大肠杆菌利用废弃生物质高效生产丁二酸的代谢工程研究

大肠杆菌利用废弃生物质高效生产丁二酸的代谢工程研究利用木质纤维素类生产生物化学品及生物燃料是生物炼制的核心内容。丁二酸是一种平台化合物,广泛应用于医药、食品、餐饮等行业,同时,丁二酸还可用于生产一些重要的聚酯、烷烃等。目前,利用木质纤维素生产丁二酸有很多挑战,比如木质纤维素预处理成本控制、基因工程菌的构建、五碳糖和六碳糖的利用等等。在本论文中,我们利用Palmariapalmata、Strophanthuspreussii、Cocosnuciferawater(可可椰子水)以及elephantgrassstalk(大象草茎)四种生物质为原料,开展了生物合成丁二酸的研究。首先,我们利用红巨藻P.palmata进行了微生物合成丁二酸的研究。在工程菌E.coliKLPPP中分别敲除了乳酸脱氢酶A(ldhA)、丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)、磷酸转乙酰激酶A(pta-ackA)、丙酮酸氧化酶B(poxB)等基因,并且过表达了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。P.palmala水解产物含有葡萄糖(12.57±0.17g/L)和半乳糖(18.03±0.10g/L)。经过72小时得双阶段发酵,重组菌利用半乳糖(1.20±0.02mol/mol)作为底物比利用葡萄糖(0.48±0.03mol/mol)得到的丁二酸摩尔产率更高。丁二酸的浓度及摩尔产率分别达到22.40±0.12g/L和1.13±0.02mol/mol(总糖)。这一结果表明,P.palmata生物质是一种新型的、具有替代性的生物基化学品的发酵原料。第二,对E.coli工程菌利用S.preussii发酵生产丁二酸的生物炼制过程进行了研究。我们对S.preussii的甲醇浸提预处理工艺进行了优化。S.preussii甲醇浸提物主要含有葡萄糖(9.00±0.02g/L)、半乳糖(4.00±0.02g/L)、木糖(6.00±0.02g/L)、阿拉伯糖(0.50±0.02g/L)。工程菌E.coliK3OS中过表达了吡啶核苷酸转氢酶基因(sthA),同时敲除ldhA,pflB,pta-ackA,poxB。该菌有效利用了S.prussii的甲醇浸提产物。在M9培养基中,经过72小时的双阶段发酵,丁二酸浓度达到14.39±0.02g/L,产率为1.10±0.01mol/mol(总糖)。这一水平达到利用S.preussii甲醇浸提物发酵产生丁二酸最大理论值的64%。第三,我们构建了工程菌E.coliM6PM,该菌过表达了Bacillussubtilis的丙酮酸羧化酶基因(pyc)基因,并对ldhA、pflB、pta-aackA、poxB、pgi、mureinclusterC(mreC)进行了突变,下调了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因的活性。我们利用该菌进行了可可椰子水混合糖发酵生产丁二酸的研究。C.nuciferawater主要含有葡萄糖(5.00±0.02g/L)、果糖(6.10±0.01g/L)、蔗糖(6.70±0.02g/L)。经过72小时得双阶段发酵,丁二酸最终浓度达到11.78±0.02g/L,产率为1.23±0.01mol/mol(总糖)。这一水平达到利用C.nuciferawater发酵产生丁二酸最大理论值的72%。这一研究也显示了可可椰子水作为底物生产生物化学品的重要性。第四,利用大香草茎水解物进行了丁二酸发酵。大香草茎水解物主要含有葡萄糖(11.60±0.04g/L)、木糖(27.22±0.04g/L)、阿拉伯糖(0.65±0.04g/L)。工程菌E.coliM6PM可有效利用大香草茎水解物发酵生产丁二酸。该工程菌对ldhA、pflB、pta-ackA、poxB、pgi、mreC等多基因进行了突变、下调了ppc基因、过表达了B.subtilis的pyc。经过72小时双阶段发酵,产生的丁二酸最终浓度达到30.03±0.02g/L,产率为1.09mol/mol。这一研究说明了工程菌利用可再生的生物质作为原料发酵生产丁二酸得可能性。最