蛋白激酶A参与抗胆碱药物快速抗抑郁作用机制研究

蛋白激酶A参与抗胆碱药物快速抗抑郁作用机制研究研究背景:抑郁症严影响着着人类的健康,并给公共卫生事业带来巨大的负担。目前抑郁症的发病机制仍不十分明确,治疗现状并不理想。当前临床经典抗抑郁药多针对单胺类神经递质系统进行调控来发挥作用。这类药物普遍起效缓慢,往往需要数周乃至数月才见效,且疗效不佳,并可能增加患者自杀、致残的风险。因此,开发新型快速的抗抑郁药物具有着十分重要的临床和社会意义。近年来,研究发现,在亚临床剂量下,非选择性M型胆碱能受体阻断剂东莨菪碱具有快速而显著的抗抑郁作用,但其具体作用机制尚不明确。相关研究发现,与其他具有快速抗抑郁作用的药物类似,东莨菪碱通过增强AMPA受体功能,一过性地激活mTOR通路,进而重塑慢性应激导致的突触传递障碍。然而东莨菪碱究竟通过何种机制增强AMPA受体的功能,以及自阻断M受体到激活mTOR信号通路之间的胞内事件尚不明确。对这个问题的研究和阐明,将有助于揭示抗胆碱类药物快速抗抑郁的作用机制,并为开发新型快速安全的抗抑郁药物奠定理论基础。目的:本研究通过电生理技术,脑立体定位手术,急性海马脑片孵育,细胞膜蛋白提取,Westernblot,习得性无助(Learnedhelplessness,LH)抑郁模型以及抑郁样表现的行为学检测等方法,探讨蛋白激酶A参与东莨菪碱对AMPA受体的增强以及激活mTOR通路的上游机制,并比较东莨菪碱与其他特异性M受体阻断剂的作用效果,为揭示快速抗抑郁药物作用机制和开发新型快速安全的抗抑郁药物提供重要的实验依据。方法:1、采用大鼠习得性无助(learnedhelplessness,LH)应激方法建立抑郁模型,并通过相关行为学实验(强迫游泳,开放旷场,糖水偏爱)检测造模效度。2、分别用0,10nM,100nM,1μM,10μM浓度东莨菪碱溶液灌流应激后大鼠脑片,检测东莨菪碱促进GluA1Ser845及mTORSer2448位点的磷酸化水平的作用与其浓度的关系。3、利用电生理技术,在NMDA受体的阻断剂APV孵育并灌流海马脑片的基础上,给予东莨菪碱(1μM)灌流,记录CA1辐射区兴奋性突触后场电位(SC-CA1fEPSP)的变化,并以PKA的选择性的阻断剂H89(1μM)预孵育并灌流脑片,观察其对东莨菪碱这一作用的影响。4、急性分离的海马脑片予以东莨菪碱或合并H89进行孵育,用细胞膜蛋白提取技术分离膜蛋白进行Westernblot检测,研究东莨菪碱及H89对GluA1和GluA2膜表达水平的影响。5、在经过GABAa受体阻断剂picrotoxin(100μM)预处理的海马脑片上,再给予东莨菪孵育,观察CA1区GluA1Ser845和mTORSer2448的磷酸化和GluA1表达的增加作用是否被GABAa阻断剂所完全掩盖。6、通过立体定位置管手术,习得性无助大鼠侧脑室提前注射H89或人工脑脊液,然后腹腔注射东莨菪碱,或侧脑室注射M2受体选择性阻断剂美索拉明,取海马CA1区进行westernblotting检测,观察东莨菪碱活体给药对GluA1总蛋白,以及GluA1Ser845和mTORSer2448磷酸化水平的作用,以及H89预处理对该作用的影响。7、同上,侧脑室提前注射H89或人工脑脊液,再注射M2受体选择性阻断剂美索拉明,进行westernblotting检测,观察其对海马GluA1总蛋白,以及GluA1Ser845和mTORSer2448磷酸化水平的作用,以及H89预处理对该作用的影响。8、习得性无助大鼠侧脑室提前注射H89或人工脑脊液,随后给予东莨菪碱和美索拉明,进行强迫游泳和开放旷场检测,验证其活体条件下对抑郁样行为的作用,以及该效应是否受H89影响。结果:1、通过不可逃避足底点击应激,成功构建了SD大鼠习得性无助模型。2、急性海马脑片上,东莨菪碱剂量依赖地增加海马CA1区GluA1Ser845的磷酸化和GluA1总蛋白的表达。东莨菪碱在1μM的浓度下增加mTORSer2448的磷酸化;在其他浓度则未见明显激活。3、东莨菪碱在APV(100μM)孵育和灌流下,依然能够快速增加海马SC-CA1兴奋性突触后场电位的幅度。这一效应可被蛋白激酶A的特异性拮抗H89阻断。4、东莨菪碱可以快速增加海马脑片CA1区胞膜GluA1表达,该作用可以被H89所阻断。GluA2膜表达则未受东莨菪碱和H89明显影响。5、GABAa阻断剂不能掩盖东莨菪碱介导的GluA1Ser845和mTORSer2448位点的磷酸化增加。但经过GABAa阻断剂预处理的脑片上,未能观察到东莨菪碱进一步增加GluA1总蛋白的水平。6、LH大鼠腹腔注射东莨菪碱可以增加海马GluA1总蛋白水平;这一效应不依赖于PKA。同时,东莨菪碱促进GluA1Ser845和mTORSer2448位点的磷酸化。该效应需要PKA途径参与。7、LH大鼠侧脑室注射美索拉明可以同时增加海马GluA1Ser845和mTORSer2448位点的磷酸化。该效应需要PKA途径参与。但经美索拉明和H89急性给药后,未观察到GluA1总蛋白水平发生明显变化。8、LH大鼠腹腔注射东莨菪碱或侧脑室注射美索拉明都可以缩短强迫游泳实验中的不动时间,而不影响旷场试验中的自主活动能力。结论:1、PKA对于在东莨菪碱激活AMPA受体和mTOR通路,及发挥快速抗抑郁作用是必须的,其可能是通过磷酸化GluA1Ser845,促进AMPA受体上膜实现上述作用。2、东莨菪碱介导的GluA1总蛋白快速表达增加不依赖PKA,但受GABAa受体调控。3、选择性M2受体阻断剂美索拉明可以起到类似于东莨菪碱对于GluA1和mTOR的磷酸化作