产酶溶杆菌转录因子LeClp调控几丁质酶和次级代谢产物生物合成的机制研究

产酶溶杆菌转录因子LeClp调控几丁质酶和次级代谢产物生物合成的机制研究产酶溶杆菌OH11(LysobacterenzymogenesOH11)是本实验室于2003年从辣椒根际土壤中分离到的一株具有自主知识产权的重要生防细菌,其能产生胞外几丁质酶、抗真菌代谢产物HSAF、抗细菌活性物质WAP-8294A2等胞外酶和次级抗菌代谢产物,对多种植物病原菌均有较强的抑制能力,具有十分广阔的生防应用前景。LeClp(cAMP-receptorlikeprotein)是一类重要的转录调控因子。在本实验室的前期研究中发现,LeClp在产酶溶杆菌OH11中可调控3种生防因子(HSAF、WAP-8294A2和胞外几丁质酶)的生物合成,但相应的机制未知。本文以产酶溶杆菌OH11为对象,深入研究了LeClp对上述3种生防因子发挥调控作用的机制,取得了如下结果:构建LeClp蛋白的原核表达载体,并对LeClp蛋白的诱导及纯化条件进行优化,得到了大量的纯化的LeClp蛋白,这为后续进行其他相关实验,如凝胶阻滞电泳(EMSA)打下了良好的基础。同时利用微量热泳动技术(MST)检测了LeClp蛋白与细菌第二信使c-di-GMP之间的结合作用。结果显示:产酶溶杆菌OH11中的LeClp可以结合c-di-GMP,表明LeClp是一个c-di-GMP的受体,揭示其调控作用的发挥与胞内的c-di-GMP含量有关。本实验室前期工作发现,Leclp突变株无法产生胞外几丁质酶,但具体的分子和生化机制未知。chiA是产酶溶杆菌OH11中已鉴定的一个负责胞外几丁质酶生物合成的关键基因。本研究通过生物信息学发现在chiA的启动子区可能具有LeClp蛋白的结合位点,并通过细菌单杂交、EMSA和ChIP-PCR(染色质免疫沉淀-PCR)这三种手段进一步确认了LeClp在体内和体外对chiA的启动子区的直接结合。同时发现在所测实验条件下,c-di-GMP并未影响LeClp与启动子的结合过程,暗示LeClp对chiA的转录调控可能并不依赖胞内的c-di-GMP。重要的是,我们发现LeClp对chiA的这种直接转录调控方式可能也是其他产几丁质酶的溶杆菌种采用的一种保守调控机制。pks/nrps是HSAF生物合成的一个关键基因,其敲除突变体完全不产HSAF。本研究通过生物信息学分析发现pks/nrps启动子区含有LeClp潜在的结合位点,揭示LeClp可能是通过直接结合启动子的方式来调控HSAF的生物合成的。细菌单杂交和EMSA等实验表明:LeClp蛋白可直接结合在pks/nrps的启动子来调控HSAF的生物合成。在所测条件下,c-di-GMP并未影响LeClp与启动子的结合,揭示c-di-GMP可能未参与LeClp对HSAF生物合成的调控过程。另外,我们通过转录组测序并结合生化试验,表明LeClp作为下游因子,介导了LesR(孤立LuxR蛋白)调控HSAF的过程。WAP-8294A2是产酶溶杆菌OH11合成的一种抗革兰氏阳性细菌的次生代谢产物,其生物合成也受到了LeClp的调控。本研究通过RT-PCR鉴定了WAP-8294A2合成基因簇的启动子区,进而采用细菌单杂交发现LeClp不是通过直接结合启动子区的方式来调控WAP-8294A2的生物合成的,这与LeClp调控HSAF的生物合成的方式完全不同。随后,我们开展了LeClp体内结合基因启动子区的ChIP-Seq实验,鉴定了LeClp体内直接调控的靶标基因及其参与的生物学功能。在此基础上,我们通过细菌单杂交和EMSA,鉴定了受L