丙泊酚对发育期大鼠皮质神经元钙离子的影响

丙泊酚对发育期大鼠皮质神经元钙离子的影响全身麻醉药是否导致发育期中枢神经系统毒性是近年来深受关注的热点问题。丙泊酚是临床常用的静脉麻醉药物,具有起效迅速、作用时间短、苏醒快、易控制和副作用少等优点,广泛应用小儿麻醉和重症监护室。但越来越多的在体或离体动物实验证实,静脉麻醉药丙泊酚对发育期神经系统具有毒性作用。丙泊酚对发育期大脑神经毒性的机制目前仍然不清楚,其中一个可能的机制是引起了神经元内钙稳态的絮乱。发育期神经元有其特殊的生理特征,本研究拟通过体外培养的发育期神经元,研究丙泊酚对发育期皮质神经钙离子的影响。实验主要分为两部分:一,优化和改进体外培养的原代发育期皮质神经元方法,观察和鉴定发育期神经元,培养纯度高、活力好的神经元,能够满足下一步实验的要求。二,激光共聚焦显微镜下观察Fluo-4AM荧光染色后发育期皮质神经元形态学变化;检测不同浓度的丙泊酚(10、30、100μmol/L)对大鼠发育期皮质神经细胞内钙离子浓度的变化,评估丙泊酚对发育期皮质神经细胞L-型钙离子通道的影响。第一部分新生大鼠皮质神经元原代培养方法目的建立一种稳定、高效、简单可行的新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法。方法取新生24h内的SD大鼠,分离皮质,采用木瓜蛋白酶消化、实验前多聚赖氨酸铺板、不同机械吹打次数及细胞接种2h后全量换为添加B-27的NeurobasalA培养基的培养方法,MTT比色法分析检测神经元细胞成活率;于不同时间在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态;利用神经元特异性标志物微管蛋白相关标志物2(microtubuleassociatedprotein2,MAP2)鉴定神经元纯度。结果木瓜蛋白酶明显增加原代培养神经元细胞活力(P<0.01),采用适度的机械吹打、实验前多聚赖氨酸铺板及细胞接种2h后全量换为添加B-27的NeurobasalA培养基,对神经细胞的活力没有明显的影响(P>0.05)。大部分皮质神经元具有典型的神经元形态特征;经MAP2免疫荧光技术鉴定神经元神经元所占比例达95%以上,能够满足进一步的实验要求。结论该方法操作简单、高效、方便可行,结果稳定。第二部分丙泊酚对发育期大鼠皮质神经元钙离子的影响目的观察不同浓度丙泊酚对大鼠发育期大脑皮质神经元钙离子([Ca2+]i)的影响,检测丙泊酚对发育期皮质神经细胞L-型钙离子通道的影响。方法原代培养7天的大鼠皮质神经元,随机分为4组:对照组(Control组)、丙泊酚10μmol·L-1组(P10组)、丙泊酚30μmol·L-1组(P30组)、丙泊酚100μmol·L-1组(P100组);尼非地平干预实验分组:对照组(Control组)、丙泊酚组(Propofol100μmol·L-1组)、尼非地平组(Nifedipine10μmol·L-1组)、丙泊酚+尼非地平组(Nifedipine(10μmol·L-1)+Propofol(100μmol·L-1)组),Fluo-4AM钙荧光指示剂染色,激光共聚焦显微镜下动态检测基础值、丙泊酚预处理后和氯化钾溶液诱发细胞内钙离子浓度的变化。结果培养7天的大鼠各组皮质神经元基础值、丙泊酚预处理各组钙荧光强度间比较差异无统计学意义(P>0.05);丙泊酚预处理后钙荧光强度同基础值比较差异无统计学意义(P>0.05);氯化钾诱发后各组钙荧光强度明显高于基础值(P<0.01);P30、P100组与Control组比较氯化钾诱发后钙荧光强度峰值明显降低(P<0.01),分别下降了26.3%和28.6%;P30、P100与P10组比较明显降低(P<0.01),P10组与Control组比较差异无统计学意义(P>0.05),P100与P30组比较差异无统计学意义(P>0.05)。尼非地平干预实验中,高钾刺激细胞钙荧光强队明显升高(P<0.01);丙泊酚预处理后,氯化钾诱发细胞内钙荧光强度峰值与对照组组比较,明显降低(P<0.01)。尼非地平预处理神经元25min后,细胞内钙离子荧光强度与对照组比较明显降低(P<0.01)。