出芽短梗霉发酵麦麸制备阿魏酰低聚糖及其生物活性研究

出芽短梗霉发酵麦麸制备阿魏酰低聚糖及其生物活性研究阿魏酰低聚糖(FOs)是一类广泛存在于禾本科植物中的不同糖链位置上的羟基与阿魏酸(FA)羧基酯化形成的具有显著抗氧化活性的功能性低聚糖。面粉加工过程中产生的麦麸是制备FOs重要来源。FOs具有阿魏酰基与亲水性的低聚糖基团,兼具水溶性和耐热性,在保健食品中具有广阔的应用前景,但其高效制备技术有待深入研究。本研究筛选能发酵麦麸产FOs的菌株,研究培养基成分及发酵条件对发酵菌株生成FOs和半纤维素酶系的影响,并比较研究一段式与二段式联合调控温度和pH的发酵制备FOs工艺,鉴定两种发酵工艺制备FOs的组成及结构差异,及其体内外抗氧化、抗肿瘤活性。主要研究结果如下：1.通过初筛和复筛从面粉厂周边的土壤中选育出能产FOs的菌株2012,根据其形态特征、ITS序列及系统发育分析,鉴定为不产黑色素为特征的出芽短梗霉(Aureobacidiumpullulans).在pH5.5、60g/L的麦麸液中,出芽短梗霉菌株2012的FOs产量达到545nmol/L)木聚糖酶(Xyln)、阿魏酸酯酶(FAE)活性分别为64.12、0.14IU/mL,发酵后麦麸结构出现断裂、舒散变化,形成空腔,其内壁结构出现明显的破散现象。2.选育出的出芽短梗霉在麦麸培养基中生长时能够合成分解麦麸半纤维素的酶系,其中Xyln主要分布在细胞外,可由麦麸、木糖、木聚糖诱导产生,被葡萄糖和蔗糖所抑制。木糖糖苷酶主要分布在胞内,由麦麸、木糖、木聚糖诱导,蔗糖、葡萄糖和乳糖则抑制之。阿拉伯糖苷酶在含麦麸和木聚糖的发酵基质中胞内、胞外均有分布,在其它碳源中不产生；FAE主要为胞外酶,在葡萄糖和蔗糖发酵基质中不产生。FOs产量与Xyln活性有极显著正相关(r=0.992),木糖糖苷酶和FAE的产生有显著正相关(r=0.966),FOs产量与木糖糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、FAE的活性呈正相关。在以麦麸作为唯一碳源时,随其浓度的升高,Xyln活性和FOs产量随之增加,质量浓度为50～60g/L的麦麸液有利于Xyln的合成和FOs的制备。适量的木聚糖和蛋白胨均能促进Xyln的合成及FOs的生成,添加金属离子和表面活性剂未能提高该菌发酵系统中FOs产量。发酵制备FOs的最佳培养基组成为：60g/L麦麸液中添加10g/L木聚糖和1g/L蛋白胨,利用该培养基进行液态发酵,FOs产量达774nmol/L.3.研究了发酵条件对出芽短梗霉发酵麦麸制备FOs的影响,经P-B试验筛选出对FOs产量影响呈显著正效应的因素有：起始pH、接种量、发酵温度；经中心组合试验优化后,在控制起始pH6.0、接种量4.50%、发酵温度29℃的最优试验条件下,出芽短梗霉发酵液中FOs含量达到904nmol/L,与预测值相符。控制起始发酵pH4.0、起始温度33℃,在发酵至36h时,将pH和温度分别调控为6.0和29℃,进行二段式联合调控温度和pH发酵制备FOs,在发酵至84h时达到FOs的峰值1123nmol/L,较一段式工艺提高24%,且提前12h出峰。4.将采用一段式发酵工艺(FOs1)及二段式联合发酵工艺(FOs2)所制备的发酵液经醇沉、AmberliteXAD-2分离后,进行液相色谱及气相色谱分析,结果表明,两种工艺制备的FOs均由木糖、阿拉伯糖和FA三种成分组成。紫外光谱分析表明,两种FOs在MOPS缓冲液中在325nm处均具有最大值。红外光谱分析表明,两种FOs中均存在羟基、酯键及阿拉伯糖基等特征基团。电喷雾电离质谱分析表明,FOs1聚合度分别为5、4、3、2,由分子量分别为986、854、722、590的阿魏酰阿拉伯糖基木五糖(FAX5)、FAX4、FAX3、FAX2四组分构成。FOs2聚合度分别为6、5、4,由分子量分别为1118、986、854的FAX6、FAX5、FAX4构成,组分纯度和聚合度均高于FOs1。5.研究了FOs1和FOs2对体外大鼠红细胞溶血、大鼠肝组织匀浆及肝线粒体MDA生成的影响。FOs1和FOs2在0.5～10mg.mL-1范围内能抑制大鼠红细胞溶血,抑制大鼠肝组织匀浆及肝线粒体MDA的生成,具有量效关系,说明FOs1和FOs2具体外抗氧化效果,且FOs2效果好于FOs1。FOs1和FOs2随着剂量的增加可提高S180荷瘤小鼠血清中SOD和GSH-Px活性,降低MDA含量,从而提高其体内抗氧化活性。当剂量达到250mg·kg-1·d-1时,FOs2较5-FU和FOs1更有利于促进荷瘤小鼠体内抗氧化能力的提高。采用MTT法检验了FOs1和FOs2对人肝癌细胞HepG2.人胃癌细胞BGC-823、人肺腺癌细胞A549的抗肿瘤活性。结果表明,两种物质对三株肿瘤细胞均有体外抑制作用,且FOs2的抑制效果优于FOs1,并对人肝癌细胞HepG2的抑制效果最好,当FOs2浓度为1mg/mL时,对其抑制率可达50.8%。对给药后的肿瘤细胞进行可见光形态学观察后发现,细胞株给药后肿瘤细胞变圆、变小、浮起,细胞间变松散,增殖速率减缓。通过研究FOs1和FOs2对S180荷瘤小鼠抑瘤率、胸腺指数、脾脏指数、免疫功能因子IFN-γ和IL-3的影响及对肿瘤进行切片HE染色观察,探明FOs1和FOs2体内抗肿瘤活性。FOs1和FOs2对S180荷瘤小鼠体内肿瘤有很好的抑制效果,250mg·kg-1.d-1剂量组的FOs2抑制率达到44.55%,HE