不结球白菜自交不亲和相关基因及转录组分析

不结球白菜自交不亲和相关基因及转录组分析不结球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensisMakino),原产中国,是一种重要的十字花科蔬菜。自交不亲和性是显花植物在长期的进化过程中形成的一种避免自交,促进异交的遗传机制。利用自交不亲和系进行杂种生产是不结球白菜等十字花科蔬菜作物杂种优势利用的主要方式。同时,自交不亲和系统还是研究植物细胞间信号转导的理想模型。但自交不亲和机理在很大程度上仍然是未知的。课题组前期鉴定了一个可能在不结球白菜自交不亲和反应中发挥重要作用的蛋白:衰老相关半胱氨酸蛋白酶(senescence-associatedcysteineprotease,SCP),命名为BcSCP,本研究通过构建BcSCP的柱头特异表达载体,研究了该基因对花粉萌发的影响;对不结球白菜授粉前及授粉后的柱头进行了转录组分析;对不结球白菜自交不亲和性研究相关内参基因进行了筛选;利用大白菜基因组信息,对BrPUB基因家族进行了分析。主要研究结果如下:1.不结球白菜SCP基因的功能分析利用柱头特异表达的SLR1(S-locusrelated-1)启动子构建了SCP基因的柱头特异表达载体,酶切鉴定结果表明SCP载体构建成功,采用电转法转入农杆菌GV3101菌株,通过花序侵染法将载体进行拟南芥遗传转化,通过基因组PCR鉴定说明构建的表达载体已成功插入拟南芥基因组中。激光共聚焦显微镜观察柱头发现绿色荧光蛋白在柱头有强烈的表达,T1代转基因拟南芥荧光显微分析显示在柱头过量表达BcSCP对花粉管萌发和延伸无明显影响。2.不结球白菜亲和/不亲和授粉早期转录组分析为了鉴定不结球白菜花粉-柱头相互作用的关键基因,本研究以不结球白菜’矮脚黄,自交亲和系及自交不亲和系为材料,对亲和授粉和不亲和授粉10min后的柱头进行了测序,并将测序结果比对到大白菜基因组上。平均每个样品获得65.42百万个原始标签序列,平均72.5%的序列能够比对到白菜基因组。对转录组数据差异表达基因进行分析,筛选得到511个差异表达基因,其中,493个基因上调,18个基因下调。差异表达基因的功能注释和代谢途径分析表明亲和反应与不亲和反应涉及不同的通路。通过对不结球白菜自花及异花授粉早期转录组分析,为亲和及自交不亲和反应的深入研究提供了丰富的资源。3.实时荧光定量PCR分析中不结球白菜花内参基因的筛选和验证本研究以不结球白菜自交亲和系和自交不亲和系为材料,系统性地分析了13个候选内参基因的表达情况。用两个RT-qPCR分析软件geNorm和NormFinder评估了候选基因的表达稳定性。研究显示,内参基因的选择取决于样品的特异性。在本研究中,当分析所有样品时DNAJ、UKN1和是表达最稳定的内参基因。CYP和ACP这两个被广泛应用的内参基因在本研究的大多数花组织样品集中均被鉴定为最不稳定。为了进一步证明本研究得出的结论,我们分析了两个在花粉-柱头相互作用中扮演着重要角色的基因SRK和Exo70A1的表达情况。本研究系统地分析并筛选适用于自交不亲和性研究的内参基因,为我们进一步在不结球白菜中研究自交不亲和性机理奠定了基础。4.基于全基因组的大白菜PUB基因家族鉴定与分析PUB(PlantU-box)基因一直都是挖掘自交不亲和反应关键基因的候选目标。本研究对大白菜中的PUB基因进行了系统深入的研究,从大白菜中鉴定到了101个BrPUB基因,并将它们锚定到大白菜的10条染色体和三个亚基因组上。通过系统发育树分析,结合BrPUB基因的结构域特点,将它们分为10组。我们选取了15个代表性物种,和大白菜一起对PUB基因的进化做了初步分析。大白菜和拟南芥有22个直系同源基因对,并且BrPUB基因的扩增主要源于基因组三倍化事件。此外,利用大白菜的RNA-seq