生物工程下游技术

生物工程下游技术河南牧业经济学院生物工程系李冬目录第一章：〔绪论〕…………3~25第二章：下游技术的理论根底…………26~42第三章：发酵液预处理……43~87第四章：微生物细胞的破碎………………88~122第五章：溶剂萃取和浸取………………123~167第六章：超临界流体萃取………………168~213第七章：双水相萃取技术………………214~250第八章：反胶团萃取……251~287第九章：膜别离过程……288~353

第一章

〔绪论〕本章要求熟悉下游加工过程的重要性和特点了解下游加工技术的开展过程掌握下游加工过程的主要步骤和主要单元操作一、下游加工过程在生物技术中的地位下游技术〔工程〕〔downstreamprocessing〕：对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反响等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取别离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。下游加工过程的重要性。〔组成、费用和关注程度〕①组成：下游加工过程是生物技术的重要组成局部，发酵液或反响液需要经过下游加工过程才能成为成品；②费用：传统发酵工业中下游局部的费用占整个工厂投资费用的６０％，而对重组ＤＮＡ生产蛋白质等基因工程产品，下游加工的费用可占整个生产费用的８０％－９０％；③关注程度：英国政府工业部于１９８３年发起生物别离方案〔ＢＩＯＳＥＰ〕，专门研究下游加工过程；１９８７年英国化学工业会召开了专门讨论下游加工过程的国际会议；我国也于１９８９年在济南召开了一次专门会议；近十年来国内外有关生物别离或蛋白质纯化的专著陆续出版。二、生物技术下游加工过程的特点含水多，产物含量低；含菌体蛋白；溶有原来培养基成分；相当多的副产物和色素；易被杂菌污染或使产物进一步分解；易起泡，粘性物质多。1.发酵液的特点2.整个下游加工过程应遵循以下四个原那么时间短；温度低；pH适中〔选择在生物物质的温度范围内〕；严格清洗消毒〔包括厂房、设备及管路，注意死角〕，这和传统产品抗生素的生产是一致的。对基因工程产品还应注意生物平安〔biosafety〕问题，要防止菌体扩散，一般要求在密封的环境下操作。三、生物工业下游技术的开展历程古代酿造业2.第一代生物技术古代酿造业包括酿酒、制酱〔油〕、醋、酸奶和干酪等。技术原始、家庭式作坊、产物根本不经过后处理而直接使用，无下游技术。主要指19世纪60年代---20世纪40年代青霉素等抗生素出现之前的生物技术产业。发现了发酵的本质是微生物的作用，掌握了纯种培养技术，生物技术进入近代酿造产业的开展阶段。到20世纪上半叶，逐渐开发形成了发酵法生产酒精、丙酮、丁醇等微生物发酵工业〔厌氧发酵〕，其产品相对简单，根本上是无活性的小分子。此时开始引入过滤、蒸馏、精馏等近代别离技术。以20世纪40年代出现的青霉素产品为代表。无菌空气制备技术、大型好氧发酵装置开发，一大批通风发酵技术产品相继投入了工业生产，如抗生素〔链霉素〕、氨基酸〔谷氨酸〕、有机酸〔核酸、柠檬酸〕、酶制剂〔淀粉酶〕、微生物多糖和单细胞蛋白等。产品多样性决定了别离方法的多样性。借鉴和引进吸收了大量的近代化学工业的别离技术，如沉淀、离子交换、萃取、结晶等。3.第二代生物技术以20世纪70年代末崛起的DNA重组技术及细胞融合技术为代表。生物技术在其主要领域：基因工程、酶工程、细胞工程和微生物发酵工程取得了长足进步，一批高附加值的产品开始面世，如乙肝疫苗、干扰素等。80年代，发现了一大批生理功能性物质，如活性糖质、活性肽、高度不饱和脂肪酸等，生物技术在深度和广度上都取得了很大的进展。1988年，日本由40多家公司组建高度别离系统技术研究联合体，瑞典的Pharmacia，Alfa-Laval等组建了Biolink公司，加强在生物工业下游技术领域的研究开发力量，不断推出新技术、新产品、新装备，以抢占更多的市场。新技术有超临界CO2萃取技术、膜过滤、渗透蒸发技术、各种色谱〔层析〕技术等。4.第三代生物技术20世纪80年代以来，生物工业下游技术进步很快，出现了很多新概念、新技术、新产品和新装备。大致可分为以下几大类：〔1〕固液别离技术〔2〕细胞破碎技术〔3〕初步别离纯化技术〔4〕高度别离纯化技术〔5〕其他新型别离技术近20年来，将在污水处理、化学工程和选矿工程上广泛使用的絮凝技术引入到发酵液的预处理上，研究开发了菌体及悬浮物絮凝技术，改善了发酵液的别离性能，加之纤维素助滤剂的开发，大大提高了发酵液的固液别离效率。在固液别离机械方面，也出现了一些性能优良的新型机械，如带式过滤机、连续半连续板框过滤机、螺旋沉降式离心机等。微滤膜可高效别离细微的悬浮粒子。〔1〕固液别离技术〔2〕细胞破碎技术〔3〕初步别离纯化技术〔4〕高度别离纯化技术〔5〕其他新型别离技术已开发出球磨破碎、压力释放破碎、冷冻加压释放破碎和化学破碎等技术。该技术的成熟使得胞内生物物质的大规模工业化生产成为可能。〔1〕固液别离技术〔2〕细胞破碎技术〔3〕初步别离纯化技术〔4〕高度别离纯化技术〔5〕其他新型别离技术主要开发了沉淀、离子交换、萃取、超滤等技术。较早出现的是酶及蛋白质的盐析法；有机溶剂沉淀法；双水相萃取技术比较适合于胞内活性物质和细胞碎片的别离，为进一步纯化精制创造了前提；超滤技术解决了生物大分子对pH、热、有机溶剂、金属离子敏感等难题，在生物大分子的分级、浓缩、脱盐等操作中得到了广泛的使用。〔1〕固液别离技术〔2〕细胞破碎技术〔3〕初步别离纯化技术〔4〕高度别离纯化技术〔5〕其他新型别离技术小分子物质一般可通过离子交换、脱色和结晶、重结晶等方法获得纯度很高的产品。生物大分子的纯化一直是个难题。20世纪70年代以来，逐渐开发出各种色谱〔层析〕技术，如亲和色谱、疏水色谱、离子交换色谱和凝胶色谱等，后两种技术已开始用于批量生产。〔1〕固液别离技术〔2〕细胞破碎技术〔3〕初步别离纯化技术〔4〕高度别离纯化技术〔5〕其他新型别离技术超临界CO2萃取技术在获得天然生物物质方面有着独特的优势。20世纪80年代以来，已经在许多领域中迅速实现了工业化。如啤酒花中有效成分和咖啡豆中咖啡因的萃取别离。介于反渗透和超滤之间的纳米滤〔Nanofiltration〕技术，由于其能使水和大局部无机盐通过而截留分子量300-1000u的小分子有机物，且操作压力低，在生物工业和水处理中具有广阔的应用前景。渗透蒸发技术、液膜技术及反胶团技术的研究和应用开发等也相继取得了很大的进展。四、生物技术下游加工过程的一般流程和单元操作培养液〔发酵液〕的预处理和固液别离；初步纯化〔提取〕；高度纯化〔精制〕；成品加工。1.一般下游加工过程可分为4个阶段2.下游加工过程的一般流程（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）发酵液初步纯化细胞碎片分离细胞破碎细胞分离高度纯化成品加工预处理胞外产物（加热、调pH、絮凝）（过滤、离心分离、膜分离)（匀浆、研磨、酶解）（离心分离、双水相萃取、膜分离）（重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）（浓缩、无菌过滤、干燥、成型）胞外产物提取精制——产品的收得率和质量控制。下游工艺过程决定于产品的性质和要求到达的纯度如产品为菌体本身，那么工艺比较简单，只需经过滤、得到菌体，再经枯燥就可，如单细胞蛋白的生产。如可以从发酵液直接提取，那么可省去固液别离步骤。如为胞外产物那么可省去细胞破碎步骤。3.单元操作过滤、离心——固液别离；蒸发、蒸馏、结晶——进一步纯化；萃取——浓缩或提取液相中的成分；离子交换、层析、膜技术、超滤；枯燥适合于大规模工业化生产的传统技术经过改造提高后，适应面更宽，效率会更高，仍然显示出强劲的生命力。各种新型高效的过滤机械和离心机械的问世，结晶理论和离子交换技术的新进展，提高了产品的收率、质量和生产效率。五、生物工业下游技术的开展动态——本钱、质量、环保将是该技术开展方向和动力1.传统别离技术的提高和完善1〕新型别离介质的研究开发2〕子代别离技术3〕其他新兴下游技术2.新技术的研究开发膜〔膜材料和膜制造工艺〕、树脂〔离子交换树脂和大网格树脂〕和凝胶〔琼脂糖凝胶为基质，与各种配基结合后制成各种色谱别离介质〕是目前主要的新型别离介质。各种别离纯化技术相互结合、交叉、渗透，形成子代别离技术。如膜技术和萃取、蒸馏、蒸发技术相结合形成了膜萃取技术、膜蒸馏及渗透蒸发技术；色谱技术与离子交换技术等结合形成了离子交换色谱、等电聚焦色谱等。由溶剂萃取技术衍生出一大批生物工业别离技术，如双水相萃取、超临界CO2萃取、反胶团萃取〔细胞碎片去除、细胞胞内物质、酶及蛋白质、天然生物物质的提取别离〕；菌体絮凝技术和菌体细胞破碎技术的进展为工业化经济地别离菌体细胞和大规模生产胞内物质创造了技术前提。3.清洁生产清洁生产是指将综合预防的环境保护策略持续应用于生产过程和产品中，以期减少对人类和环境的风险。包括三方面内容：〔1〕清洁生产工艺〔节约原材料和能源，淘汰有毒害的原材料，无废和少废技术〕〔2〕清洁产品〔使用中和使用后对人体和环境无害〕〔3〕清洁能源〔常规能源清洁利用、可再生能源和新能源的开发利用〕

作业：1.什么是生物工业下游技术？2.试述生物工业下游技术的一般工艺过程。3.什么是清洁生产？主要包括哪些内容？第二章

下游技术的理论根底生物工业下游技术：尚无一个严格意义上的定义，本课程中所涉及的内容有许多在本质上属于物质别离的范畴。因此，本章及后续内容将会经常使用“别离〞一词。别离机理与别离操作利用目标产物与杂质之间在物理、化学、生物学性质上的差异进行别离。往往需利用多种别离机理，实施多步别离步骤。第一节下游技术中的物理学过程一、根底物性“别离〞可利用各种物质固有性质的差异。物性差异越大，利用价值越大。二、分类以物理学过程为根底的别离操作，大致可分为以下三类：1．平衡别离过程建立在相平衡关系上的。利用相的组成差异进行混合物体系的别离。表2—1为平衡别离的代表性单元操作。2．拟平衡别离操作在混合物体系本身所占有的空间之外加一个能引起物质别离的势能场，在它的作用下，形成别离场。如表2—2所示。3．非平衡别离操作1、2以外均划归其中，利用物质移动速度差和广义的、基于“屏蔽效应〞的别离操作。如表2—3所示。第二节下游技术中的化学过程一、化学性分子识别液液萃取：利用物质在溶剂中溶解度不同的别离。如果在萃取溶剂中参加对原料中目标物质有特异性作用的成分(萃取剂、抽提剂)，能到达高选择性。1．分子间相互作用分子间的相互作用力除了众所周知的范德华力、氢键力等，近年来备受注目的分子间作用力是疏水性相互作用力。2．分子识别酶和底物的专一性结合。钥匙和锁的关系。只有底物分子才能进入这个口袋。酶分子正是通过对底物的多点识别才显示出它高效、专一的底物识别功能。

环状糊精也有一定的分子识别功能。

它是由6—8个葡萄糖环状结合而成的低聚糖．筒状，内部具空洞结构。“皇冠醚〞

皇冠醚有多种，均为大环状化合物。中心开孔，一些金属离子和氨基酸分子等正好能进入其中。泡沸石〔无机吸附剂〕具有细孔结构的氧化铝、硅石类陶瓷，孔径接近分子水平时，那么可用做分子筛,对气体分子选择性吸附别离。泡沸石二、下游技术中的化学反响选择性别离纯化：如柠檬酸工业中常用钙盐沉淀，以便于与发酵液中残糖及其他可溶性杂质的别离。利用草酸与Ca2+反响，生成不溶性钙盐可除去杂质Ca2+。产品制造：氨基酸或短肽能络合或螯合某些金属离子生产保健产品。补充人体缺乏又不易被人体吸收的钙、铁、锌等微量元素。山梨醇和木糖醇可以通过葡萄糖和木糖经金属镍催化加氢工艺(高压)获得。第三节下游技术中的生物学过程一、特异性相互作用(锁钥关系〕〔一〕可逆性结合作用〔除共价结合外〕1．离子间的相互作用〔静电作用〕2．氢键结合3．疏水性相互作用4．对金属原子配位5．弱共价键结合影响蛋白质立体构象的环境因素(1)热：热是影响蛋白质构象的最普通的因素。(2)温度：温度的上升，使原子、分子的热运动更活泼，离子间的相互作用、氢键、金属原子配位作用等变弱。但疏水性的相互作用因温度上升而加强。(3)pH：pH对离子间的作用影响很大，pH也对蛋白质侧链上的氨基酸残基的离解度影响很大。(4)静电性的环境变化：如在溶液中参加在水中能离解为阳离子和阴离子的强电解质(如食盐等无机盐)。溶液离子强度增加，离子间相互作用变弱，氢键也受到同样影响。(5)试剂：在试剂中，尿素、盐酸胍、十二烷基磺酸钠等会对蛋白质构象造成影响。尿素或盐酸胍有增加水的介电常数和离子强度的作用，从而影响氢键作用。

二、亲和色谱利用某些生物物质之间特异的亲和力进行选择性别离的色谱技术。

第三章

发酵液预处理目的不仅在于别离细胞、菌体和其它悬浮颗粒〔细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物〕，还希望除去局部可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后继各步操作。采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子的大小，提高其沉降速度；或采用稀释、加热等方法降低黏度，以利于过滤。第一节发酵液的预处理一、发酵液过滤特性的改变微生物发酵液的特性为：发酵产物浓度较低，大多为1-10%，悬浮液中大局部是水；悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；液相粘度大，大多为非牛顿型流体；性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。微生物发酵液的成分极为复杂，其中除了所培养的微生物菌体及残存的固体培养基外，还有未被微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋白质，以及微生物的各种代谢产物。改善发酵液过滤特性的物理化学方法：调酸〔等电点〕、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添加外表活性物质、添加反响剂、冷冻-解冻及添加助滤剂等。1.降低液体粘度

2.调整pH3.凝聚与絮凝

根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，降低液体粘度〔加水稀释法和加热法等〕可有效提高过滤速率。注意加热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。氨基酸、蛋白质等电点的调节；在膜过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整pH值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染；细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。另外，还能有效地除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。凝聚——指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象；絮凝——指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+常用的凝聚剂电解质有：硫酸铝Al2(SO4)3•18H2O〔明矾〕；氯化铝AlCl3•6H2O;三氯化铁FeCl3;硫酸亚铁FeSO4·7H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3〔1〕凝聚发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易别离。絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子〔如---COOH〕或阳离子〔如---NH2〕基团以及不带电荷的非离子型基团。它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的外表。当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒外表上，产生桥架联结时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。〔2〕絮凝高分子絮凝剂的吸附和絮凝作用示意图1〕有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；2〕无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；3〕天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。目前最常见的高分子聚合物絮凝剂有机合成的聚丙烯酰胺〔polyacrylamide〕类衍生物根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：非离子型、阴离子型〔含有羧基〕阳离子型〔含有胺基〕工业上使用的絮凝剂可分为三类：聚丙烯酰胺絮凝剂聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点用量少，一般以mg/L计量；絮凝体粗大，别离效果好；絮凝速度快；种类多，适用范围广。聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。聚丙烯酰胺类絮凝剂的应用医药和食品工业：聚丙烯酸类阴离子絮凝剂〔无毒〕，聚苯乙烯类衍生物，无机高分子聚合物絮凝剂〔聚合铝盐、聚合铁盐等〕，天然有机高分子絮凝剂〔多聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等〕。影响絮凝的因素絮凝剂的加量(图3-1〕絮凝剂的分子量溶液的pH搅拌速度搅拌时间对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理；对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。〔3〕混凝4.参加助滤剂5.参加反响剂一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。悬浮液中大量的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的外表上，改变了滤饼结构，降低了过滤阻力。常用的助滤剂有：硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。使用硅藻土时，通常细粒用量为500g/m3；中等粒度用量为700g/m3；粗粒用量为700-1000g/m3。参加反响剂和某些可溶性盐类发生反响生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固，改善过滤性能；如发酵液中含有不溶性多糖物质，用酶将其转化为单糖，以提高过滤速率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前参加0.025%的淀粉酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提高过滤效率5倍。发酵液中的杂质高价无机离子〔Ca2+、Mg2+、Fe2+〕杂蛋白在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相别离不清。在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。二、发酵液的相对纯化〔一〕、高价无机离子的去除方法Ca2+——草酸、草酸钠，→形成草酸钙沉淀〔注意回收草酸〕；Mg2+——三聚磷酸钠，→形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；Fe2+——黄血盐，→普鲁士蓝沉淀〔二〕杂蛋白的去除方法蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。在酸性溶液中带正电荷；在碱性溶液中带负电荷。在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。1.沉淀法在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉淀。2.变性法

加热大幅度调节pH值加酒精、丙酮等有机溶剂或外表活性剂等。缺乏之处加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。参加某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质；在枯草杆菌发酵液中，参加氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。3.吸附法第二节固液别离工程及设备重力沉降浮选旋液别离过滤离心通气，产生气泡，使固体附着在气泡外表除去。用于固液比重差小、直径5～30μm颗粒的别离，污水处理悬浮液以较高速度沿切线方向进入旋液别离器，轻相由别离器中央排出，重相由别离器下部排出，但不适合直径<5μm颗粒去除〔可用丝网别离器〕。工业上常用霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，发酵液采用过滤方法；细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，其发酵液采用高速离心别离，如对发酵液进行预处理，也可用过滤进行固液别离。一、固液别离的方法优点：别离速度快，别离效率高、液相澄清度好；缺点：设备投资高、能耗大。离心机种类：碟片式离心机、管式离心机、倾析式离心机。1.离心别离在液相非均一系统中，利用离心力到达液－液、液－固、液－液－固别离的方法，统称为离心别离。碟片式离心机是传统离心机，为目前工业上应用最广泛的离心机。别离因数可达1000-20000，最大处理量到达300m3/h，常用于大规模的别离过程。适用范围细菌、酵母菌、放线菌、细胞碎片管式离心机管式离心机是一种别离效率很高的离心别离设备，其转鼓细长，可在15000-50000的高转速下工作，别离因数可达104-6×105。它设备简单、操作稳定。适用范围细胞、细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等。特别适合一般别离机难以别离的固形物含量<1%发酵液的别离。管式离心机工作原理图GF型，用于别离各种乳浊液,特别适用于二相相对密度差甚微的液一液别离以及含有少量杂质的液一液一固别离。别离原理：密度大的液相形成外环，密度轻的液相形成内环，流体到转鼓上部各自的排液口排出，微量固体沉积在转鼓壁上，待停机后人工卸出。GQ型，用于别离各种难于别离的悬浮液。特别适合于浓度小、粘度大，固相颗粒细，固液重度差较小的固液别离。别离原理：密度较大的固体微粒逐渐沉积在转鼓内壁形成沉渣层，待停机后人工卸出，澄清后的液相流动转鼓上部的排液口排出。倾析式别离机是一种靠离心力和螺旋的推动力作用自动连续排渣的离心机。具操作连续、适应性强、结构紧凑和维修方便的优点。别离因数为1500-3000。适用范围特别适合固形物含量较多的悬浮液的别离。因别离因数较低，不适合细菌、酵母等微小微生物悬浮液的别离。〔P53图〕2过滤

定义：

在一定的压力差下，利用多孔性介质截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液别离的方法称为过滤。

通常发酵液的黏度大，其中的微生物体积小，造成过滤的困难。在过滤前，一般需对料液进行絮凝或凝聚等预处理，此外可添加助滤剂提高过滤速度。A.根据过滤机理，过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤。澄清过滤：滤饼过滤：过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒等，当悬浮液通过滤层时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清，适合于固体含量少于0.1g/100ml、颗粒直径在5-100μm的悬浮液的过滤别离，如河水、麦芽汁、酒类和饮料等的澄清。过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维织布、金属织布、玻璃纤维纸、合成纤维等无纺布。当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻拦而逐渐形成滤饼〔滤渣〕。当滤饼至一定厚度时即起过滤作用，此时即可获得澄清的滤液，这种方法叫做滤饼过滤，在滤饼过滤中，悬浮液本身形成的滤饼起着主要的过滤作用，适合于固体含量大于0.1g/100ml的悬浮液的过滤别离。B.常用过滤设备广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液别离。适合于固体含量1-10%的悬浮液的别离。〔1〕板框过滤机板框过滤机板框过滤机1.结构：假设干板，框交替排列，板，框都用支耳架在一对横梁上，用压紧装置压紧或拉开。2.滤板结构：凹凸纹路作用支撑滤布，提供滤液或洗涤液的流道。分为洗涤板和非洗涤板两种。3.滤框结构：有供料浆通过的暗孔，料浆在压差的推动下籍框两侧覆盖的滤布进行过滤别离。4.过滤操作液体流动路径：料浆沿1通道输入，通过滤框的暗孔进入滤框，框中的料浆在压差的推动下籍框两侧覆盖的滤布进行过滤别离。滤饼在框内两侧生成并增长，滤液通过滤布流到滤板板面的凹槽后因板面凹槽有暗孔与2、4通道相连或与3通道相连，故滤液可由三条通道流到过滤机外。优点：真空转鼓过滤机具有自动化程度高、操作连续、处理量大。特别适合固体含量大〔>10％〕的悬浮液的别离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母发酵液或细胞悬浮液的过滤别离。缺点：由于受真空度的限制，不适于菌体较小和粘度较大的细菌发酵液的过滤，且过滤所得固相的干度不如加压过滤。〔2〕真空转鼓过滤机硅藻土的使用方法：作为过滤介质预涂在支持介质上参加到悬浮液中按支撑单元分：板框过滤机，叶片式过滤机等〔3〕硅藻土过滤机1〕切向流过滤〔Cross-FlowFiltration〕又称错流过滤交叉过滤和十字流过滤，是一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特点是使悬浮液在过滤介质外表作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质外表的固体〔滤饼〕移走。2〕双水相萃取向水相中参加溶于水的某些高分子化合物〔如葡聚糖、聚乙二醇等〕后，形成密度不同的两相，轻相中富含某种高分子化合物，重相中富含盐类或另一种高分子化合物，从而到达别离和提纯某种高分子化合物的目的。3〕吸附法向细胞碎片悬浮液中参加某种固体吸附剂，或者用细胞碎片悬浮液通过装有吸附剂的固定床，即可到达除去细胞碎片的目的。主要的问题是很难选择适宜的吸附剂，以保证目的产物不被吸附而损失。3.其他固液别离方法作业：1.名词解释：絮凝；凝聚；混凝2.发酵液中的高价无机离子和杂蛋白可以采用哪些方法去除？3.试述生物工业中常用固液别离设备的原理、特点、及适用范围。第四章

微生物细胞的破碎知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞的破碎技术，破碎率的测定。重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法的原理，操作过程及常用设备，并能就实际生产情况予以合理的选择。难点：常用破碎方法的合理选用。为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构〔表1〕：一、细胞壁的组成和结构细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的巩固；酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。不同种类的细胞结构差异很大，破碎的难易程度也不同，由难到易的大致排列顺序为：植物细胞＞真菌〔如酵母菌〕＞革兰氏阳性细菌＞革兰氏阴性细菌＞动物细胞。二、常用破碎方法细胞破碎机理图进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂〔直径小于1mm〕一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液别离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。1.珠磨法〔Beadmill〕原理：高速珠磨机实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、Braun匀浆器；中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理；在工业规模中，可采用高速珠磨机〔瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造〕。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易别离而给后续操作带来的困难。胶体磨德国进口珠磨机采用高压匀浆器〔由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司和美国Microfluidics公司均有产品出售〕。2.高压匀浆法〔High-pressurehomogenization〕——大规模细胞破碎的常用方法利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。原理：高压匀浆器大、中、小型高压匀浆器在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞，常采用屡次循环的操作方法。一般说来，酵母菌较细菌难破碎，处于静止状态的细胞较处于快速生长状态的细胞难破碎，在复合培养基上培养的细胞比在简单合成培养基上培养的细胞较难破碎。易造成堵塞的团状或丝状真菌较小的革兰氏阳性菌含有包含体的基因工程菌〔因包含体坚硬，易损伤匀浆阀〕不宜采用高压匀浆法的细胞类型：破碎的动力学方程为：ln[1／〔l－R〕]＝KNPα其中R——破碎率；K——与温度有关的速度常数；P一操作压力；N一悬浮液通过匀浆器阀的次数。α——与微生物种类有关的常数；破碎酵母菌,α值可取2.2。可见，影响破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。3.超声破碎法〔Ultrasonication〕一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差，该法在实验室小规模细胞破碎中常用。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。4.酶溶法〔EnzymaticLysis〕〔1〕外加酶法常用的溶酶溶菌酶β-1，3-葡聚糖酶β-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽键内切酶壳多糖酶等溶菌酶主要用于细菌类细胞壁溶解酶是几种酶的复合物如：对酵母细胞采用酶法破碎时，先参加蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再参加葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时假设缓冲液的渗透压变化，那么细胞膜破裂，释出胞内产物。利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。酶溶法的优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差〔不同菌种需选择不同的酶〕，产物抑制的存在。如在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以到达细胞自溶的目的。影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。〔2〕自溶法〔Autolysis〕某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、外表活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性〔渗透性〕，从而使胞内物质有选择地渗透出来。4.化学渗透法〔Chemicalpermeation〕该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。如TritonX-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。其他的外表活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可使细胞破碎。〔1〕外表活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。〔2〕EDTA螯合剂能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。〔3〕有机溶剂〔4〕变性剂盐酸胍〔Guanidinehydrochloride〕和脲〔Urea〕是常用的变性剂。变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。*表示适用通用性差；时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%；有些化学试剂有毒。化学渗透法优点：缺点：对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液别离和进一步提取。将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保存率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。5.其他方法1.X-press法将细胞放在高渗透压的介质中〔如一定浓度的甘油或蔗糖溶液〕，达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中参加某些抑制剂〔如抗生素等〕，使细胞壁有缺陷，强度减弱。2.渗透压法〔Osmoticpressure〕将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复屡次而到达破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复屡次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。3.反复冻结-融化法使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对枯燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。气流枯燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干；真空枯燥多用于细菌。4.枯燥法气流干燥真空干燥喷雾干燥冷冻干燥三、破碎率的测定与破碎技术的研究方向

细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加。1.破碎率的测定直接测定法目的产物测定法导电率测定法采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。将破碎后的细胞悬浮液离心别离细胞碎片，测定上清液中目的产物〔如蛋白质或酶〕的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。细胞破碎与固液别离紧密相关。2.破碎技术的研究方向多种破碎方法相结合与上游过程相结合与下游工程相结合化学法、酶法、机械法相结合。如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100%。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32%。在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数〔如pH、温度、通气量、搅拌转速、稀释率等〕等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。细胞的破碎与上游培养过程有关。用基因工程的方法对菌种进行改造，以提高胞内物质的提取率也是非常重要的。在生长后期，参加某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂〔如青霉素、环丝氨酸等〕，继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎；选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件〔如温度等〕，激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。作业:1.常用细胞破碎方法(珠磨法、高压匀浆法、超声破碎法、酶溶法、化学渗透法)的原理、特点及适用性。2.举例说明采用多种破碎方法相结合提高破碎率的机理。

第五章

溶剂萃取和浸取萃取：利用物质在互不相溶的两相之间溶解度的不同而使物质得到纯化或浓缩的方法。反萃取：调节水相条件，将目标产物从萃取相转入水相的萃取操作。物理萃取：根据相似相溶的原理，溶质在两相间到达分配平衡，萃取剂与溶质之间不发生化学反响的萃取过程。化学萃取:利用萃取剂与溶质之间的化学反响生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相的分配。有机溶剂萃取法广泛应用于抗生素、有机酸、维生素、激素等发酵产物工业规模的提取上。利用一种溶质组分〔如产物〕在两个互不混溶的液相〔如水相和有机溶剂相〕中竞争性溶解和分配性质上的差异来进行别离操作的。有机溶剂萃取比化学沉淀法别离程度高；比离子交换法选择性好、传质快；比蒸馏法能耗低；生产能力大、周期短、便于连续操作、易实现自动化控制。优点溶剂萃取法和其他新型别离技术相结合，产生了一系列新型别离技术：超临界流体萃取〔Supercriticalfluidextraction〕反胶团萃取〔Reversedmicelleextraction〕双水相萃取技术〔Partitionoftwoaqueousphasesystem〕等。用于高品质的天然物质、胞内物质〔胞内酶、蛋白质、多肽、核酸等〕的别离提取上。用某种溶剂把有用物质从固体原料中提取到溶液中的过程称为浸取或浸出。用温水从甜菜中提取糖，用有机溶剂从大豆、花生等油料作物中提取食用油，用水或有机溶剂从植物中提取药物、香料或色素等。几种萃取方法的比较第一节溶剂萃取

一、溶剂萃取过程的理论根底1．物质的溶解和相似相溶原理从热力学角度考虑，一个过程要能自动进行，体系的自由能应下降，自由能的变化包括焓变化和熵变化两局部：

为了简单起见，忽略熵的变化，并忽略压力和体积变化(一般溶解过程压力和体积的变化很小)，这样只要考虑体系能量的变化即可。

溶解过程的三个能量变化过程(1)溶质B各质点的别离；原先是固态或液态的溶质B，先别离成分子或离子等单个质点。此过程需要吸收能量，这种能量的大小通常与分子之间的作用力有关，一般顺序为：非极性物质＜极性物质＜氢键物质＜离子型物质(2)溶剂A在溶质B的作用下形成可容纳B质点的空位；此过程也需要吸收能量，其大小与溶剂分子A之间的相互作用力有关，一般顺序与上述相同：非极性物质＜极性物质＜氢键物质该能量还与溶质分子B的大小有关。(3)溶质质点B进入溶剂A形成的空位；此过程放出能量，放出能量的大小有以下规律：A、B均为非极性分子＜一非极性分子、另一极性分子＜均为极性分子＜B被A溶剂化〔1〕两种惰性溶剂互溶〔2〕水向油中溶解〔3〕油向水中溶解〔4〕水和乙醇的溶解从能量角度分析几种溶解过程：“相似相溶〞原理分子之间可以有两方面的相似：一是分子结构相似，如分子的组成、官能团、形态结构的相似；二是能量(相互作用力)相似，如相互作用力有极性的和非极性的之分，两种物质如相互作用力相近，那么能互相溶解。与水“相似〞的物质易溶于水，与油“相似〞的物质易溶于油就是相似相溶原理的表现。

2．溶剂的互溶性规律物质分子之间的作用力与物质种类有关，包括较强的氢键力和较弱的范德华力。氢键力与化合键能相比较弱，但比范德华力要强得多。按照生成氢键的能力，可将溶剂分成四种类型。(1)N型溶剂不能形成氢键，如烷烃、四氯化碳、苯等,称惰性溶剂。(2)A型溶剂只有电子受体的溶剂，如氯仿、二氯甲烷等，能与电子供体形成氢键。(3)B型溶剂只有电子供体的溶剂，如酮、醛、醚、酯等，萃取溶剂中的TBP(磷酸三丁酯)、叔胺等。(4)AB型溶剂同时具备电子受体A—H和供体B的溶剂,可缔合成多聚分子，因氢键的结合形式不同又可分成三类：

AB(1)型：交链氢键缔合溶剂，如水、多元醇、多元羧酸、多酚等。

AB(2)型：直链氢键缔合溶剂，如醇、胺、羧酸等。

AB(3)型：生成内氢键分子，例如邻硝基苯酚等，这类溶剂中的电子受体A—H因已形成内氢键而不再起作用。故AB(3)型溶剂的氢键性质与N型或B型相似。

3．溶剂的极性溶剂萃取的关键是萃取溶剂的选择，而选择的依据是“相似相溶〞的原那么。“相似〞有两个方面：一是分子结构相似，这相对容易考察；另一个是分子间作用能相似，即分子问相互作用力相似。在生物工业上，对后一点考察较多的是分子极性。介电常数是一个化合物摩尔极化程度的量度，如果介电常数，就能预测该化合物是极性的还是非极性的。物质的介电常数可通过测定该物质在电容器二极板间的静电容量C来决定。根据萃取目标物质的介电常数，寻找极性相接近的溶剂作为萃取溶剂，也是溶剂选择的重要方法之一。一个良好溶剂要满足的要求：(1)有很大的萃取容量，即单位体积的萃取溶剂能萃取大量的产物；(2)有良好的选择性，理想情况是只萃取产物而不萃取杂质；(3)与被萃取的液相互溶度要小，且粘度界面张力小或适中，这样有利于相的分散和两相别离；(4)溶剂的回收和再生容易；(5)化学稳定性好，不易分解，对设备腐蚀性小；(6)经济性好，价廉易得；(7)平安性好，闪点高，对人体无毒性或毒性低。生物工业上常用的溶剂有酯类、醇类和酮类等。

小知识：闪点又叫闪燃点，是指可燃性液体外表上的蒸汽和空气的混合物与火接触而初次发生闪光时的温度。闪点可通过标准仪器测定。闪点温度比着火点温度低些。

燃点又叫着火点，是指可燃性液体外表上的蒸汽和空气的混合物与火接触而发生火焰能继续燃烧不少于5s时的温度。可在测定闪点后继续在同一标准仪器中测定。可燃性液体的闪点和燃点说明其发生爆炸或火灾的可能性的大小，对运输、储存和使用的平安有极大关系。4．分配定律和别离因数分配定律：在一定温度一定压力的条件下，溶质分配在两个互不相溶的溶剂中，到达平衡时溶质在两相中的活度之比为一常数。如果是稀溶液，活度可用浓度代替，那么到达平衡时溶质在两相中的浓度之比为一常数。称之为分配系数K，即有别离因数(β)萃取剂对溶质A和B别离能力的大小可用别离因数(β)来表征：假设原来料液中除溶质A以外，还含有溶质B，那么由于A、B的分配系数不同，萃取相中A和B的相对含量就不同于萃余相中A和B的相对含量。如A的分配系数较B大，那么萃取相中A的含量(浓度)较B多，这样A和B就得到了一定程度的别离。β越大，A、B的别离效果越好，即产物与杂质越容易别离。

5．水相条件的影响

发酵液中存在与产物性质相近的杂质、未完全利用的底物、无机盐、供微生物生长代谢的其他营养成分等。必须考虑这些物质对萃取过程的影响。(1)pH值直接影响表观分配系数。另外对选择性有影响。pH值还应尽量选择在使产物稳定的范围内。(2)温度温度会影响生化物质的稳定性，所以一般在室温或低温下进行。同时影响分配系数K。(3)盐析硫酸铵、氯化钠等可降低产物在水中的溶解度，还能减小有机溶剂在水相中的溶解度。但过多可能促使杂质一起转入溶剂相，必要时要考虑回收。(4)带溶剂能和产物形成复合物，使产物更易溶于有机溶剂相中，提高分配系数。复合物又要容易分解。1〕青霉素萃取 青霉素是有机酸,pH值对其分配系数有很大影响。很明显,在较低pH下有利于青霉素在有机相中的分配,当pH大于6.0时,青霉素几乎完全分配于水相中。从图中可知,选择适当的pH,不仅有利于提高青霉素的收率,还可根据共存杂质的性质和分配系数,提高青霉素的萃取选择性。溶剂萃取应用2〕红霉素萃取 红霉素是碱性电解质，在乙酸戊酯和pH9.8的水相之间分配系数为44.7，而水相pH降至5.5时,分配系数降至14.4。3〕红霉素反萃取 反萃取操作同样可通过调节pH值实现。如，红霉素在pH9.4的水相中用醋酸戊酯萃取，而反萃取那么用pH5.0的水溶液。二、工业萃取方式和理论收得率工业萃取的流程混合分离溶剂回收混合器（如搅拌混合器）分离器（如碟片式离心机）溶剂回收装置（如蒸馏塔）料液F与萃取溶剂S一起参加混合器内搅拌混合萃取，到达平衡后的溶液送到别离器内别离得到萃取相L和萃余相R，萃取相送到回收器，萃余相R为废液。在回收器内产物与溶剂别离〔如蒸馏、反萃取等〕，溶剂那么可循环使用。1.单级萃取萃取器分离器回收器FSRP（产物）使用一个混合器和一个别离器的萃取操作：L理论收得率：E=KVS/VFE:萃取平衡后，溶质在萃取相与萃余相中数量的比值K:分配系数VF：料液体积VS：萃取剂体积例1：利用乙酸乙酯萃取发酵液中的放线菌素D,pH3.5时分配系数K=57。令料液体积为450l/h,单级萃取剂流量为39l/h。计算单级萃取的萃取率。解:单级萃取的萃取因子：E=57*39/450 =4.94

单级萃取率==4.94/〔1+4.94〕=0.832为提高收率常采用多级萃取，多级萃取又有多级逆流萃取和多级错流萃取的区别。

2.多级萃取多级错流萃取流程的特点：每级均加新鲜溶剂，故溶剂消耗量大，得到的萃取液产物平均浓度较稀，但萃取较完全。

混合分离器1混合分离器2混合分离器n料液溶剂萃取液萃余液萃余液萃取液萃取液萃余液溶剂溶剂1〕假设每一级萃取剂流量相等(=L),那么：萃取率=2〕假设每一级萃取剂流量不等,那么各级的萃取因子Ei也不相同,可采用逐级计算法，为：萃余率:萃取率：=1-

’n

例2：利用乙酸乙酯萃取发酵液中的放线菌素D,pH3.5时分配系数K=57。采用三级错流萃取,令料液体积为450l/h,三级萃取剂流量之和为39l/h。分别计算L1=L2=L3=13l/h和L1=20,L2=10,L3=9l/h时的萃取率。解:萃取剂流量相等时，E=1.65 用右侧方程得：1-3=0.946。 假设各级萃取剂流量不等,那么E1=2.53，E2=1.27，E3=1.14，由右式得 1-’3=0.942.所以，1-3>1-’3

单级萃取的萃取率=0.8321-

’n

E=KL/VF多级逆流萃取流程的特点：料液走向和萃取剂走向相反，只在最后一级中参加萃取剂，萃取剂消耗少，萃取液产物平均浓度高，产物收率较高。工业上多采用多级逆流萃取流程。混合分离器1混合分离器2混合分离器n料液产物＋溶剂萃余液萃余液废液溶剂萃取率为:例3：设例2中操作条件不变(L=39l/h),计算采用多级逆流接触萃取时使收率到达99%所需的级数。解：E=KL/VF=4.94;因为收率为99%,即1-n=0.99,那么上式得n=2.74,故需要三级萃取操作。 由计算可知，采用三级逆流接解萃取的收率为99.3%,高于例2的错流萃取,说明多级逆流接触萃取效率优于多级错流萃取.三、乳化和去乳化1．乳化乳化是一种液体(分散相)分散在另一种不相混溶的液体(连续相)中的现象。害处：乳化产生后会使有机溶剂相和水相分层困难，产生乳化后使有机相和水相分层困难，出现两种夹带：①发酵液中夹带有机溶剂微滴，使目标产物受到损失；②有机溶剂中夹带发酵液给后处理操作带来困难。原因：是发酵液中存在的蛋白质和固体颗粒等物质，这些物质具有外表活剂性的作用，使有机溶剂和水的外表张力降低，水易于以微小液滴的形式分散于油相称为油包水型W/O乳浊液；相反，为O/W型乳浊液。

2．破乳化由蛋白质引起的乳化多为O/W型，其粒径在2.5—30微米之间。外表活性剂的亲水基团强度大于亲油基团。破乳方法：1.过滤或离心别离破乳法；2.化学法：加电解质中和离子型乳油液的电荷；3.物理法：加热、稀释、吸附等；4.顶替法：参加外表活性更大，但因其碳链较短难以形成巩固的保护膜的物质，取代界面上的乳化剂；5.转型法：如在O/W中参加亲油性乳化刑，使乳化液有生成W/O的倾向，但又不稳定，从而到达破乳目的。最好的方法是防止乳化，如蛋白质是乳化起因，就应设法去除蛋白质。四、萃取设备简介1．单级萃取设备在单级萃取根本完全的情况下，用一套混合器和别离机即可。2．多级萃取设备(1)脉动筛板塔(2)转盘塔第二节浸取浸取：也称之为浸出，用某种溶剂把有用物质从固体原料中提取到溶液中的过程。一、浸取过程的应用前加工：枯燥：有助于细细胞膜的破裂，溶剂也容易进入细胞内部直接溶解溶质。滚压：将原料滚压成片，使其减小到0.1一0.5mm，那么大豆及许多植物种子的细胞壁极大地破裂，植物油容易进入溶剂。切片：减小水溶剂从水相主体扩散到每个细胞的距离，细胞根本上保持完好，水溶性物质可以通过半透性细胞膜扩散进入水溶剂中，蛋白质和胶体组分因透不过细胞膜而不能溶入水相。二、浸取速率浸取过程：(1)溶剂从溶剂主体传递到固体颗粒的外表；(2)溶剂扩散渗入固体内部和内部微孔隙内；(3)溶质溶解进入溶剂；(4)通过固体微孔隙通道中的溶液扩散至固体外表并进一步进入溶剂主体。一般而言．第一、二两步都很迅速，不是浸取过程总速率的控制性步骤。溶质通过多孔固体的扩散可用有效扩散系数来描述，而有效扩散系数与Fick定律有关。三、浸出的其他问题1．相平衡浸取过程中的相平衡用分配系数KD表示KD＝y/xy——到达平衡时溶质在液相中的浓度x——平衡时溶质在固相中的浓度2．溶剂的选择KD大且对目的物质的选择性高，溶剂的价格应低廉，无腐蚀性，无毒，闪点高，无爆炸性，产品中易去除,容易回收。3．增溶作用原先不溶或难溶性的生物大分子物质向可溶性的、分子量较小的生物物质转变，但不能过度。也有向不溶性转变的。4．固体原料的预处理：如粉碎、枯燥等。萃取操作示意图萃取、洗涤和反萃取操作过程示意图第六章

超临界流体萃取一.序言超临界流体萃取：是将超临界流体作为萃取溶剂的一种萃取技术，它兼有传统的蒸馏和液液萃取的特征，是适用面很广的一门新型别离技术。超临界流体：是状态超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点——临界点后的流体。通常有二氧化碳〔CO2〕、氮气〔N2〕、氧化二氮〔N2O〕、乙烯〔C2H4〕、三氟甲烷〔CHF3〕等。

超临界流体〔SCF〕的特性由以上特性可以看出，超临界流体兼有液体和气体的双重特性，扩散系数大，粘度小，渗透性好，与液体溶剂相比，可以更快地完成传质，到达平衡，促进高效别离过程的实现。超临界流体的密度接近液体，因此具有与液体相近的溶解能力。超临界流体的粘度和扩散系数又与气体相近似，而溶剂的低黏度和高扩散系数的性质是有利于传质的。由于以上特点，超临界流体可以迅速渗透到物体的内部溶解目标物质，快速到达萃取平衡。二、超临界流体的萃取原理真空“溶解〞物质的能力极低。参加超临界气体萃取溶剂〔接近于液体密度〕，溶质的溶解度与真空中的溶解度相比，大幅度增加〔一亿多倍〕。物质之间的溶解能力主要取决于物质分子之间的相似性，一是分子结构相似，二是分子间的作用力相似。而分子结构之间的相似相溶在很大程度上也可以归结到作用能相似上。真空或萃取剂分子密度极低时，溶剂对溶质的作用能极小，溶质的溶解度也就极小了。

在超临界流体萃取中，主要是溶剂流体密度的大幅度增加导致溶剂对溶质的作用力大幅度增加，从而形成了溶解物质的能力，这个特性给溶剂流体回收、溶剂与溶质别离带来方便。在超临界萃取后的别离操作中，可在与萃取温度相同的条件下，降低压力使溶剂的密度下降，引起其溶解物质的能力下降，就可以方便地进行萃取物与溶剂的别离。提高萃取剂选择性的根本原那么是：①按相似相溶原那么，选用的超临界流体与被萃取物质的化学性质越相似，溶解能力就越大。〔P111〕②从操作角度看，使用超临界流体为萃取剂时的操作温度越接近临界温度，溶解能力也越大。三、超临界CO2的溶剂特征１、超临界CO2的相图：在临界点附近，密度线聚集于临界点周围，压力或温度小范围的变化，就会引起CO2密度的大幅度变化。由于CO2溶解、萃取物质的能力与CO2本身的密度成正比，这就意味着只要通过改变压力或温度来改变溶剂CO2的密度，就可以改变其对物质的溶解能力。特性：通过压力或温度的改变可有效地萃取和别离溶质。特点:在临界点附近,密度有很宽的变化范围;温度,压力微调可使密度显著变化２、萃取溶剂CO2的性质无毒，无腐蚀性，不可燃烧，纯度高且价格低。有优良的传质性能，扩散系数大；粘度低，与其他超临界流体溶剂相比，CO2具有相对较低的临界压力和临界温度，适于处理热敏性生物制品和天然物产品。

P114:图6-4；图6-5常用超临界流体的临界性质表

四、SC—C02萃取以及拖带剂的作用１、SC—C02萃取：天然产品中通常含有许多不同的化学成分；对同一天然产品用不同方法或不同萃取剂提取得到的制品，其组分是不同的。逐步增加溶剂C02的溶解能力，可以获得各种质量不同的萃取产物。２、拖带剂的作用：

添加拖带剂即辅助溶剂，可增加物质的溶解度和萃取选择性。如在C02中添加约14％的丙酮后，甘油酯的溶解度增加22倍。纯C02几乎不能从咖啡豆中萃取咖啡因，但在加湿(水)的SC—C02中，因为生成了具有极性的H2CO3，在一定的条件下，能选择性地溶解萃取极性的咖啡因。五、SC—C02萃取流程

SC—C02萃取流程：萃取流程根本上是由萃取工段和别离工段(溶质和C02的别离)组合而成。代表性的三种流程模式图压缩机

萃取釜

制冷MVC-760L

二氧化碳循环泵

六、工业化超临界CO2萃取设备1.国产设备的生产情况南通市华安超临界萃取

海安县石油科技仪器〔南通市华安超临界萃取〕，系中国石油天然气集团〔股分〕公司、中国石油化工集团〔股份〕公司、中国海洋石油总公司定点生产企业，公司具有近四十年研发和生产石油仪器设备的丰富经验。本公司自1989年起，在清华大学、中科院、大专院校等专家学者的关心指导下，主攻超临界CO2萃取设备国产化研制生产，十多年来，已形成中、小试验〔生产〕装置系列化生产能力，产品遍布全国各地，并出口美国、韩国等国家。局部药厂通过该装置生产的新药已报批国家级新药并出口。该装置通过省级鉴定，处于国内领先，主要技术指标和关键设备到达世界同类装置先进水平。该工程已列入国家火炬方案和国家级新产品，企业被评定为江苏省高新技术企业，南通市首批诚信纳税企业。公司技术力量雄厚，设备精良，工艺先进，检测手段齐全。公司实验室备有样机，供用户和科研单位来公司共同开发研究。

该装置采用CO2作添加剂，主要应用：医药、食品、香精、香料等有效成份的提取，精细别离。装置由萃取釜、别离釜、精馏柱、CO2泵等组成。

美晨集团股份美晨集团前身始建于1896年，是中国最早的牙膏专业生产厂家之一，自1993年由广州牙膏厂转为股份制企业——广州美晨股份以来，几经改革创新，股本构成发生了深刻的变化，现已成为“职工控股96%、国家持股4%〞的股份制企业。美晨集团也由单一产业的日化企业开展成为生产经营口腔护理品、食品添加剂、化装护肤品、现代中药、保健品、高新别离技术设备，同时经营房产物业以及进出口业务的多元化、综合性高新科技企业，是经国家工商总局正式审批成立的跨区域、跨行业，集科、工、贸、投资于一体的大型企业集团。

北京超流萃取技术研究所：超临界流体萃取工业化设备完整解决方案

设计、提供工业化超临界连续萃取生产线装置。对外进行专利技术转让。云南亚太致兴生物工程研究所用超临界多元流体萃取取代超临界二氧化碳萃取的技术，一直坚持研究开发至今，公开发表过有关超临界多元流体的文章十余篇，申报创造专利四项，法人代表王振锟担任过火炬方案产业化开发的工程负责人。超临界流体技术领域将迎来廿一世纪的绿色产业革命，其涉及的产业较广，诸如医药、食品、能源、航天、海洋工程、生物技术、化工、轻纺、环保工程等。2.国外设备的生产情况德国伍德公司德国伍德是行业顶级企业。公司创立于1921年，是目前世界十大化工工程公司之一。该公司原是工程师Uhde开办的设计所，后来为大化工公司赫斯特〔HOECHST〕收买。赫斯特集团内各子公司实行专业分工，有各类化工产品生产厂，化工设备制造厂，以及多达4000名科研人员的研究中心和职工教育训练中心等，而伍德公司那么是赫斯特的专业设计公司。伍德公司的工程设计部门有职工2100人，承包炼油、合成氨、化肥、有机化工原料、合成树脂、合成纤维、氯碱、酿造食品、环境保护和核技术等方面的工程建设，是一个比较全面的化工工程公司。它的氯碱、硝酸、黄磷、乙醛等技术，在世界上享有很高的声誉。它曾为50余个国家和地区承包过各处化工装置的建设。每年在三十几个工程地点开展工作，年营业额3-5亿美元。美国SupercriticalProcessingInc.七、超临界流体萃取技术的应用1〕生物活性物质和生物制品的提取2〕超临界状态下的酶促反响3〕SC—C02的细胞破壁技术4〕超临界流体枯燥技术2〕SC—C02作为酶促反响介质的优点①与水相比较，脂溶性底物和产物可溶于SC—C02中，酶蛋白不溶解，有利于三者的别离。②产品回收时，不需要处理大量的稀水溶液，因而不产生废水污染问题。③与其他非水相有机溶剂中的酶催化反响相比，SC—C02更适合与生物、食品相关的产品体系，产物别离简单。④与萃取一样，SC—C02中的质量传递速度快，在临界点附近，溶解能力和介电常数对温度和压力敏感，可控制反响速度和反响平衡。3〕SC—CO2的细胞破壁技术SC—CO2的以下一些性质有利于细胞破碎：①在近临界点，SC—CO2的微小压力变化导致其体积变化很大，其能量变化很大，所以SC—CO2可破坏较厚的细胞壁，如常见的酵母等。②SC—CO2对细胞壁中的少量脂类有萃取作用，会破坏细胞壁的化学结构，造成细胞壁在某些位置上的损坏。这种方式破坏的细胞壁碎片较大，使下游别离过程易于进行。③SC—CO2节流膨胀是吸热降温过程，这个性质可防止通常破碎过程升温而引起的热敏性物质的破坏。4〕超临界流体枯燥技术在超临界状态下，溶液不存在外表张力，因此采用超临界CO2萃取枯燥时，即脱除水或其他溶剂的过程中，不存在因毛细管外表张力作用而导致的微观结构的改变〔如孔道的塌陷等〕，可以得到粒径很小、分布均匀的药物颗粒。实例1：从咖啡豆中除去咖啡因大量饮食咖啡因对人体有害。以往工业上除咖啡豆中咖啡因采用二氯乙烷萃取。缺点有二：其一，残留二氯乙烷影响咖啡品质；其二，二氯乙烷同时将局部有用香味物质〔芳香化合物〕带走。超临界流体萃取除咖啡因：先用机械法清洗咖啡豆，去除灰尘和杂质;接着加蒸汽和水预泡，提高其水分含量达30%~50%;然后将预泡过的咖啡豆装入萃取罐，不断往罐中送入CO2(操作湿度70~90℃，压力16-20MPa，密度0.4~0.65g/cm2)，咖啡因就逐渐被萃取出来。带有咖啡因的CO2被送往清洗罐，使咖啡因转入水相。然后水相中咖啡因用蒸馏法加以回收，CO2那么循环使用。10小时，经SFE处理后的咖啡豆中咖啡因含量从0.7-3%降低到0.02%。实例2：啤酒花萃取啤酒花中的有用成份是挥发性油和软树脂中的葎草酮及α-酸采用超临界流体萃取法制造啤酒浸膏时，首先把啤酒花磨成粉状，使之更易与溶剂接触。然后装入萃取罐，密封后通入超临界CO2，操作温度35~38℃，压力8~30MPa。到达萃取要求后，浸出物随CO2一起被送至别离罐，经过降压别离得到含浸膏99%的黄绿色产物。据报道，虽然用超临界法萃取啤酒花的本钱较常规溶剂处理法的本钱高，但用前者得到的是高质量、富含风味物的浸膏，同时防止了使用可能致癌的化学物质。实例3：萃取制备天登烟净油天登烟是云南大理州地区所种植生产的一种独特的烟草品种，其色、香、味、状都独具特色，属于云南地区的地方品种晾晒烟。天登烟是一种特色化的天然香料原料，所以选择其作为原料，试验开发特色化的烟草香料产品。天登烟净油含有大量的烟草特征致香成份如：茄酮、BETA-大马酮、BETA-二氢大马酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮、ALPHA-紫罗兰醇、茄那士酮、新植二烯、六氢金合欢酮等，这些成份是烟草烟气香味重要的特征成份。使用超临界CO2流体萃取制备天登烟净油500g天登烟叶原料样品与80g夹带溶剂混合后填装入萃取装置。萃取温度45℃，压力25 Mpa，夹带溶剂添加量0.5ml/min，流体流速5L/h，萃取时间3h。萃取物进行枯燥脱水，减压蒸馏除去溶剂后，浓缩物即为天登烟净油。实验局部

超临界CO2流体萃取天登烟叶得到提取物为黄褐色溶液。进行减压蒸馏浓缩物为红褐色澄清透亮的半膏体。净油得率为3.6-4.3%。作业：第五章

1.概念：溶剂萃取，反萃取，物理萃取，化学萃取，浸取，乳化

2.工业上溶剂萃取的操作方式分别有哪几种？试简述其区别。3.常用的去乳化方法有哪些？4.利用乙酸乙酯萃取发酵液中的放线菌素D,pH3.5时分配系数K=57。采用三级错流萃取,令料液体积为450l/h,三级萃取剂流量之和为39l/h。分别计算L1=L2=L3=13l/h和L1=20,L2=10,L3