发酵工程课件

第八章典型培养过程传统微生物培养重组菌培养动物细胞培养传统微生物培养前面已讲述很多，本章着重在后两方面的介绍典型培养过程第一节基因工程菌培养一、概述基因工程菌生产的主要产品有二类，蛋白质和非蛋白质。非蛋白质产物可以通过代谢工程细胞来获得，这些细胞插入编码酶的DNA，产生新的途径或增强某一途径，从而得到新的化合物或增加产量。现代基因工程重点在蛋白质产物上，主要产品如下：典型培养过程基因工程菌培养细胞因子、疫苗、酶典型培养过程基因工程菌培养

产品最主要的用于人的治疗，此外还有用于畜牧业、食品或工业用的生物催化剂。用于注射用的治疗蛋白要求高度纯化，由于病人可能产生的强的免疫反应或副作用是灾难性的。有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基化、磷酸化后才有活性。治疗蛋白最主要的是保证产品的质量和安全，降低成本并不重要，由于这些产品大多用量很小，价格高，附加值高。典型培养过程基因工程菌培养二、宿主-载体系统

构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统，一般希望翻译后的处理要简单，如果用于食品要考虑宿主菌是否列入FDA表中，列入的认为是安全的菌。常用的宿主系统有：大肠杆菌

G+细菌低等真核细胞哺乳动物细胞典型培养过程基因工程菌培养1、大肠杆菌如果产品翻译后不需要修饰，大肠杆菌是最普遍选用的宿主。优点：人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基因操作；大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高细胞浓度（50g/l）；大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。典型培养过程基因工程菌培养这些因素给大肠杆菌许多经济上的优势。但大肠杆菌不是完美的宿主。主要问题是大肠杆菌分泌(secretion)的蛋白通常在细胞内，当这些蛋白达到高浓度时，会被水解或形成不溶的包含体。其中主要是外源蛋白，但也含有其它细胞物质。包含体中的蛋白是不折叠的，不折叠的蛋白没有生物活性，必须重新溶解并使它复性。大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响应。热冲击调节子的一种响应是增加蛋白水解酶的活性。在一些情况下，细胞内蛋白水解酶是使蛋白的降解速率几乎等于产生的速率。典型培养过程基因工程菌培养2、G+细菌

枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是G+菌，它没有外膜，并且能把蛋白分泌（excretion）到胞外。它的这一性质对生产非常有吸引力。然而枯草杆菌有许多问题妨碍它在商业上的采用。主要是枯草杆菌产生大量的蛋白酶，会很快降解产物。而且枯草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差，所以在使用上有较大的限制，典型培养过程基因工程菌培养3、低等真核细胞酵母菌酿酒酵母是第一个被人利用的生物，它的最大生长速率是大肠杆菌的25%，酵母比最大的细菌大，容易从发酵液中回收。酵母有简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。这些是它的优点。但酵母达到高表达水平比大肠杆菌困难，外源蛋白分泌到胞外也有限，现在发展了其他的酵母如甲醇营养型酵母等。当产生是外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译后修饰时，低等真核细胞就不能适应，要用动物细胞组织培养来达到。典型培养过程基因工程菌培养4、哺乳动物细胞哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排列，而且所有转录后处理与在整个动物中相同，在某种情况下可能转录后修饰有些不同但它可提供最接近于天然副本的产物，此外多数产物可以分泌到胞外。但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋白表达水平较低。用于重组DNA生产蛋白的最常用的宿主是CHO（中国仓鼠卵巢细胞）。典型培养过程基因工程菌培养三、利用基因工程菌生产的特点基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质粒上也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳定。丢失外源基因的菌往往比未丢失的菌生长快得多，这样就会大大降低产物的表达。为了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压力，如抗生素。基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物表达。典型培养过程基因工程菌培养四、基因不稳定性生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳定性。基因的不稳定性原因：分离丢失、结构不稳定性宿主细胞调节突变典型培养过程基因工程菌培养1、分离丢失

当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出现分离丢失。质粒可分为高拷贝质粒（>20拷贝/细胞）和低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质粒，几乎所有子细胞接受一些质粒，也有可能有的细胞没有接受质粒，当然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百万细胞分裂中一个）。典型培养过程基因工程菌培养但在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在无质粒细胞，例如1000L发酵液，每毫升有109个细胞，总共就有1015个细胞，那么在这个反应器中就含有109个无质粒细胞。质粒的分离丢失可能受许多环境因素影响，如溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀释速率。许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒附着在一起形成一个单位。典型培养过程基因工程菌培养典型培养过程基因工程菌培养2、质粒结构不稳定性

除了分离不稳定性问题外，某些细胞保留质粒，但质粒结构发生改变，而不产生外源蛋白，减少对细胞的有害影响，这就是结构不稳定性。如果质粒发生突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基中生长。而且由于不合成外源蛋白，生长得比原来的工程菌更快，使得在这种培养物中带有改变了的质粒占统治地位的菌，这种培养情况就是结构不稳定性。典型培养过程基因工程菌培养3、宿主细胞突变

宿主细胞的突变也会造成生产能力的减少。这些突变通常改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子，通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG）来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的表达。典型培养过程基因工程菌培养4、生长速率占优势的不稳定性所有这三种因素的关键是改变了的宿主载体系统和原宿主-载体系统的生长速率不同。如果改变了的宿主载体系统比原来的宿主-载体系统有生长优势，那么改变了的系统将最终占优势，基因不稳定性就出现。表达的诱导基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要有：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。典型培养过程基因工程菌培养五、重组大肠杆菌的高密度培养策略关键点：高密度、高表达菌密度的测定：光密度（OD值或A值）在波长600～660菌生长的障碍是重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长缓慢重组蛋白不能分泌到胞外，外源蛋白在菌体内合成后就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作用，甚至会导致细胞中毒或死亡,因此工程菌的比生长速率往往远小于宿主菌。典型培养过程基因工程菌培养高表达的障碍是：外源基因的不稳定，造成表达的下降。高生长速率与高表达之间的矛盾乙酸的产生蛋白的降解典型培养过程基因工程菌培养高密度培养的措施分批补料培养以分批培养为基础，吸取了连续培养的优点，可消除高浓度底物对细胞生长的抑制作用，还可弥补低浓度底物限制细胞生长的缺陷，从而有效地控制了菌体的生长过程。因此，要实现重组大肠杆菌的高密度培养，最常用和最有效的方法就是分批补料流加培养法。现在常用的是反馈补料培养。有几种反馈控制控制基质浓度流加恒pH流加恒溶氧流加控制比生长速率的葡萄糖流加典型培养过程基因工程菌培养典型培养过程基因工程菌培养1、控制基质浓度流加用专门的电极维持基质浓度（如葡萄糖、乙酸、氨等）。以葡萄糖为例，用葡萄糖电极检测发酵液中的葡萄糖含量，葡萄糖电极通过反馈系统与补糖单元相连。当葡萄糖浓度在设定值之上，糖阀关闭；当葡萄糖浓度由于菌体消耗低于设定值时，糖阀开启，葡萄糖以一定速率加入。这样，发酵液中的葡萄糖浓度始终保持恒定，可避免葡萄糖的抑制效应，达到很高的细胞浓度。典型培养过程基因工程菌培养2、恒pH流加大肠杆菌在LB培养基上生长，pH会上升。这是由于菌体分解LB培养基中的胰蛋白胨，造成氨积累的原因。因此用葡萄糖代替酸液进行恒pH流加。实验通过pH反馈控制系统流加葡萄糖，使pH恒定，结果推迟了比生长速率的降低时间，细胞密度是无流加的2倍。可以以葡萄糖代替酸液，以氨水代替氢氧化钠碱液，同时流加氨水和葡萄糖。这种方法的缺点是葡萄糖浓度往往不易控制，容易产生乙酸，对某些工程菌不适宜。典型培养过程基因工程菌培养3、恒溶氧流加用复膜氧电极来控制补糖。当培养液的氧饱和百分数高于控制点，糖阀开启，以一定速率补糖。加入的糖被菌利用则需要更多的氧，从而减少氧饱和百分数，引起读数下降。当读数下降到控制点以下，糖阀关闭，需氧就会随之减少，氧的饱和百分数逐渐上升，从而达到供需平衡。Konstantinov等进一步发展了这种方法，用DO-state法间歇流加葡萄糖，通过控制溶氧、搅拌转速及糖流加速率，使乙酸维持在低浓度，从而获得高密度和高表达典型培养过程基因工程菌培养4、控制比生长速率的葡萄糖流加菌体的比生长速率与代谢产物的表达密切相关。比生长速率太大，超过某一值，易产生乙酸，这一比生长速率值称为菌体的乙酸产生临界比生长速率。通过考察得出最优比生长速率，控制溶氧、转速、补糖来控制比生长速率。典型培养过程基因工程菌培养六、生长与表达的影响因素

不同发酵条件下工程菌发酵结果通气量搅拌转速DOpHOD600

诱导时间菌体湿重蛋白量111501.87.00.741.913.8%222502.67.80.7742.0816.7%335003.87.50.7462.1018.2%435004.07.00.8362.2726.4%535003.67.02.4465.1858.9%*鲤鱼生长激素基因工程菌典型培养过程基因工程菌培养1、溶氧浓度对工程菌发酵的影响在鲤鱼生长激素基因工程菌的发酵研究中发现当发酵液的溶氧为1.8~2.6ppm/L时，菌体湿重为1.9~2.08g/L外源基因表达量为13.8%~16.7%，而当溶氧值提高到4.0ppm/L时菌体湿重为2.27g/L外源基因表达量为26.4%。在诱导表达期间，要维持外源基因的高水平转录和翻译，细胞需要大量的能量代谢以促进呼吸作用。因此通过增大通气量和提高搅拌转速以保证较大的溶氧值，不仅提高工程菌的生长而且有利于外源蛋白产物的形成。典型培养过程基因工程菌培养2、pH值对工程菌生长和表达的影响在相同通气量和搅拌速度下，pH值对不同菌群生长影响不大，而对外源蛋白表达有一定影响。由于工程菌培养采用两阶段培养工艺，前期为菌体生长阶段，后期为蛋白诱导表达阶段。偏碱性的pH对外源蛋白的表达不利，因此，表达开始要调节pH在6.8-7.0之间，以保证外源蛋白的高水平表达。典型培养过程基因工程菌培养3、诱导时间对外源蛋白表达的影响诱导时间：加入诱导剂后的培养时间随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加，但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒性，合成速率下降，甚至产物被分解。诱导时间对酶表达水平和活力的影响诱导时间酶活力酶表达水平

00.02152.337%2118.857%3120.867%4165.068%5139.964%*L-天冬酰氨酶典型培养过程基因工程菌培养4、诱导时机对表达的影响以天冬酰氨酶表达为例，见表。在A600=0.295*10时生长速度比较快，这时菌体进入诱导状态，酶蛋白的积累加快，酶活和表达水平都较高。而菌体进入对数期后期，由于发酵液中营养的消耗，氧气的缺乏及代谢产物的积累，使菌体的生长速度明显受到抑制。在此状态下诱导，表达显然受到影响。典型培养过程基因工程菌培养

诱导时机对酶表达水平和活力的影响生物量（A600）酶活力酶表达水平

0.0156.015.0%0.04919.131.1%0.16072.541.5%0.225102.649.8%0.295165.057.7%0.360105.553.4%0.41062.444.5%0.45030.222.5%*L-天冬酰氨酶典型培养过程基因工程菌培养5、乙酸对生长和表达的影响（1）乙酸的产生及抑制作用机理当葡萄糖加入量超过菌体生长和二氧化碳产生所需要量或在缺氧的条件下便会产生大量的乙酸，特别是在培养时间较长的高密度发酵过程中，问题更为严重。乙酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环有关。Han认为细菌在低比生长速率下通过氧化代谢的作用产生的能量足以满足合成和异化的需求，不会产生乙酸，而在髙比生长速率时，大肠杆菌仅靠氧化代谢不能提供足够的能量，必须通过乙酸生成途径储备ATP和NADH。典型培养过程基因工程菌培养乙酸的生成需要两个关键性的酶，磷酸转乙酰酶（Pta）和乙酰激酶（Ack），它们催化葡萄糖代谢中从乙酰辅酶A生成乙酸的两步酶促反应。EL-Mansi和Luli假设的乙酸抑制机理是：乙酸在中性pH环境中以离子化（CH3COO－）和质子化（CH3COOH）两种形式存在，质子化的乙酸具有弱的亲脂性可以穿过细胞质膜进入胞内，在细胞内（pH7.5）解离成CH3COO-和H＋，这样就降低了膜内的pH值，使膜内外的pH差减小，减弱了质子的推动力，产生的能量就被大大减少，扰乱了细胞的正常代谢和生理活性。典型培养过程基因工程菌培养（2）减少乙酸积累的对策宿主菌不同的宿主产生乙酸不同，可通过诱变使乙酸生成途径中的两个关键酶，有一个突变了或活性降低了，使乙酸合成受阻。培养基培养基组成能影响乙酸的产生，特别是碳源的含量影响最大。在基本培养基中大肠杆菌产生的乙酸比在复合培养基中产生少。另外用甘油取代葡萄糖可以降低乙酸的生成，Han等在培养基中加入某些氨基酸（甘氨酸、甲硫氨酸）减轻了乙酸的抑制作用，提高了重组菌的生长速率和重组蛋白的产率。Klemam等研究了培养基pH值对产生乙酸的影响，发现重组大肠杆菌W3200在葡萄糖浓度为5g/L、pH6.0的培养基中乙酸生成量为6g/L.而pH7.5为12g/L。典型培养过程基因工程菌培养降低比生长速率细菌比生长速率高，乙酸的比生成速率就高，一般来说，在合成培养基中，当重组菌的生长速率超过某个临界值便产生乙酸。在连续培养中，当稀释速率超过0.2h－1才能检测到乙酸的存在。较低的比生长速率虽然产酸少，但同时对产物表达不利，因此选取合适的比生长速率才能达到高密度、高表达发酵。降低培养温度将温度从370C降低到26-300C可以降低菌体对营养物的吸收率，从而减少有机酸的形成。典型培养过程基因工程菌培养透析培养在重组菌的培养过程中可以利用透析技术除去发酵液中有害物质，降低乙酸的含量从而实现重组菌的高密度发酵。Lee等用中空纤维膜过滤装置除去乙酸，可以在较高的葡萄糖浓度下培养重组菌而得到较高的密度限制性流加葡萄糖利用葡萄糖为碳源培养重组大肠杆菌时要控制其浓度在较低的范围内，减少乙酸的生成。目前大多数高密度发酵均采取了限制性流加葡萄糖的方法利用反馈的参数，如pH，μ，OUR,CER作为控制对象，和葡萄糖流加相关联，控制流加量，使培养基中葡萄糖的浓度限定在较低水平。典型培养过程基因工程菌培养七、甲醇营养型酵母的生长和表达

（一）酵母作为宿主菌的优点单细胞低等真核生物，易于培养、繁殖快、便于基因工程操作具有真核生物的蛋白质翻译后加工的功能，具有适合于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统分泌外源蛋白质到培养液中，利于纯化。典型培养过程基因工程菌培养

酿酒酵母最先内用来作为外源基因的表达宿主菌之一，由于人们对酿酒酵母（S.Cerevisiae）的遗传学和生理学背景了解得多，及其表达的安全性。但酿酒酵母表达系统也存在一些问题：一是缺乏强有力的严格调控的启动子。目前一些常用的启动子很难精确控制或需要大量昂贵的诱导物，如半乳糖苷酶启动子需要半乳糖的诱导；二是分泌效率低，特别是对分子量大于30KD的外源蛋白几乎不分泌；三是表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失；四是不适于高密度培养。典型培养过程基因工程菌培养（二）甲醇营养型酵母甲醇营养型酵母主要包括Candida、Torulopsis、Hansenula、Pichia。用作表达宿主株的主要是Hansenula和Pichia。基于以上的问题，人们发展了甲醇营养型酵母作为第二代酵母表达系统。典型培养过程基因工程菌培养甲醇营养型酵母的重要特性是能利用甲醇作为唯一的碳源和能量来源。因为甲醇能诱导其表达甲醇代谢所需的酶，如醇氧化酶（AlcoholOxidase,AOX）二羟丙酮合成酶（Dihydroxy-acetonesynthase,DHAS）和过氧化氢酶（Catalase），表达的DHAS的含量甚至可达到总细胞蛋白的60-80%。而当以葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源时，AOX几乎不表达。进一步研究表明，AOX的表达是转录水平调控的，其启动子能非常有效地控制外源基因的表达。已经在P.pastoris染色体中鉴定了二个AOX基因（AOX1和AOX2），AOX1编码的蛋白质与AOX2编码的蛋白质有97%的同源性，但AOX1基因的启动子（PAOX1）受甲醇强烈诱导，而PAOX2则很弱。H.polymorpha染色体只有一个AOX基因，也受甲醇调节。典型培养过程基因工程菌培养甲醇营养性酵母的另一个特点是甲醇代谢所需的三种酶被分拣转运入过氧化物酶体中，形成区域化。在葡萄糖为碳源时，菌体中只有一个或几个很小的过氧化物酶体，而在甲醇作碳源时，过氧化物酶体几乎占到整个细胞体积的80%，里面的蛋白质主要AOX和DHAS。典型培养过程基因工程菌培养自1987年Gregg等首次在P.pastoris菌中表达乙型肝炎表面抗原以来，短短几年间，至少有40多种外源蛋白在P.pastoris和H.polymorpha中获得表达。表达产物分泌到培养液中或聚集在胞浆，表达量最高的可达全菌蛋白的32%或每升12g产物。H.polymorpha表达比P.pastoris有更多的优点，如更高的耐热性（理想温度为37-430C，而P.pastoris为300C）和在甲醇诱导下更快的生长速率，可减少培养时间，降低污染机会。H.polymorpha更适于大分子量蛋（150KD）的表达与分泌。典型培养过程基因工程菌培养为了提高外源表达蛋白在酵母细胞中的稳定性，免受蛋白酶的降解，通常采用以下几种方法：一是在培养液中补加一些富含氨基酸的组分如胃蛋白酶水解物或酪蛋白水解物，提高给酵母细胞蛋白酶过量的底物，以减少目的蛋白的水解；二是由于P.pastoris能耐受较宽的pH范围（pH3.0-7.0），因此可调培养液pH值抑制蛋白水解酶活性；三是改造P.pastoris表达宿主菌株，缺失基因组中主要蛋白水解酶的基因，使目的蛋白稳定。典型培养过程基因工程菌培养酵母细胞是真核生物，具有一些亚细胞结构，如过氧化物酶体等，它们对细胞的功能极端重要，过氧化物酶体内不含DNA，也无蛋白质合成机制，所有过氧化物酶体内的蛋白都由核基因编码表达，再转运入过氧化物酶体。因此蛋白质结构中必定存在一些进入过氧化物酶体所必须的局部信息。如果把表达的外源蛋白运输进入过氧化物酶体储存起来，不仅可使蛋白免受蛋白水解酶降解，增加其稳定性，还可减少外源蛋白对宿主的毒害作用。一些实验表明，甲醇营养型酵母分拣外源蛋白进入过氧化物酶体，使之区域化的信号。已鉴定出二种分拣进入过氧化物酶体所需的靶信号PTS1和PTS2。典型培养过程基因工程菌培养由于甲醇营养型酵母表达系统具有一些特殊的优点（1）应用AOX启动子，转录效率高，易于诱发调控；（2）表达质粒易于整合到基因组，不易丢失，适于高密度发酵，产量高；（3）表达产物分拣进入过氧化物酶体等因此最近十几年来，人们越来越多的应用它作为外源基因表达的系统。典型培养过程基因工程菌培养（三）甲醇营养型酵母培养中的影响因素1、甲醇浓度对基因工程菌P.Pestoris表达rHSA的影响按摇瓶培养方法每24h分别补加甲醇使其在培养基中浓度为5、10、20、30、40、50g／L诱导培养96h，结果见表2(表中数据为2个发酵瓶平均值)。典型培养过程基因工程菌培养

在甲醇浓度为10g／L时毕赤酵母表达目的蛋白量达到最高，这可能是当甲醇浓度小于10g／L，甲醇成为限制性底物，限制了蛋白的表达当浓度高于20g／L时，甲酵浓度过高，对目的蛋白的表达也有抑制作用。因此，在摇瓶条件下，甲醇的最佳诱导浓度为10g／L。典型培养过程基因工程菌培养2、pH对基因工程菌P.Pastoris表达rHSA的影响按摇瓶培养方法把菌种接至用0.2mol/L的磷酸缓冲液配制好的摇瓶诱导培养基中pH分别为5.43、5.72、5.84、5.98、6.29、6.59和7.05，每24h加甲醇至终浓度10g／L进行诱导培养。典型培养过程基因工程菌培养由基因工程菌P.Pastoris表达目的蛋白和细胞光密度曲线(图1)可以看出pH为5.84时目的蛋白表达量最高。pH为5.43时，目的蛋白基本没有表达，但细胞光密度极大，说明在低pH值条件下，适合细胞生长而不适合目的的蛋白表达；当pH值在5.72—7.00时，细胞光密度基本相同，而目的蛋白表达量基本是呈逐渐下降的趋势，pH为7.05时，目的蛋白表达量明显下降。因此，既利于P.Pastoris细胞生长又利于目的蛋白高表达的pH范围为5.72—6.59。典型培养过程基因工程菌培养典型培养过程基因工程菌培养典型培养过程基因工程菌培养3、接种量对基因工程菌P.Pastoris表达rHSA的影响在用重组毕赤酵母生产人骨唾液酸蛋白的研究中发现，产物表达量与接种量有关。在BMGY中培养菌体至A600为9，离心后水洗，分别用4、2、1、1／2、1／5、1／10倍体积BMMY(1％甲醇)重悬，进行2d的诱导表达。结果表明产量随发酵密度增大而明显提高，重悬于1／5体积的BMMY中(相当于菌体吸收度A600约45)的表达量最高，为0.204g／L，但增大到A600为90时，表达量有所下降(见图2)。典型培养过程基因工程菌培养典型培养过程基因工程菌培养4、(NH4)2SO4浓度对蛋白表达的影响氮源是宿主菌合成异源蛋白所必须的成分，试验不同浓度的(NH4)2SO4对菌体生长的影响，所得结果见图l。(NH4)2SO4浓度太高或太低都会对蛋白的表达产生不利影响。当(NH4)2SO4浓度低于50mg／L时，蛋白的表达很明显受到限制，而(NH4)2SO4浓度高于3.0g／L时则会抑制蛋白表达。另外由于目前高密培养P.Pastorisr表达白蛋白通常只补加碳源和微量元素，而只以流加氨水调节pH来补充氮源。但诱导过程中pH下降很少，因而补充的氮源也很少，可能会限制菌的生长和白蛋白的分泌。由图1也可以看出开始诱导后每24h补加(NH4)2SO4

，使其浓度维持在2g/L左右，蛋白表达量最大。典型培养过程基因工程菌培养典型培养过程基因工程菌培养5、微量量元素PTM1的影响对比加入PTM1与不加PTM1所分泌的总蛋白，前者明显高于后者，这说明加入PTM1能够明显提高rHSA的表达，从图3可知，总蛋白质量浓度由119.0mg／L增加到192.3mg／L，增加了61.6％。这是因为微量元素中含有Ca2+，Fe3+，Zn2+，Mg+等金属离子，还有Co2+、I-、Mo2+在微生物培养中经常使用这些金属离子，有助于提高培养的细胞浓度、细胞得率和细胞产率；前24h白蛋白量增加迅速，此后增加缓慢，至60h达最高，然后呈下降趋势，可能是产生的蛋白酶分解了所分泌的白蛋白。典型培养过程基因工程菌培养典型培养过程基因工程菌培养总结：基因工程菌在代谢控制方面与传统微生物有许多相似之处，比如补料控制、pH控制、温度控制、溶氧控制等，使菌体能够达到高密度。它的特殊之处在于外源基因的稳定性、外源蛋白表达的诱导、蛋白降解的防止以及生长与表达的协调等方面，以达到高表达的目的。典型培养过程基因工程菌培养思考题1、利用基因工程菌生产，有什么优势？常用的宿主菌有哪些？2、利用基因工程菌生产有哪些特点？3、重组菌基因不稳定性的原因有哪些？4、在基因工程菌培养过程中为什么质粒会丢失？5、基因工程菌高表达的障碍是什么？6、常规的高密度培养的措施有哪些？重组菌与传统微生物在产物表达上有什么区别？与大肠杆菌相比酵母作为宿主菌有什么优点？重组菌与传统菌在发酵过程控制中有哪些相同之处？重组大肠杆菌的诱导因子有哪些？重组酵母的诱导因子有哪些？典型培养过程基因工程菌培养第二节动物细胞培养典型过程培养动物细胞培养动物细胞和微生物细胞的总体差异内容微生物细胞动物细胞细胞壁普遍存在存在生长速率0.1~0.5h-10.01~0.05h-1需氧量高低营养要求普遍简单复杂CO2需求一些微生物需CO2许多需要CO2形成缓冲液环境影响小大大小范围100~2000nm10000~100000nm接种浓度低高（10-5.ml-1）生长浓度高（109~1010.ml-1）低（106.ml-1）典型过程培养动物细胞培养一、动物细胞培养的特性动物细胞培养是指在合适的培养条件下，动物细胞离体生长和增殖，并保持其特性和功能的技术，这些细胞不再形成组织。典型过程培养动物细胞培养

1细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素

2细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差

3需氧少，不耐受强力通风与搅拌

4群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）

5培养过程产品分布细胞内外，成本高

6原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡

典型过程培养动物细胞培养两个专业术语细胞系：首次分离组织的培养称之为原代培养。原代培养物经传代成功后即成细胞系。细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标记的培养物称为细胞株。典型过程培养动物细胞培养细胞生长的类型贴壁依赖性来自动物实体组织的大多数细胞需要贴壁单层生长。只要它们没有转化为非贴壁依赖性的必须贴伏在合适的固体介质上并铺展，才能生长。非贴壁依赖性细胞无需贴附到固体介质上就能生存和生长的细胞。来自血液、淋巴系统的细胞和大多数肿瘤细胞常为非贴壁依赖性的，它们形态呈圆形。典型过程培养动物细胞培养生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。

典型过程培养动物细胞培养贴壁培养的优点：

●容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。

●容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。

●当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。

●同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。

●适用于所有类型细胞。

典型过程培养动物细胞培养.贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比

●扩大培养比较困难，投资大；

●占地面积大；

●不能有效监测细胞的生长；

典型过程培养动物细胞培养二、细胞培养物的获得原代培养物在无菌条件下，用镊子和剪刀将切下的组织碎成小块，再用胰蛋白酶等蛋白水解酶处理，使组织解离成单个细胞，放入培养容器中无菌培养。这种原代培养物中含有各种不同分化的细胞类型，它们的生长速率不同，成纤维细胞最易生长，常会在此后的传代培养中占据优势。仔细控制培养基的成分，可以选择性地支持某些细胞类型的生长。典型过程培养动物细胞培养典型过程培养动物细胞培养转化细胞正常细胞经过一个转化的过程，丧失了对生长控制的敏感性。转化伴随着染色体模式的改变，二倍体变成异倍体。更典型的表现是，贴壁依赖性细胞对贴壁的依赖及细胞密度的抑制发生改变，虽然也许细胞仍需贴壁生长，但可能生长到不止单层。细胞转化有四种主要途径：①有些细胞在培养中自发转化②化学转化。某些化学致癌物会增加转化频率③病毒转化。④致瘤因子转化典型过程培养动物细胞培养转化细胞由于有无限寿命，在培养中更易生长，被广泛用于生成生物制品，如重组蛋白药物、病毒疫苗等。但是，人们对她们的安全性仍然非常关心，对可能造成的生物危害性进行严格的检测和控制。典型过程培养动物细胞培养肿瘤细胞肿瘤细胞使来自于肿瘤组织的细胞或经肿瘤细胞与其它细胞融合产生的细胞，如杂交瘤细胞。与转化细胞相比，它们是恶性的，基本上是非贴壁依赖性的。肿瘤细胞有很好的增殖特性，生长速率高。对生长因子的依赖程度低，对培养环境的要求也不那么苛刻。。肿瘤细胞的致癌性是造成其难以用于体内治疗产品生产的主要原因。由于近年来分离纯化技术的进步和对这些细胞致瘤性的深刻认识，对其在生产中的应用有所松动，如杂交瘤细胞生产的单克隆抗体已用于体内治疗，C127细胞生成重组蛋白的研究也形成了规模。典型过程培养动物细胞培养体外培养所需的一般条件适宜的培养皿血清成分370CCO25％95～100％湿度抗生素典型过程培养动物细胞培养培养基培养基配置考虑的因素的pH多数细胞系在pH7.4下生长得很好。一些正常的成纤维细胞系以7.4~7.7最好，转化细胞系以pH7.0~7.4更合适。缓冲在高细胞密度下，转化细胞系产生大量二氧化碳和乳酸，引起pH下降，需要在培养基中加入缓冲作用的试剂，如碳酸氢钠、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonicacid])典型过程培养动物细胞培养温度低温下CO2溶解度增加，引起pH变化。黏度培养基的黏度主要受血清含量的影响。在搅拌条件下黏度大则细胞受损伤小。加入羧甲基纤维素或聚己烯基吡咯烷增加培养基黏度典型过程培养动物细胞培养细胞培养基的基本组成1、水细胞培养用的各种液体都要用水来配置，对水的纯度要求很高。通常细胞培养用水的污染物标准可参考医药上注射用水标准，单原则上应高于注射用水标准。2、能源和碳源主要是糖和糖酵解的产物和谷氨酰胺。细胞能用的糖主要是六碳糖，特别是葡萄糖。葡萄糖很容易被大多数细胞转化为乳酸。昆虫细胞更偏爱蔗糖。在多数培养基中谷氨酰胺作为主要的能源和碳源。使用谷氨酰胺最大的问题是它的自发降解，降解量与时间、温度、血清和磷酸浓度有关，降解产物为氨，对细胞有毒性。典型过程培养动物细胞培养3、氮源氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是细胞合成复杂含氮化合物的前体，还作为必不可少的能源物质。不同种类的细胞对氨基酸的种类和浓度有不同的要求，但除了前面提到的谷氨酰胺外，还有12种氨基酸不能在细胞内合成，必须依靠从培养基中摄取。几乎所有培养基中都含有全部必须氨基酸，根据需要补充适量非必需氨基酸。非必须氨基酸含量低时常会增加必须氨基酸的消耗量。增加氨基酸的浓度可以提高培养的细胞密度和产物产率。典型过程培养动物细胞培养4、维生素维生素是维持细胞正常生理状态的一种重要生物活性化合物，在细胞中多形成酶的辅基或辅酶，对细胞的代谢过程有重要影响。5、无机离子无机离子分为两组，一种是含量较高的，，包括维持膜电势的（Na+，K+），维持渗透压平衡（Na+，Cl－），作为酶的辅因子（Mg2+），促进细胞贴附（Mg2+Ca2+），起缓冲作用（HPO42-，HCO3-）；另一种势微量元素，如铁、锰、锌、钼、硒、钒、铜。典型过程培养动物细胞培养6、脂类和磷脂前体在使用血清的细胞培养中，脂类来自血清，在无血清培养中，有些细胞需要添加脂类，如胆固醇、脂肪酸、磷脂。特别是缺陷型细胞，对某种脂类有很高的依赖性。非营养性物质1、抗生素细胞培养中，特别是原代细胞培养中，常使用抗生素抑制微生物的污染。2、pH缓冲剂最常用的缓冲剂是碳酸氢钠，常用浓度26mmol/L，接近血中浓度，必须与5％～10％CO2平衡，否则培养基迅速变碱。HEPES是缓冲能力很强的化合物，但由于它相当昂贵，细胞大规模培养中很少使用。典型过程培养动物细胞培养3、酚红酚红普遍作为培养基的pH指示剂4、保护剂细胞保护剂指保护细胞免受由渗透压变化、剪切、毒性金属和氧化剂所引起的损伤的物质。在生物反应器中培养的细胞会受到机械搅拌和气泡运动所产生的剪切损伤，某些大分子化合物，如甲基纤维素、葡聚糖、PEG、聚乙烯吡咯烷酮、PluronicF68、血清白蛋白，能够减轻这种损伤。5、还原剂某些还原剂在细胞培养中有特殊作用。β－巯基乙醇在杂交瘤细胞培养中能刺激抗体分泌，并促进胱氨酸利用。典型过程培养动物细胞培养血清常用的血清是小牛血清、胎牛血清、马血清和人血清。最常用的是小牛血清。血清是极其复杂的混合物，含有食物物质、代谢物、激素、血浆蛋白、破碎细胞释放物质、采血中引入的污染物。由于历史原因，商业培养基大都是按添加血清来设计的，使用血清技术也很成熟，尽管使用血清有许多缺点，仍将其作为细胞培养最重要的添加剂普遍采用。典型过程培养动物细胞培养三、细胞计数及活力测定

培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

典型过程培养动物细胞培养在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。

用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。

典型过程培养动物细胞培养四、培养物的污染及防止污染途径

1空气：空气流动性大，如果培养操作场地于外界隔离不严格或消毒不充分，外界不洁空气很容易进入造成污染。因此，培养设施不能设在通风场所。无菌操作应在净化台内进行，工作时要带口罩

典型过程培养动物细胞培养2器材：各种培养器皿

3操作：实验操作无菌观念不强，技术不熟练，使用污染的器皿或封瓶不严等，都可以造成污染。

4血清：有些血清在生产时就已经被支原体或病毒等污染，变成了污染。

5组织样本：原代培养的污染多数来源于组织样本；取材时碘酒消毒后脱碘不彻底，可造成碘混入组织，细胞或培养液中，影响细胞细胞生长。

典型过程培养动物细胞培养五、动物细胞的大规模培养（一）培养环境1、温度温度是细胞在体外生存的基本条件之一，来源不同的动物细胞，其最适的生长温度不同。例如昆虫细胞的最适温度是25～280C，人和哺乳动物细胞的最适温度是370C，细胞代谢强度与温度成正比，超出最适温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。典型过程培养动物细胞培养2、pH大规模培养时影响培养液的pH稳定性的主要因素有三种：（1）缓冲液的缓冲能力及种类（2）对流空间大小（3）葡萄糖浓度培养液中正常的缓冲系统是NaHCO3/CO2系统，它是一种弱缓冲系统，其pK为6.1，低于生理学最佳要求。这种缓冲系统要求在培养液上面的对流空间加入CO2以防止它的丢失及增加羟基离子。典型过程培养动物细胞培养也可使用磷酸缓冲液，但磷酸对动物细胞有毒害作用。HEPES生物缓冲剂也曾被加入NaHCO3/CO2缓冲系统中，这是由于HEPES的pK为7.0，HEPES被加入后，其缓冲能力为pH6.8～7.2。。但是当HEPES浓度高于25mmol/L时，它对大多数动物细胞都有毒害作用。动物细胞大规模培养时常有几种方法来调节培养液中的pH：（1）在培养基中添加NaHCO3作为缓冲剂及通入含CO2的空气进行调节典型过程培养动物细胞培养（2）用0.1mol/LNaON或0.1mol/LHCl进行调节。由于动物细胞培养时要求低搅拌和弱混合，利用NaOH或HCl进行调节时会发生局部过酸或过碱的现象，从而对细胞产生毒性作用，因此这种调节方法在动物细胞培养时不太合适。通常通过调节培养基中NaHCO3用量及通气中CO2浓度来控制发酵过程的pH。典型过程培养动物细胞培养3、溶解氧大规模培养中如何提供足够的氧是非常重要的。通气得得目的有两个：一是提供细胞代谢所需的足够的氧；二是使发酵液处于均匀悬浮状态，有利于传质过程。典型过程培养动物细胞培养（三）培养容器1、多孔板、Petri培养皿和组织培养方瓶都是常用的静止培养容器，体积小，操作方便，很容易放入培养箱内培养。2、滚瓶也是一种重要的培养容器，培养时放在滚瓶机上缓慢滚动，但培养条件很接近于静止培养。它体积交大，接种后放入温室或专门的培养箱中培养。培养依赖性贴壁培养细胞时，需加入微载体以增加培养表面积。3、生物反应器是大规模培养中最重要的培养设备。它有各种不同形式，容积可以从1升到几十立方米。典型过程培养动物细胞培养微载体微载体是指直径在60～250μm、适合于动物细胞贴附和生长的微珠。微载体法培养动物细胞有很多好处;①可在反应器中提供大的比表面积②可采用均匀悬浮培养，简化了各种环境因素的检测和控制，提高了培养系统的重演性③可用普通显微镜观察细胞在微载体上的生长情况④容易放大⑤适合于多种贴壁依赖性细胞培养⑥容易收获细胞。微载体培养系统的缺点是：①细胞生长在微载体表面，易受到剪切损伤，不适合贴壁不牢的细胞生长②微载体价格较贵，一般不能重复使用③需要较高的细胞接种量。典型过程培养动物细胞培养悬浮培养悬浮培养指细胞在培养容器中自由悬浮生长的过程，主要用于非贴壁依赖性细胞的培养，如杂交瘤细胞等。动物细胞悬浮培养与微生物过程比较接近，但由于动物细胞对搅拌和通气造成的流体剪切很敏感，在反应器的设计和操作上又有特殊要求如利用螺旋带叶轮减小生物反应器培养过程中的剪切作用，并通过表面充气及诱导表面气泡产生具有双层滤网的新型搅拌器，它提高了氧传递速率典型过程培养动物细胞培养目前，动物细胞培养用生物反应器主要包括：转瓶培养器、塑料袋增殖器、填充床反应器、多层板反应器、螺旋膜反应器、管式螺旋反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器、流化床反应器、中空纤维及其它膜式反应器、搅拌反应器、气升式反应器等。典型过程培养动物细胞培养细胞大规模培养生物反应器气升式生物反应器气升式生物反应器与其它反应器相比，结构简单，无转动部件，细胞损伤率低，减少了污染的机会；产生的湍动温和而均匀，剪切力相当小；当大容易；直接通气供氧，氧传递速率高，供氧充分；液体循环量大，细胞和营养成分混合均匀。存在问题：由于液体混合的能量唯一来自通入的气体，因而通气量大，泡沫多，而且气泡破碎造成严重的细胞机械损伤典型过程培养动物细胞培养通气搅拌生物反应器根据动物细胞培养的特点，要求搅拌器转动时混合性能好，产生的剪切力小，气泡产生的不利影响小。设计有多种形式的搅拌器，应用最多的是笼式搅拌器。笼式搅拌器有两个由200目不锈钢丝网围成的笼式腔。下部的是通气腔，上部的是消泡腔，之间有细管相通。气体交换在通气腔内进行，其中的液体通过丝网与腔外的液体进行交换。在气体鼓泡中形成的泡沫经细管进入消泡腔，经丝网破碎分成气液两部分，既做到深层通气，又避免泡沫在反应器中积累。

典型过程培养动物细胞培养搅拌器有三个导流筒，与搅拌器中心的垂直空腔相通，当导流筒随搅拌器转动时，由于离心力的作用，搅拌器中心的空腔产生负压，使培养基从底部吸入，沿空腔螺旋式上升，再从三个导流筒排出，绕搅拌器外缘螺旋式下降。悬浮细胞或贴附有细胞的微载体的密度接近于培养基，被培养基所裹胁，反复循环，充分混合。在微载体法培养贴壁动物细胞时，一般搅拌转速在30～60r/min范围内，混合时间为12～24s。典型过程培养动物细胞培养中空纤维生物反应器用途较广，既可用于悬浮细胞的培养，又可用于贴壁细胞的培养。其原理是：模拟细胞在体内生长的三维状态，利用反应器内数千根中空纤维的纵向布置，提供细胞近似生理条件的体外生长微环境，使细胞不断生长。中空纤维是一种细微的管状结构，管壁为极薄的半透膜，富含毛细管，培养时纤维管内灌流充以氧气的无血清培养液，管外壁则供细胞黏附生长，营养物质通过半透膜从管内渗透出来供细胞生长；对于血清等大分子营养物，划必须从管外灌入，否则会被半透膜阻隔不能被细胞利用；细胞的代谢废物也可通过半透膜渗入管内，避免了过量代谢物对细胞的毒害作用。典型过程培养动物细胞培养优点是：

●占地空间少；

●细胞产量高，细胞密度可达109数量级；

●生产成本低，且细胞培养维持时间长，适用于长期分泌的细胞。

典型过程培养动物细胞培养细胞生物反应器的控制系统由动物细胞的特性所决定，细胞培养不能沿用微生物发酵过程中常用的手段，安全而有效地方法是高便通入培养罐内气体中的氧气和氮气的比例来实现控制溶氧值的目的，采用二氧化碳/碳酸氢钠缓冲液系统来控制培养液的pH值，它主要是靠预先加入培养基＝液中适量的碳酸氢钠和通过改变气体流量中的二氧化碳含量来实现。典型过程培养动物细胞培养生物反应器中的细胞培养模式分批培养分批培养是指将细胞和培养基一次性装入反应器内，进行培炎，细胞不断生长，产物也不断形成，经过一定时间反应后，将整个反应系取出。流加培养流加培养是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜条件下接种细胞，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成。随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分不断补充至反应器内，使细胞进一步生长代谢。到反应终止时，取出整个反应系。典型过程培养动物细胞培养半连续培养半连续培养又称为反复分批培养或换液培养，是指在分批培养的基础上不全部取出反应系，剩余部分重新补充新的营养成分，在按分批培养的方式进操作。这是反应器内培养液体积保持不变的操作方式。连续培养连续培养是指将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养，一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应液连续不断地取出，反应条件处于一种恒定状态。与分批培养和半连续培养不同，连续培养可以控制细胞所处的环境条件长时间的稳定。因此，可以使细胞维持在优化状态下，促进细胞生长和产物形成。典型过程培养动物细胞培养灌注培养灌注培养是指细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养基不断加入反应器，另一方面又将反应液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。当高密度培养动物细胞时必需保持给细胞补充足够的营养以及去除有毒的代谢废物。通过调节灌注速率可以把培养过程保持在稳定的、废物代谢低于抑制水平的状态下。一般在分批培养中细胞密度为（2！4）×106cell/ml，在灌注系统中可达到（2～5）×107cell/ml。典型过程培养动物细胞培养培养基研究进展——无血清培养基通常动物细胞的生长均有赖于血清的存在，在普通培养基中，如不加血清，绝大部分细胞将不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潜在的污染源、不同批号蛋白含量差异大及价格高等，给生物制品的生产造成了不利。这就引发了人们对无血清培养基的研究。结果发现，只要在培养基中增加某些适于细胞生长的成分，如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素和表皮生长因子等，不少细胞即能在无血清供应的情况下生长，尤其是CHO、杂交瘤及重组骨髓瘤细胞等。典型过程培养动物细胞培养其中胰岛素是无血清培养基中促进动物细胞生长的最重要的多肽。CHO细胞能在仅含重组人胰岛素一种蛋白成分的无血清培养基中连续传代。在人类细胞培养中，应用无血清培养基还能有选择性地控制及避免成纤维细胞的过度生长。某些细胞在无血清的条件下，其生长和抗体的产量甚至较有血清培养时高出数倍。另外．动物细胞培养应用无血清培养基的成功，还将为某些疫苗的生产降低成本。典型过程培养动物细胞培养第二章：菌种的来源微生物的特性及工业微生物的要求一些工业化产品生产菌种的特点自然界中有目的微生物分离的原则菌种选育、分子育种菌种的来源第一节微生物的特性及工业微生物的要求一、微生物的特性

有些微生物能在厌氧的条件下生长

有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身的生长

有些微生物能进行复杂的代谢

有些微生物能利用较复杂的化合物

有些微生物能在极端的环境下生长菌种的来源微生物的特性及工业微生物的要求二：工业化菌种的要求

能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物

有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强

遗传性能要相对稳定

不易感染它种微生物或噬菌体

产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）

生产特性要符合工艺要求菌种的来源微生物的特性及工业微生物的要求放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源一、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：第二节已工业化产品生产菌的介绍菌种的来源已工业化产品生产菌的介绍二、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：菌种的来源已工业化产品生产菌的介绍HD:高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制

HT:高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶菌种的来源已工业化产品生产菌的介绍氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌菌种的来源已工业化产品生产菌的介绍三、食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌菌种的来源已工业化产品生产菌的介绍三、常用的基因表达系统(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌沙门氏菌

生长迅速、蛋白产量高;

表达蛋白的纯化、分离及分析快速；

外源基因的导入相对容易；

已建立了整套表达理论及技术.菌种的来源已工业化产品生产菌的介绍(二)真核细胞表达系统

酵母(既是微生物又是真核细胞)

生长迅速，营养要求不高，易培养；

安全性好；

比哺乳动物细胞操作简单；

具有一定的修饰蛋白的能力。菌种的来源已工业化产品生产菌的介绍

中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统

具有准确的转录后修饰功能；

具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；

具有重组基因的高效扩增和表达能力；

具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；

CHO很少分泌自身的内源蛋白。菌种的来源已工业化产品生产菌的介绍微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？礼来(Elililly),花了10年的时间从40万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。例：菌种的来源已工业化产品生产菌的介绍第三节自然界中有目的微生物分离的原则一、菌种分离的一般过程土样的采取→预处理→培养→菌落的选择→产品的鉴定如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物问题：菌种的来源自然界中有目的微生物分离的原则二、采样时要注意的问题

气候、水分、空气

来源要广

结合产品的特点

标签：地点、时间、气候等菌种的来源自然界中有目的微生物分离的原则富集的三种方案：

定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，进行培养。三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。

当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分类学中考虑，

不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这时只能通过随机分离的办法菌种的来源自然界中有目的微生物分离的原则定向培养的方法物理方法：加热、膜过滤等，表2-2（P31）但主要是通过培养的方法菌种的来源自然界中有目的微生物分离的原则定向培养的富集方法1、底物2、pH条件3、培养时间4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。菌种的来源自然界中有目的微生物分离的原则四、菌落的选出

从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（P35）

从形态的角度

菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。菌种的来源自然界中有目的微生物分离的原则实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）采样（造纸厂）→80度30分钟处理文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落从285个土样中获得62株26株为组成型36株为诱导型↓菌种的来源自然界中有目的微生物分离的原则例：醛肟水解酶的筛选

--Journalofbiotechnology94(2002),65-72培养基中含0.05%ofZ-PAOx

每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落菌种的来源自然界中有目的微生物分离的原则五、目的微生物富集方法的研究进展

分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等

目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。

2002,陈文新（科学院院士）

Incontrasttothistraditionalapproach,modernmolecularbiologytechniquesallowforDNAlibraryexpressionscreening,whichalsoenablesaccesstoenzymesof`nonculturable'organisms.Bythisstrategy,forinstance,thecompanyDiversa(SanDiego,CA,USA)identised120uniqueesterases/lipasesfromonly16%ofthetotalDNAobtainedfromanalkalinesoilsample.FEMSMicrobiologyReviews26(2002)73～81菌种的来源自然界中有目的微生物分离的原则第四节菌株选育、分子改造目的

提高生产能力

提高产品质量

开发新产品

解决生产实际问题

防止菌种退化菌种的来源菌株选育、分子改造方法基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法DNAShuffling等菌种的来源菌株选育、分子改造自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9自然突变有两种情况：一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。一、自然选育菌种的来源菌株选育、分子改造自然选育在工业生产上的意义自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？菌种的来源菌株选育、分子改造自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞(孢子)悬液的制备平板分离挑选单菌落(注意形态的观察)发酵试验菌种的来源菌株选育、分子改造二、诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂物理在：紫外，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍{菌种的来源菌株选育、分子改造（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题

化学诱变剂使用过程的安全性诱变剂量的选择诱变剂的选择出发菌株的选择（一）、诱变剂的作用原理（略）压硝酸：0.07MNa2HPO4亚硝基胍：1MNaOH菌种的来源菌株选育、分子改造（三）、诱变育种的一般步骤(p83)（四）、筛选的方法

随机筛选

形态

理性化筛选从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。菌种的来源菌株选育、分子改造HD:高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制

HT:高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶结构类似物抗性：Lys的类似物AEC,Thr的类似物AHV营养缺陷型：如Thr缺陷型菌种的来源菌株选育、分子改造黄色短杆菌F9-50的诱变谱系BervibacteriumflavumAs1.495(leu-)lys.HCl2.1g/lF6-16(leu-,Thr-)20.8g/lF9-50(leu-,Thr-,AECr)33.5g/l菌种的来源菌株选育、分子改造三、基因的直接进化(directedevolution)

突变

基因突变库的建立

筛选

基因突变库的筛选

基因复制与遗传步骤：

在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。菌种的来源菌株选育、分子改造主要应用：酶学性能的提高:pH

温度

有机溶剂生理环境→工业催化环境

底物专一性菌种的来源菌株选育、分子改造脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯例：PLAPLA光学拆分选择性(%)231577581905次错位PCR2次定点突变Reetz(1997)Liebeton(2000)第二章菌种的来源菌种的来源菌株选育、分子改造菌种的来源菌株选育、分子改造定点突变错位PCR菌种的来源菌株选育、分子改造DNAShuffling:指DNA分子的体外重排，是基因在分子水平上进行有性重组(SexualRecombination)。菌种的来源菌株选育、分子改造XXXX

XXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXXXXXXXXXXXXXXXFragmentReassembleSelectbestwithDNAseIfragmentsrecombinantsRepeatformultiplecyclesDNAshuffling菌种的来源菌株选育、分子改造菌种的来源菌株选育、分子改造项目进化速度进化对象进化周期影响对象突变效率常规定向进化缓慢进化整个基因组多年完整基因组低DNAShuffling快速进化特定基因/操纵子/病毒几天部分基因组高DNAShuffling与常规定向进化的比较类型示例特性活性增加倍数潜在应用领域抗体人源抗体亲和性400生物制药酶天冬氨酸转氨酶催化特异性10，000生物制药β-内酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草杆菌蛋白酶E耐热性65℃耐热时间17200工业酶细胞因子人类干扰素抗病毒285，000基因治疗肿瘤抑制因子P5337℃半衰期12基因治疗代谢途径砷酸盐代谢途径砷酸盐解毒40生物制药汞代谢途径汞解毒12生物制药部分DNAShuffling技术的研究成果菌种的来源菌株选育、分子改造本章小节：

涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物(动、植物)才具有大量表达的潜力；

传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是自然选育是工业发酵稳产高产的重要保证；

目前土壤中已分离的微生物不到总数的1%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；

基因重组、直接进化技术的应用，大大加快了生