全)→

76~78℃用滤纸过滤，得到澄清麦芽汁。2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院四、思考题1.麦芽粉碎程度会对过滤产生怎样的影响？2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院实验十麦芽汁（浸出物）浓度的测定了解用密度（比重）瓶法测定密度的原理，掌握测定方法。学习用比重瓶测定麦芽汁浓度的方法一、实验目的2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院二、实验原理在一定温度下，各种物质都有其相应的密度。当物质纯度改变时，密度也随着改变，故测定密度可检测物质的纯度或溶液的浓度。如在啤酒发酵中，随着糖分的消耗、酒精和CO2的产生，密度会逐渐下降，因此可通过测定发酵液的密度来了解发酵过程。2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院

为了调整啤酒酿制时的原麦汁浓度，控制发酵的进程，常常在麦汁制造及啤酒发酵过程中测定麦汁的浓度，其中主要是测定麦汁及啤酒中所含的浸出物含量，浸出物越多，密度也越大。浸出物是指啤酒中以胶体形式存在的一组物质，包括：(1)糖类

啤酒热值的重要来源。包括可发酵性糖和非发酵性糖（低聚糖、糊精、β-葡聚糖和戊聚糖）。低聚糖含量高，可使啤酒口味醇厚，但若可发酵糖残留过高，会引起啤酒冷浑浊，不利于啤酒的生物稳定性；2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院(2)含氮物质

啤酒中的含氮物质约为300～800mg/L（以氮计），相当于麦汁含氮量的55%～65%。(3)维生素和无机矿质元素

啤酒中含有较多的维生素B、维生素C和0.1%～0.2%的无机矿质元素。它们除赋予啤酒营养价值外，还有一些特殊功效，如铁、钴、镍的盐类能促进啤酒起泡，钴盐还有防止喷涌的作用。(4)苦味质和多元酚

啤酒中的苦味物质是一系列被称为异α-酸的化合物。啤酒的苦味质含量一般为15~40BU,花色苷30～40mg/L，多元酚物质100～200mg/L。花色苷过高会破坏啤酒的胶体稳定性及香味稳定性。

2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院

麦汁和啤酒发酵液在20℃的密度规定为，在空气中20℃样品与同体积20℃水的质量之比值。2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院三、实验步骤1、空瓶称量将密度瓶洗干净后，吹干或低温烘干（可用少量酒精或乙醚洗涤），冷却至室温，精确称量至0.1mg。2、称水质量将煮沸并冷却至15~18℃的蒸馏水装满密度瓶（注意瓶内不要留有气泡）。装上温度计，立即浸入20±0.1℃的恒温水浴（或生化培养箱）中，让瓶内温度计的指示上升至20℃并在20℃下保温5min，取出密度瓶，并用滤纸吸取溢出支管外的水，立即盖上小帽，室温下平衡温度后，擦干瓶壁上的水精确称量至0.1mg。2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院3、样品称量倒出蒸馏水，用少量麦芽汁洗涤3次后，加入冷却至15~18℃的样品，按2测得样品质量。4、密度计算

密度瓶和样品质量-空瓶质量样品密度=———————————————

密度瓶和蒸馏水质量-空瓶质量5、查表查阅密度-浸出物对照表2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院密度浸出物1.00000.0001.00100.2571.00200.5141.00300.7701.00401.0261.00501.2831.00601.5391.00701.7951.00802.0531.00902.3051.01002.5601.01102.8141.01203.067密度浸出物1.01303.3311.01403.5731.01503.8261.01604.0071.01704.3291.01804.5801.01904.8301.02005.0801.02105.3301.02205.5801.02305.8281.02406.0771.02506.325密度-浸出液浓度对照表（g/100g)密度浸出物1.03909.7511.04009.9931.041010.2341.042010.4751.043010.7161.044010.9951.045011.1951.046011.4351.047011.6731.048011.9121.049012.1501.050012.3871.051012.624密度浸出物1.02606.5721.02706.8191.02807.0661.02907.3121.03007.5581.03107.8031.03208.0481.03308.2931.03408.5371.03508.7811.03609.0241.03709.2671.03809.5092014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院四、思考题若无20℃恒温水浴，怎样尽可能测准密度?2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院掌握酒精含量的测定方法，监测酒类产品的质量。实验十一酒精度的测定一、实验目的2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院二、实验原理

蒸馏是分离液体混合物的一种有效方法。其原理是基于发酵产物的沸点不同，将所需物质从液体混合物中分离出来。它与蒸发不同，蒸发是去除低沸点物质和部分水蒸气，使代谢产物浓缩的过程，而蒸馏要得到的恰恰是低沸点物质。发酵工业中常用的蒸馏方法有简单蒸馏、精馏和特殊蒸馏等。按压力的不同，又可将简单蒸馏分为常压蒸馏、加压蒸馏和减压蒸馏。目前酒精、白酒、丙酮、丁醇等都用蒸馏方法来提取。啤酒发酵中的酒精含量一般较低，好在酒精的沸点只有78oC，因此可用小火将发酵液或啤酒中的酒精蒸馏出来，收集蒸馏液，测定其密度。然后根据密度-酒精度对照表(表3-11)，可查得酒精含量。啤酒工业中，酒精度是指利用在20oC时酒精水溶液与同体积纯水的质量之比，求得相对密度(d2020),然后查表得出试样中的酒精的体积分数，以V/V的百分数表示。2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院三、实验步骤酒精度的测定(1)在已精确称量至0.05g的500mL蒸馏瓶中，用容量瓶量取100mL除气的啤酒，用50mL蒸馏水分3次冲洗容量瓶，洗液并入蒸馏瓶中，并加玻璃珠数粒；(2)按上冷凝器，冷凝器下端用一100mL容量瓶(最好是原容量瓶)接收馏出液。若室温较高，为了防止酒精蒸发，可将容量瓶浸于冷水或冰水中(最好用容量瓶，也可先用量筒接取，然后洗入容量瓶中);(3)打开冷却水，插上电炉电源，开始蒸馏时用文火加热，沸腾后可加强火力(注意不可让沸腾后的泡沫流入冷凝器中，冷凝管出口水温不得超过20oC)，蒸馏至馏出液接近100mL(96mL左右)时停止加热；蒸馏时间应控制在30~60min;(4)取下容量瓶，在20oC平衡一定时间后，加蒸馏水至100mL，混匀;2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院(5)用密度瓶法精确测定溜出液密度；(6)查密度-酒精度对照表(表3-11)，求得酒精含量。2014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院表3-11密度-酒精度对照表密度酒精度密度酒精度密度酒精度密度酒精度1.00000.0000.99701.6200.99403.3200.99105.1300.99990.0550.99691.6750.99393.3750.99095.1900.99980.1100.99681.7300.99383.4350.99085.2550.99970.1650.99671.7850.99373.4900.99075.3150.99960.2200.99661.8400.99363.5500.99065.3750.99950.2700.99651.8900.99353.6100.99055.4450.99940.3250.99641.9500.99343.6700.99045.5100.99930.3800.99632.0050.99333.7300.99035.5700.99920.4350.99622.0600.99323.7850.99025.6350.99910.4850.99612.1200.99313.8450.99015.7000.99900.5400.99602.1700.99303.9050.99005.7600.99890.5900.99592.2250.99293.9650.98995.8200.99880.6450.99582.2800.99284.0300.98985.8902014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院0.99870.7000.99572.3350.99274.0900.98975.9500.99860.7500.99562.3900.99264.1500.98966.0150.99850.8050.99552.4500.99254.2150.98956.0800.99840.8550.99542.5050.99244.2750.98946.1500.99830.9100.99532.5600.99234.3350.98936.0250.99820.9650.99522.6200.99224.4000.98926.2700.99811.1150.99512.6750.99214.4600.98916.3300.99801.0700.99502.7300.99204.5200.98906.3950.99791.1250.99492.7900.99194.5800.98896.4550.99781.1800.99482.8500.99184.6400.98886.5200.99771.2350.99472.9100.99174.7000.98876.5800.99761.2850.994629700.99164.7600.98866.6450.99751.3450.99453.0300.99154.8250.98856.7100.99741.4000.99443.0900.99144.8850.98846.7800.99731.4550.99433.1500.99134.9450.98836.8400.99721.5100.99423.2050.99125.0050.98826.9100.99711.5650.99413.2650.99115.0700.98816.9802014-09-24浙江师范大学化学与生命科学学院四、思考题(1)是否可以在馏出液接近90mL时停止蒸馏?(2)如果馏出液大于100mL，会对结果产生怎样的影响？2014-0