固体发酵黑曲霉产单宁酶的研究

PAGE62目录目录 i中文摘要 iAbstract ii第一章文献综述 11.1引言 11.2单宁酶的性质 21.2.1单宁酶的理化性质 21.2.2单宁酶的酶学性质 21.3单宁酶分离纯化及菌株筛选 31.4单宁酶的酶活力测定 41.5单宁酶的固定化 51.5.1固定化酶的方法和特性 51.5.2单宁酶的固定化 51.6单宁酶的应用 61.6.1应用于食品工业 61.6.2制革工业 71.6.3饲料工业 71.6.4化妆品工业 71.6.5精细化工与制药工业 71.7本课题立题意义和研究内容 81.7.1本课题的立题意义 81.7.2本课题的研究内容 8第二章产单宁酶黑曲霉菌株的诱变及筛选 102.1前言 102.2材料与设备 102.2.1菌种 102.2.2培养基 102.2.3实验仪器 112.3实验方法 122.3.1实验菌种的培养及初步鉴定 122.3.2出发菌株的筛选 122.3.3紫外诱变 132.3.4复筛方法 132.3.5粗酶液的提取 132.3.6酶活测定方法 132.3.7单宁酶高活性菌株的产酶稳定性 132.4实验结果与讨论 142.4.1实验菌种的初步鉴定 142.4.2出发菌株的筛选 142.4.3紫外诱变筛选单宁酶高活性菌株 15PAGE622.4.4单宁酶高活性菌株产酶稳定性 162.5本章小结 17第三章单宁酶活力测定方法的构建 183.1前言 183.2实验材料与方法 183.2.1菌种 183.2.2培养基 193.2.4试剂 193.2.5仪器 193.2.5实验方法 193.3实验结果与讨论 213.3.1没食子酸吸收峰波长 213.3.2没食子酸标准曲线及其回归方程 223.3.3单宁酶活力测定 233.3.4单宁酶活力测定方法比较 233.4本章小结 24第四章固体发酵黑曲霉产单宁酶研究 264.1前言 264.2实验材料与方法 264.2.1菌种 264.2.2培养基 264.2.3试剂 274.2.4仪器 274.2.5实验方法 274.3实验结果与讨论 304.3.1液体发酵法与固体发酵法的比较 304.3.2黑曲霉产单宁酶固体发酵单因素条件研究 314.3.3响应面优化结果 354.4单宁酶产酶活力曲线 394.5结论 40第五章单宁酶的固定化 415.1前言 415.2实验材料 415.2.1菌种 415.2.2试剂 425.2.3仪器 425.3实验方法 425.3.1单宁酶粗酶液的提取 425.3.2单宁酶酶活测定 425.3.3以海藻酸钠为载体固定化单宁酶固定化方法的选择 425.3.4固定化单宁酶条件的优化 435.3.5固定化酶性质的研究 445.4实验结果与讨论 455.4.1海藻酸钠为载体固定化单宁酶固定化方法的选择 45PAGE625.4.2固定化单宁酶的条件研究 455.4.3固定化酶的最适温度 495.4.4固定化酶的热稳定性 505.4.5固定化酶的最适ph 505.4.6固定化酶的贮藏稳定性 515.5本章小结 51第六章结论与展望 526.1结论 526.2展望 53参考文献 54PAGE62中文摘要单宁酶全称是单宁酯酰水解酶（Tannase,EC0），它可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖。单宁酶用途广泛，主要来源于微生物，目前研究得较多较为深入的是青霉和黑曲霉。本论文利用紫外诱变的方法选育到一株产单宁酶的黑曲霉菌株，对该菌株固体发酵产单宁酶的发酵工艺条件及发酵培养基进行了优化，研究确立了固体发酵所产单宁酶的酶活检测方法，论文还对产单宁酶的黑曲霉菌株发酵产单宁酶的固定化进行了研究。PAGE\#"'页：'#'

'"本研究采用紫外诱变的菌种选育手段进行黑曲霉菌株的诱变，用在平板培养基中加入微量的的溴酚蓝（0.004%），利用黑曲霉生长形成的变色圈大小对菌株进行筛选，成功的选育到了一株产单宁酶达92U/mL的黑曲霉高产菌株。它的单宁酶活性较原始出发菌株提高了1倍多。PAGE\#"'页：'#'

'"论文首先研究和建立了适合固体发酵所产胞外单宁酶活性的检测方法。此方法是根据没食子酸（单宁酶催化没食子酸丙酯水解产生）与甲醇绕丹宁之间形成色团物质的方法来测定单宁酶的活性，没食子酸丙酯做底物显色明显，选择520nm波长下检测，成功的避开了干扰物质的吸收峰波长，减小了误差，该方法对底物纯度要求低，常规实验室的仪器就能进行检测，具有简便直观、灵敏准确、重复性好的特点。PAGE\#"'页：'#'

'"对选育的产单宁酶黑曲霉菌株进行固体发酵产单宁酶研究，结果表明产单宁酶的最适氮源为NH4NO3，对发酵培养基进行单因素优化结果表明：每5g培养基基质含1％NH4NO3；0.1％NaCl；0.1％MgSO4；8％五倍子；90%麸皮。对发酵条件的单因素优化后得到：初始水分含量50％，初始ph6.0，温度300C为最佳产酶条件。利用响应面方法对显著影响产单宁酶的培养基及培养条件因素进行优化，得到固体发酵黑曲霉诱变株最佳产单宁酶酶条件为：五倍子含量为9.5％；氮源NH4NO3添加量为2.3%；温度为320C。在此最佳发酵条件下发酵产单宁酶达219.4U/PAGE\#"'页：'#'

'"对发酵产单宁酶进行固定化研究，以海藻酸钠为固定化单宁酶的载体，采用交联-包埋-交联的方法对单宁酶进行固定化。对前交联戊二醛浓度，前交联时间、温度，海藻酸钠浓度，CaCl2浓度，硬化时间，后交联戊二醛浓度，后交联时间、温度等固定化工艺进行研究，对固定化单宁酶的性质进行了初步研究。关键词：单宁酶黑曲霉固体发酵单宁酶固定化PAGE62AbstractThefullnameofTannaseisthetanninesteracidradicalhydroltyicenzyme(Tannase,theEC0),bywhichesterkeyandshrinkphenolcarboxylickeyofthegallicacidtannincouldbehydrolyzedintothegallicacidandtheglucose.TheTannasemainlyproducedbymicrobiologywasusedwidely,existinginandoutsidethecell.AtpresentthePenicilliumandtheAspergillusnigerarestudiedmorethanothers.AnAspergillusnigerstrainproducingtannasehighlywasselectedbyultravioletmutafacientmethodinthispaper.Measurementabouttheactivityoftannaseinthesolidfermentwasstudiedandestablilshed.OptimizationoffermentationconditionandtheculturemediumwascarriedoninthisAspergillusnigerstrainproducingtannasehighlythroughsolidferment,bywhichenzymeactivitywasincreased.Finallyimmobilityoftannasewasalsostudied.Effectivelyinitialsievemethodwasusedinthisstudyasfollow.Thetinytetrabromophenolsulfonphthalein(0.004%)wasaddedintothedullculturemedium,Aspergillusnigerstrainwasinducedbyultraviolettoselectonestrainhighlyproducingtannase92U/mLsuccessfullyaftertheinitialselectionofstrainswithcolor-changingloopbygrowingofAspergillusnigerwhoseactivityoftannaseenhancedmorethan1time.Thisrebuildingmeasurementoftannaseactivitywassimple,sensitive,directandgoodatduplication.Thisexaminationofactivityoftannaseproducedthroughthesolidfermentationoutsideofthecellhadthecharacterofhigheffectivityandaccuracy.Examinationperformedunderthe520nmwavelengthhadsuccessfullyavoidedwavelengthofabsorptionpeakofthedisturbancematerialtoreducetheerror.Thesetofcontroltubeandblanktubecouldeliminateinfluenceofthegallicacidandthetannicacidinthethickenzymefluid.Thegallicacidpropylesterasthesubstratecoloredobviously,whichwasrequestedlowlyinthepurityofsubstratesothattheconventionalinstrumentinthelaboratorycancarryontheexamination.ThroughthestudyoftannaseproducedbysievedAspergillusniger,theresultindicatedthatthemostsuitablenitrogensourceoftannasewasNH4NO3,andeach5gculturemediummatrixcontains1%NH4NO3;0.1%NaCl;0.1%MgSO4;8%gallnuts;bran.theinitialmoisturecontent50%,initialPH6.0,300℃inthetemperatureasthebestconditionweregainedbythePAGE62optimizationofthesinglefactoroffermentcondition,andtheactivityoftannasecouldbeenhancedhighlybyadding8%gallnutsintomedium.Thusweknewthatthebestconditionofproducingtannasebysolidfermentationwas9.5%gallnutcontent;2.3%nitrogensourcerecruitment;320Cinthetemperature.Theactivityoftannasewas219.4U/mLbytheconfirmationexperimentaccordingtothebestfermentationcondition.Theseaalginicacidsodiumhadbeenchoseasthecarrieroftheimmobilityoftannasebythemethodoflinking-embedding-crossinglinking.Westudiedinfluenceofreturns-rationoftannaseactivitybythedensityoftheglutaricdialdehyde,thetime,thetemperature,densityoftheseaalginicacidsodium,thecacldensityandthefirmtimebeforethecrosseslinkinganddensityoftheglutaricdialdehyde,timeandtemperatureafterthecrosseslinking.Finallywestudiedpartlythenatureoftannaseimmobilized.Keywords:tannaseAspergillusnigersolidfermentationimmobilityoftannasePAGE62第一章文献综述1.1引言单宁酶全称是单宁酯酰水解酶（Tannase,EC0），它可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖。单宁酶在自然界中分布相当广泛，较早的有关单宁酶的报道可以追溯到上世纪二十年代，Freudenberg［1］在进行黑曲霉培养时发现在其菌丝中含有单宁酶，以后又发现各类微生物，包括真菌、酵母、细菌都能产生单宁酶；单宁酶还存在于一些植物材料中，例如茶叶提取物。单宁酶不仅分布广，而且用途也较多，但单宁酶的研究开始都围绕着茶叶加工业展开，日本和美国在这方面的研究开展较早，并取得了很多成果。我国20世纪90年代才开始了单宁酶的研究，由于单宁酶的应用日趋广泛，因此对单宁酶的深入研究变得十分迫切。单宁酶用途广泛，但是由于生产提纯过程复杂、产量很小所以市场价格昂贵。这样就使单宁酶的应用受到限制。单宁酶属于诱导酶，主要利用微生物发酵生产，发酵方法有液体发酵和固体发酵两种，国内对单宁酶发酵生产主要以液体发酵研究为主，迄今为止，所有的单宁酶研究和生产中都将单宁酸或含有没食子单宁的原料作为发酵培养基中必需的组分。P.K.Lekha和B.K.Lonsne［2］在对黑曲霉DKL104进行液体表层发酵、液体深层发酵和固体发酵比较实验时发现，固体发酵与液体发酵不同，固体发酵黑曲霉所产的单宁酶几乎全部都是胞外酶，而且比液体发酵在缩短一半的培养时间的同时，酶产量可分别提高1.8倍和2.5倍，固体发酵方法较液体发酵法有许多优越性。而国内绝大多数研究者采用液体发酵法研究单宁酶的生产，所得到的胞内单宁酶活性都较低。国外有一些固体发酵生产单宁酶的研究报道，A.Sabu［3］等利用罗望子果实棕榈果仁作为培养基基础，进行固体发酵黑曲霉产单宁酶的研究，得到单宁酶的酶活力最高为12.7U/g干基。B.Trevino-Cueto［4］等用富含单宁酸的沙漠植物作为培养基基础对黑曲霉进行固体发酵，所得到的酶活力为9.2U/g干基。纵观近50年来单宁酶研究领域中的相关文献报道，单宁酶研究的发展趋势主要为:(1)采用基因工程技术，构建出高产单宁酶基因工程菌，为单宁酶的工业化生产和大规模应用提供优良的菌种。(2)进一步完善产单宁酶发酵工艺，提高酶生产效率，降低生产成本。(3)尝试构建出更为适合工业化的单宁酶提纯技术，进一步降低酶生产的成本。(4)在单宁酶的应用中，采用固定化酶技术甚至是固定化细胞技术来克服游离酶自身的缺陷，满足单宁酶在各工业领域的应用需求。(5)PAGE62在单宁酶原有应用领域的基础上，开拓其在其它更广泛领域中的应用前景，充分发挥其潜在的应用价值。1.2单宁酶的性质1.2.1单宁酶的理化性质纯单宁酶在紫外光区280nm处,有一个最大吸收峰,在浓度为10%,比色皿为1cm×1cm条件下,吸光系数a为11.8,260nm处吸光度与280nm处吸光度之比为0.51［5］，SadaakiIibuchi［6］,ChaeSoo-Kyu［7］分别用凝胶过滤法测定出它们各自选育的菌种单宁酶相对分子质量都为200000。OsaoAdachi［5］等分别用沉降法和电泳法测定黄曲霉单宁酶相对分子质量,分别是194,000和192,000。BarthomeufC.[8]等测出黑曲霉LCF8单宁酶相对分子质量为186,000,其等电点在4左右。BarthomeufC.和ChaeSoo-Kyu等在对各自提纯的酶进行SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳分析时发现,单宁酶分子由2种亚基组成,但这个结果与KenjiAoki［9］对酵母单宁酶结构分析的结果有所不同。后者用同样的方法,只得到一条电泳蛋白带。1.2.2单宁酶的酶学性质多数菌株单宁酶的活性ph稳定范围都在3.0～8.0之间，最适ph值为4.0～6.0，热稳定范围在60～70℃以下，最适温度为30～60℃。YamadaH.等(1968)报道的黄曲霉单宁酶活性的ph稳定范围最窄，为5.0～5.5.ChaeSoo-Kyu等[7](1983)报道的曲霉AN-11菌株所产单宁酶活性的ph稳定范围为5.0～6.5。来源于不同菌株的单宁酶动力学性质稍有区别。YamadaH.等[10](1968)就底物浓度对黄曲霉单宁酶的影响进行研究，测出Km(以单宁酸为底物)为0.5×10－4mol/L;Km(以葡萄糖一1一没食子酸为底物)为1.4×10－4mo1/L;Km(以没食子酸甲酯为底物)为8.6×10－4mo1/L。RajakumarG.S.等［11](1983)测得产黄青霉所产的单宁酶以单宁酸为底物时，其Km为0.48×10－4mol/L。FariasG.M.等[12](1994)测得Cryphonectriaparasitica所产的单宁酶以单宁酸为底物时，其Km为0.95×10－3mol/L；以栗木单宁为底物时，其Km为5.07×10－3mol/L；而以没食子酸为底物时，其Km高达11.0～13.1×10－3mol/L，故没食子酸是单宁酶底物中最具竞争性抑制的底物之一。由此他们得出结论，单宁酶对特定的单宁底物的相对酶活可能是与该底物中酯键和缩酚羧键的数量有关。SharmaShweta.等[13](1999)测得黑曲霉所产的单宁酶的Km为0.2×10－3mol/L.有关各种金属离子以及EDTA对单宁酶活性影响的报道结论不一。KenjiAoki等[9](1976)研究表明ZnC12,CuS04,CoCl2和NiS04等不同的金属离子对单宁酶酶活力无影响，而EDTA对酶活力影响不明显。相反，RajakumarG.S.等[11](1983)研究表明Cu2+,Zn2+,Fe2+甚至是Mg2+等不同的金属离子均对单宁酶酶活力有着显著的抑制效应。同样，SadaakiPAGE62libuchi等[6](1968)研究表明任何金属盐均不能激活单宁酶，ZnC12和CuCl2:则会抑制酶活力或使酶失活。此外，EDTA溶液也会使单宁酶完全失活。郭鲁宏等[14](1999)研究发现除了Mn2+和Fe2+抑制单宁酶酶活之外，其它金属离子则对酶活均无明显的激活作用或抑制作用。1.3单宁酶分离纯化及菌株筛选单宁酶主要是由微生物生产的，能够产生单宁酶的菌种十分丰富，除了传统的青霉、曲霉、酵母，还有巴斯德菌、寄生内座壳菌、绿色木霉和茄形镰刀菌等，单宁酶既存在于细胞内，又存在于细胞外。但是目前研究得较多较为深入的还是青霉和曲霉。1977年S.Bradoo等［15］建立了一种利用平板筛选单宁酶的方法。其平板培养基由1%的单宁加上3%的琼脂，将要筛选的菌种点种在平板上适宜温度下培养48h，以菌落周围的透明圈直径与菌落直径的比值为筛选标志。郭鲁宏等［16］在此基础上对培养基作了一些改进，在培养基中加入了溴酚蓝。由于五倍子单宁被分解成没食子酸，培养基的ph值由4.5左右降为3左右，这与溴酚蓝的变色范围基本一致，因此培养基由紫色变为黄色，而且少量的溴酚蓝（0.004％）不会对黑曲霉的生长及单宁酶活性造成不利影响，用这样的培养基进行初筛非常直观，而且准确高效。单宁酶既存在于细胞内，又存在于细胞外，通常发酵液中的单宁酶，一般采用硫酸铵盐析或加入丙酮、乙醇等有机溶剂使之沉淀，然后过滤，得到粗酶。Libuchi等［17］在发酵液中加入硫酸铵达到0.8饱和度，放置15小时后，用加有助滤剂硅藻土535的漏斗过滤，再将沉淀溶于水中，离心后得到粗单宁酶液，进一步用DEAE－SephadexA50离子交换，SephadexG-100凝胶过滤，获得了纯化的单宁酶，并进行了性质研究。Parthasarathy等［18］用SephadexG－200凝胶过滤，再用DEAE－SephadexA25柱作离子交换层析纯化粗单宁酶。Aoki等［19］使用Ecteola-纤维素、Sepharose6B和SephadexG－200纯化假丝酵母单宁酶。王征等［20］采用40％的硫酸铵和80％硫酸铵两部盐析法沉淀单宁酶，经过透析，DEAE－纤维素阴离子交换层析，SephadexG－150柱层析，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，单宁酶达到电泳纯，经过上述酶纯化过程，提纯倍数达到115，酶回收率为21％。单宁酶的提纯技术正在从复杂的实验室提纯向工业化生产过渡。对于菌丝体中的单宁酶要先进行细胞破壁，研究者们探索了很多细胞破壁的方法，有利用超声波、石英砂研磨、渗透压法等经典方法破壁的，也有研究者探索一些新的酶得率更高的方法，如法国学者利用冻融法，再加入伴刀豆球蛋白（凝集素）破壁［21］，效果不错。PAGE621.4单宁酶的酶活力测定单宁酶的活力检测一般用单宁酸来作为酶活力测定底物，其基本原理是单宁酸在310nm处的吸光值可因酶促反应的发生而改变，这样就可根据改变量计算酶活。但用单宁酸作为底物的不足之处是底物单宁酸对产物没食子酸的光吸收有很大的干扰。现在有些研究者已尝试用别的底物替代单宁酸。研究人员为了满足各自研究的需要，选用不同的底物、不同的测定参数，以底物的减少或产物的增加甚至是ph值改变等作为测定对象，构建出各具特色的单宁酶酶活力测定方法。这些测定方法大致归类为滴定法、紫外分光光度法、比色法和高效液相色谱法等。(1)紫外分光光度法。SadaakiIibuchi等［22］于1967年建立了紫外分光光度法,基本原理是根据底物单宁在310nm处吸光度的变化求酶活力。大多数研究者都采用这个方法，此法简单快捷,且误差在1%～3%之间,但此法底物对产物没食子酸的光吸收有很大的干扰，对底物单宁纯度要求非常高。也有研究者尝试用其他底物来替代单宁，如甲基没食子酸,没食子酸丙酯。如王征等［23］采用了没食子酸丙酯（PG）作为单宁酶底物，取得了较好的效果。这种底物浓度允许范围较广，有利于酶活力的测定。并且在270nm波长下底物PG的浓度变化可通过吸收值的明显变化而被灵敏的测定出来，避免了产物没食子酸光吸收的干扰。(2)滴定法。由于单宁在单宁酶作用下分解生成游离的没食子酸,可用碱对之进行滴定,确定底物单宁的减少量而测得酶活力.但是,因为缓冲液对碱的缓冲力以及单宁本身的褐色干扰了滴定终点,再者,随溶液ph值增高,单宁会逐渐发生水解,将影响测定结果的稳定性与准确性［22］。(3)视读法。澳大利亚科学家OsaweR［24］于1993年,建立了细菌单宁酶活力测定方法,其根据有两点:①单宁可水解生成游离的没食子酸；②没食子酸在空气中暴露被氧化，颜色从绿色变成褐色.通过比色求其变化量而测得酶活力。(4)高效液相色谱法。1994年,法国的ChantalBarthomeuf等［25］用高效液相色谱法连续测定反应过程中产物没食子酸变化量,直接测定出酶反应的初速度,此法迅速准确,但对仪器要求较高.(5)气相色谱法。1981年Jean.D[26]等以没食子酸甲酯为底物，采用气相色谱法连续测定酶促反应过程中没食子酸的变化量直接求出酶促反应的初速度，该方法准确，但操作繁琐且实验仪器要求很高，为非常规测定方法。PAGE621.5单宁酶的固定化1.5.1固定化酶的方法和特性固定化酶的制备方法分为四类：吸附法、包埋法、共价结合法和交联法。吸附法分为物理吸附法和离子吸附法[27]。酶被载体吸而固定化的方法称为物理吸附法。离子吸附法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法。包埋法可分为网格型和微囊型两种。前者是将酶包埋于高分子凝胶细微网格内；而后者是将酶包埋在高分子半透膜中制备成微囊型。共价结合法是将酶与水不溶性载体以共价键结合的方法，此法研究较为成熟。交联法是用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子之间的交联，是酶分子和双功能试剂或多功能试剂之间形成共价键，得到三向的交联网状结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在一定的分子内交联。酶经固定化后，活力大部分下降，这是因为：①酶活性部位的重要氨基酸与水不溶性载体相结合；②当酶与水不溶性载体相结合时，它的结构起了变化；③酶被固定化后，酶与底物的相互作用受到空间位阻的影响。固定化酶的稳定性一般要比游离酶提高很多，有利于工业生产。热稳定性对工业应用极为重要。多数固定化酶的酸碱稳定性高于游离酶，这体现在其反应最适ph范围变宽。固定化酶在操作中可以长时间保留活力，半衰期在一个月以上即有工业应用价值。1.5.2单宁酶的固定化单宁酶能够水解单宁的酯键，生成没食子酸和葡萄糖，没食子酸可以作为医药中间体，又可作为食品、化妆品及饲料的抗氧化剂，近年来还用作感光树脂的原料，应用广泛。单宁酶价格昂贵、使用寿命较短，其应用受到一定限制，固定化单宁酶既能保持酶的活性，专一性强，又具有可反复使用、贮藏性好、ph值与温度范围宽的特点，因此研究者对单宁酶进行固定化研究。WeetallH.H.等［28］对单宁酶的固定化进行了探索,将单宁酶用一定孔径的多孔玻璃珠固定,同时,他还对固定化的单宁酶的ph范围、热稳定性及半衰期进行了研究。程琦［29］用自制的壳聚糖固定单宁酶,测定固定化单宁酶表观Km值(以没食子酸丙酯为底物)、最适ph值以及稳定活性ph范围,并将之应用于酯型儿茶素水解反应中，可水解茶多酚提取物中96%以上的酯型儿茶素，但此项技术尚未见应用于生产的报道。龚加顺等［30］PAGE62利用海藻酸钙包埋固定单宁酶在水相中水解没食子单宁生产没食子酸，并利用聚乙烯醇－戊二醛法制备的固定化单宁酶在有机相中生产没食子酸丙酯。王征等［31］讨论了聚阳离子聚2-羟基-N,N-二甲基氯丙胺对固定化酶的影响，ph值对固定化酶的影响及固定化酶的稳定性。采用聚阳离子复合物加固对酶的包埋程度,防止了使用过程中酶的渗漏,可使该酶延长使用寿命并提高稳定性。肖琳等［32］人比较几种固定化载体，确定以壳聚糖为载体，用戊二醛作交联剂制得固定化单宁酶，固定化酶活回收率可达73％。单宁酶经固定化后热稳定性、ph稳定性及最适温度均有所提高。英国专利报道[33,34]，单宁酶用硅藻土固定(25mg单宁酶/g硅藻土)，在ph5.5,40℃条件下处理“冷后浑”，效果很好。现在，纽约开发公司己开始批量生产该固定化单宁酶。日本专利报道，将单宁酶固定在聚砜中空纤维超滤膜上，然后用这种膜将茶汁趁热过滤，可避免“冷后浑”而得到澄清的茶汁。NicolasP.[35]等报道，将固定化单宁酶应用在20～65℃下浸提茶叶，该单宁酶可实现流化床操作。程琦等[29]研究表明，采用壳聚糖来固定单宁酶，龚加顺等［30］采用微孔吸附面积大的沸石固定化单宁酶，并应用于茶汤中“冷后浑”转溶研究，发现当茶汤浓度为10%,温度为40℃时，茶汤的澄清度最高可达41.5%，且茶饮料的口感品质己有显著改善和提高。程启坤[361.6单宁酶的应用1.6.1应用于食品工业利用单宁酶防止茶饮料中的“冷后浑”，效果非常好。在液态茶和速溶茶的生产中，由于茶汤中多酚类、咖啡碱、蛋白质等物质通过分子间氢键与疏水作用形成络合物，可在低温时沉淀，形成所谓的“冷后浑”，需要采取物理、化学或酶处理法来消除或使其变成可溶物，即“转溶”工艺。单宁酶就是酶法转溶的专一酶。它能断裂儿茶酚与没食子酸间的酯键，使苦涩味的酯型儿茶素水解，释放出的没食子酸阴离子又能与茶黄素、茶红素竞争咖啡碱，形成分子量较小的水溶性短链物质，从而降低茶汤的混浊度[37]，浑浊度由80%降至8%。单宁酶在茶饮料业中的应用越来越广泛深入。单宁酶应用于红茶、绿茶、乌龙茶深加工中，不仅可以提高茶叶品质、产量，而且能使茶叶中可溶性金属元素含量增加。LaurenS.等[38]报道，用单宁酶处理红茶，茶汤中可溶性铁、钙的含量分别增加了23%与15%。若在绿茶加工中使用单宁酶，可使离子铁和高铁的含量均提高18%，并部分消除夏春茶的苦涩味，提高茶品质。Procter及GambleCo.[39](1985)PAGE62对红茶进行单宁酶处理，结果发现速溶茶完全溶于冷水，而且滋味良好，而无酶处理的茶的固形物和浸提物产量均低于酶处理的茶。单宁酶还可用以辅助茶叶抗氧化剂来对抗食品氧化。MaiJ.[40]等报道用单宁酶处理的红茶水浸出物抗氧化能力增强。此外，单宁酶可应用于啤酒和果汁的澄清、防止果酒和果汁中酚类引起的变质、咖啡风味的软饮料生产、麦芽多酚的稳定处理、葡萄酒风味的改进以及作为测定天然没食子酸酯类结构的一种灵敏的分析探针[41]。1.6.2制革工业在皮革生产中，单宁能与动物皮层中的蛋白质结合形成沉淀，从而将生皮鞣制成难以透水、致密而柔软的革。1.6.3饲料工业来源于植物的饲料往往含有单宁，它可以使植物蛋白以及家畜自身所分泌的消化酶蛋白凝固沉淀，从而减少家畜对摄入蛋白的消化率和增加粪便排泄中的氮源[42]。因此，在饲料加工过程中如用单宁酶进行相应处理，将大大提高家畜对植物蛋白的利用和吸收率，降低畜牧业的生产成本。1.6.4化妆品工业由于单宁酶具有水解单宁酸中酯键的性质，故在化妆品生产中也已得到应用。为了适应人们回归大自然的心态与爱美的追求，许多化妆品公司争相开发具备滋养、祛斑、防晒、生发等多种功效的产品，这些产品普遍加入一些植物提取物。当加入某些含有单宁的植物提取液时，会使化妆品出现混浊或者结块现象。因此，事先如果用单宁酶对这些植物添加剂进行相应处理，那么上述情况就可望避免[43]。1.6.5精细化工与制药工业没食子酸是单宁酸水解产物中的主要化工产品，是食品抗氧化剂没食子酸丙酯和制药工业中甲氧苄胺嘧啶(trimethoprim)化学合成所必需的一种重要原料[44]，近年来还可用作半导体感光树脂的原料[45]。目前，没食子酸大多是由单宁酸经硫酸水解而成[46]，其产率约为65%。由于硫酸水解法生产没食子酸存在着严重污染环境和对设备损耗大等问题，微生物单宁酶水解法应运而生。郭鲁宏等[45]采用海藻酸钙包埋来源于黑曲霉的单宁酶，并将此固定化单宁酶应用于制备没食子酸，3次实验中没食子酸产品的平均产率达到61%，与目前工业生产中所采用的硫酸水解法基本相当，具有潜在的工业开发价值。同年，KarB等[47]PAGE62在印度当地分离获得一株单宁酶高产的米根霉菌株，以富含单宁的云实(Caesalpiniadigyna)豆荚粉作为原料，分别进行固体发酵、深层液体发酵和改进的固体发酵，将单宁生物转化成没食子酸，转化率分别可达30.5%,27.5%和90.9%。没食子酸酯类是没食子酸的重要衍生物之一，能促进纤维蛋白和血栓的溶解、扩张血管、增加冠动脉血流量及有效抑制血小板的凝集，广泛地应用于治疗心脑血管疾病[48]。同时，没食子酸酯类还可清除体内的氧自由基，对炎症、病毒性疾病、细菌感染性疾病、胃溃疡、辐射损伤、过敏及老年性痴呆等均有一定的治疗和防治作用[49,50]，在医药领域中具有广泛而重要的应用前景.其中没食子酸丙酯(propylgallate,PG)表现得尤为突出。PG是FAO/WHO组织批准的油溶性合成食品抗氧化剂，对人体无任何毒副作用，是国际上通用的食品抗氧化剂[51].PG的医药商品名为“通脉酯”，是治疗心脑血管疾病的一类新药，具有抗血小板聚集、增强纤维蛋白和血栓溶解、扩张血管及增加冠动脉血流量等疗效[52,53]。同时它还能清除体内氧自由基、预防乳腺癌，对Lrewis肺癌具有抑制和抗转移作用[54]。1.7本课题立题意义和研究内容1.7.1本课题的立题意义单宁酶是一种用途相当广泛由微生物发酵产生的酶类，可用在食品加工业上，是消除茶叶冷后浑的专一酶类，另外单宁酶还可用在制革业、精细化工行业以及制药行业等，单宁酶的市场需求量大。但由于利用微生物液态发酵产量少，精制提纯的过程复杂，市场售价相当昂贵，国产的粗单宁酶每50g售价为750￥，而日本产的精制纯单宁酶市场售价高达每2320￥/250mg。我国对单宁酶的研究起步较晚，国内还没有大规模的单宁酶工业生产。我国在诱变育种、发酵、提纯、固定化等各个方面的研究都还不太完善，诸多因素制约了单宁酶的生产和应用。世界上其他一些国家在单宁酶的研究开发上远远走在我国的前面。通过生物技术来进行黑曲霉的诱变育种获得单宁酶高产菌，采用固体发酵的方法对该菌产单宁酶的条件进行研究，增加酶产量、提高酶活、缩短发酵时间。采用海藻酸钠为固定化单宁酶的载体应用交联-包埋-交联法的固定化方法对固体发酵提取的粗单宁酶液进行固定化，固定化单宁酶使单宁酶温度、ph最适范围增大，酶活稳定性增加，有利于酶分子抵御外界环境的变化。本课题的研究为工业化规模开发应用单宁酶奠定了理论基础。1.7.2本课题的研究内容本课题通过紫外诱变选育手段筛选到一株单宁酶高产菌，建立了一种快速PAGE62简便的固体发酵单宁酶活力检测手段，解决了固体发酵产酶酶活难检测的问题，进行了固体发酵黑曲霉产单宁酶的研究，对培养基及培养条件进行了单因素实验研究，采用五倍子为诱导物添加于培养基中大大提高了单宁酶的活力，同时采用响应面方法优化了固体发酵产酶的工艺条件。另外本论文还探索了了固定化单宁酶的方法和条件，利用海藻酸钠作为载体采用交联－包埋－交联的方法对固体发酵提取的粗酶液进行固定化，并对固定化酶的性质进行了初步研究。本课题的创新之处体现在两方面，一方面是建立了一种胞外单宁酶活力检测方法，解决了胞外单宁酶活难检测的问题；另一方面进行了利用五倍子固体发酵黑曲霉产单宁酶的研究，在固体发酵黑曲霉产单宁酶方面国内还未见报道。PAGE62第二章产单宁酶黑曲霉菌株的诱变及筛选2.1前言单宁酶主要是由曲霉属真菌产生，其中以黑曲霉（Aspergillusniger）研究和应用得最为广泛。黑曲霉作为单宁酶的产生菌，国内外学者对其理化特性、菌种选育、菌株生长条件等诸多方面进行了长期大量的研究，但其产酶性能均不甚理想，直接从自然界筛选获得的野生黑曲霉产酶能力无法满足实际生产的需要。另外，通过基因克隆菌株大量生产微生物单宁酶的技术也尚未完善。因此，在产单宁酶的野生黑曲霉菌株的基础上，采用诱变育种的方法来提高单宁酶活性和产量，不失为一种简单、快捷、经济的可行方法。诱变育种一般是针对微生物细胞进行的。微生物细胞经过物理和化学方法处理后易发生突变，尤其对于黑曲霉等丝状真菌特别适用。我们借鉴郭鲁宏有关紫外诱变选育黑曲霉高产单宁酶的经验，通过设计特殊筛选培养基，利用紫外诱变方法对黑曲霉产单宁酶菌株进行诱变，旨在选育黑曲霉单宁酶高产菌。2.2材料与设备2.2.1菌种黑曲霉（Aspergillusniger）菌株由贵州大学食品实验室提供2株，贵州大学真菌资源研究所提供3株。2.2.2培养基单宁酸培养基蔗糖3g；NaNO30.6g；K2HPO40.2g；MgSO4.7H2O0.1g；FeSO40.002g；琼脂6g；单宁酸5g；自来水200mL初筛平板上述单宁酸培养基中加入0.004％的溴酚兰。基本培养基(察氏培养基+2%单宁酸)单宁酸2.0%，蔗糖1.0%，NaN030.3%，K2HP040.1%，KCl0.05%,MgS047H2O0.05%，FeSO40.001%，自然ph值。PAGE62菌种保藏培养基马铃薯琼脂培养基2.2.3实验仪器实验所用到的仪器设备见表2-2。表2-1实验药品及相关信息Tab.2-1Chemicalreagentsandrelatedinformation序号药品名称分子式（英文名称）级别生产单位1氢氧化钠NaOH(Sodiumhydroxide)分析纯成都科龙化工试剂厂2可溶性淀粉(C6H10O5)n(Starchsoluble)分析纯天津市瑞金特化学品有限公司3海砂(Seasand)国药集团化学试剂有限公司4柠檬酸C6H8O7.H2O分析纯上海化学试剂总厂经贸5柠檬酸三钠C6H5Na3O7.2H2O分析纯重庆化学试剂总厂6无水乙醇CH3CHOH分析纯成都科龙化工试剂厂7盐酸HCl分析纯重庆川江化学试剂厂8硫酸H2SO4分析纯遵义师范学院化学试剂厂9绕丹宁rhodanine分析纯上海均创化工有限公司表2-2仪器及相关信息Tab.2-2Instrumentandrelatedinformation序号仪器名称规格型号生产单位1722S分光光度计722S上海精密科学仪器有限公司2万用电炉DK－98－=2\*ROMANII天津市泰斯特仪器有限公司3电热鼓风恒温干燥箱101－1A泸南电炉烘箱厂4电热真空干燥箱ZK025B上海实验仪器有限公司5洁净工作台SW-CJ-LFD上海博讯实业有限公司医疗设备厂6离心机AnkeTDL－5上海安亭科学仪器厂7生化培养箱SPX-250B-Z上海博讯实业有限公司医疗设备厂8立式压力蒸汽灭菌器YXQ-LS-50SI上海博讯实业有限公司医疗设备厂9显微镜ECLIPSE-E200Nikon公司10电子恒温水浴锅DZKW－4上海科析试验仪器厂11循环水式真空泵SHZ－D(=3\*ROMANIII)巩义市英峪予华仪器厂12精密增力电动搅拌器FuheJJ-1金坛市富华仪器有限公司13电子天平FA1004上海良平仪器仪表有限公司14精密酸度计PHS－3C上海虹益仪器仪表有限公司15100～500μL微量进样器100～500μL上海求精生化试剂仪器有限公司161000～5000μL微量进样器1000～5000μL上海安亭微量进样器厂17恒温培养震荡器ZHWY-111B上海智城分析仪器制造有限公司18霉菌培养箱MJ-160B-II上海跃进医疗器械厂29紫外-可见分光光度计U2550型上海第三分析仪器厂PAGE6230离心机TDL-40B型上海安亭科学仪器厂2.3实验方法2.3.1实验菌种的培养及初步鉴定将获得的五株菌分别编号为NO.1、NO.2、NO.3、NO.4、NO.5转接入单宁酸培养基中，进行斜面与平板的培养，培养于300C的恒温培养箱中72h。2.3.2出发菌株的筛选配制初筛平板培养基：(见)蔗糖3g；NaNO30.6g；K2HPO40.2g；MgSO4.7H2O0.1g；FeSO40.002g；琼脂6g；自来水180mL单宁酸5g；自来水20mL（1）与（2）分开灭菌，灭菌后待冷却到400C左右时将（1）和（2）混合再加入0.008g溴酚蓝，倒平板备用。接种待五株菌斜面孢子长成熟后，分别用10mL无菌水刮擦下斜面孢子，制成孢子悬液，吸取0.1mL孢子悬液，稀释一定倍数后接种于平板初筛培养基，放置于300把实验菌的孢子涂在含有溴酚蓝的平板培养基上，当孢子生长成为菌落时，单宁酸被分解为产物没食子酸，培养基颜色就由紫色变为黄色（见图2.1），从而在菌株周围形成明显的变色圈，变色圈的颜色深浅和圈直径大小代表形成的没食子酸含量的高低，及同该菌株的产酶水平呈正相关，据此可评估试验菌单宁酶活性的高低。图2.1黑曲霉在初筛培养基上生长状况PAGE622.3.3紫外诱变取具有较高单宁酶活性菌株的斜面，用无菌水将孢子洗下，加入灭过菌且盛有玻璃珠的三角瓶中，振动使孢子充分散开，再用玻璃纤维过滤，制成孢子悬液，并调整孢子浓度为1×106个／mL左右。在无菌平皿中加入5mL孢子溶液，距离15W紫外灯下20cm处，搅拌照射一定时间，吸取0.1mL孢子溶液进行梯度稀释，涂平板，300C培养箱中避光培养72h。2.3.4复筛方法初筛菌株在斜面上传代2～3次后，接种一环孢子到装有50mL复筛培养基的250mL三角锥瓶中，300C振荡（120r/min）培养72小时，按照.5粗酶液的提取取100mL发酵悬浮液，经布氏漏斗抽滤得菌丝体，用蒸馏水冲洗菌丝体至ph中性，然后置于0.5Mph5.0的柠檬酸缓冲溶液中漂洗，抽滤除去水分，称重后放入冰箱中预冷。后以1：1：5的比例与石英砂、缓冲液一起加入到研钵中，冰浴研磨成浆，5000rpm离心20分钟后取上清液移入50mL容量瓶中，用抽提酶的缓冲液定容，即得单宁酶粗酶液。2.3.6酶活测定方法按照王征［23］测酶活方法测定酶活力，取4支洁净的10mL具塞试管,分别设定为对照平行管与测定平行管。在每支试管中先后各加入1mol/L柠檬酸缓冲液和1mL酶液,40℃下平衡5min,先将4mL99%乙醇加入对照管中,使酶失活。5min后,在4支试管中加入底物PG溶液,40℃保温,准确反应10min,同法终止测定管的酶促反应。从上述4支反应管中各取1mL反应液,分别定容至10mL,并测定其在270nm处吸收值A。以重蒸水代替PG液重复上述操作作为空白。将反应温度为40℃条件下,1mL酶液每分钟使PG液在270nm处减少0.001个吸收值定义为1个酶活力单位。2.3.7单宁酶高活性菌株的产酶稳定性参考植酸酶的诱变选育工作，进行了产酶稳定性实验。把上面筛选得到的单宁酶高活性菌连续传代转种8次，分别接种入复筛培养基中进行培养，培养结束后，检测单宁酶活性，根据活性变化情况来考察单宁酶高活性菌株的产酶稳定性。PAGE622.4实验结果与讨论2.4.1实验菌种的初步鉴定由贵州大学食品实验室提供2株菌和贵州大学真菌资源研究所提供3株菌，是根据方心芳介绍的方法，转接到单宁酸选育培养基上。方先生认为能在单宁酸培养基上生长的菌很少，因为单宁酸具有很强的杀菌作用，但所有黑曲霉都能在其中生长，所以单宁酸培养基是储藏黑曲霉的一种绝好培养基。一部分青霉虽然也能在其上生长，但其生长的合适温度不同于黑曲霉。即300C2.4.2出发菌株的筛选此种平板显色法利用溴酚兰的变色范围与黑曲霉生长过程中ph值变化基本一致的特点，根据菌落周围变色圈的大小和颜色深浅，可初步估计黑曲霉菌株的产酶能力。在培养基中加入低剂量的溴酚兰不会对黑曲霉的生长及单宁酶活性造成不利影响，该方法直观，操作简单，准确。经初筛后的菌株产单宁酶的能力和复筛相比较，结果一致。经反复比较发现五株菌中有三株菌活性较高，最后确定用这三株菌（NO.1、NO.2、NO.4）作为出发菌株进行紫外诱变，选育高产单宁酶的菌株。表2.35株黑曲霉试验菌种的单宁酶活性菌株编号单宁酶活性菌株编号单宁酶活性1＋＋＋2＋＋＋3＋＋4＋＋＋5＋＋＋＋：单宁酶活性较高；＋＋：单宁酶活性中等；＋：单宁酶活性较低由表中可以看出，黑曲霉NO.1、NO.2、NO.4的单宁酶活性较高，选择它们作为紫外诱变的出发菌株诱变育种的原则，即诱变时选用多株出发菌株。一般要采用3～4株出发菌，经逐代处理比较后，留下产量高，性能好的菌株，这样容易在短时期内达到育种的目的。PAGE622.4.3紫外诱变筛选单宁酶高活性菌株紫外诱变致死曲线将NO1、2、4号菌株的孢子制成悬液，分别取5mL加入三只无菌平皿中进行紫外诱变，诱变刚开始时取样，以后每间隔0.5min取一次样，把样品进行梯度稀释后涂平板，培养72h后统计菌落数目，计算诱变致死率。诱变开始时形成的菌落数－诱变一定时间形成的菌落数诱变开始时形成的菌落数－诱变一定时间形成的菌落数诱变开始时形成的菌落数诱变致死率（％）＝×100%诱变开始时形成的菌落数以致死率（％）为纵坐标，时间（min）为横坐标可作出这三株菌进行紫外诱变的致死曲线，见图2.2：图2.2实验三株菌紫外诱变的致死曲线从图2.2可得出，虽然三株菌均为黑曲霉菌株，但对它们作紫外诱变时，它们的诱变致死率在相同时间时是不一样的。紫外诱变后的初筛由于用小剂量（致死率50～80％）进行诱变处理时，在单位存活细胞中正突变株多，因此现在多选用小剂量。本实验采用80％左右的致死率，此时对应这三株菌的诱变时间分别是3min，4min，4min，它们的诱变及初筛情况如下：NO.1经初筛获得单宁酶活性较高的菌株5株NO.2经初筛获得单宁酶活性较高的菌株7株NO.4经初筛获得单宁酶活性较高的菌株4株借助平板培养显色法初筛，共得到单宁酶活性较高的黑曲霉菌株16株，PAGE62紫外诱变后高产菌株的复筛在进一步的摇瓶复筛过程中，一些菌株的单宁酶活力并未提高甚至降低，另一些菌株则出现较大的回复突变，高产酶活只能维持1～2代。从16株初筛菌株中进行复筛，反复筛选后得6株产酶较高的菌株，这6株菌与出发菌株的比较情况见下表：表2.4诱变后的菌株与原始出发菌株比较原始菌株NO.1NO.2NO.4诱变菌株NO.1~1NO.1~2NO.2~1NO.2~2NO.2~3NO.4~1酶活（U/mL）28酶活性较出／发菌株提高(%)796518213237／9274621481006732／71121由表2.4中可以看出，这6株菌中以NO.2～1单宁酶活性最高。选取NO.2～1作为后续试验的出发菌株。黑曲霉单宁酶高活性菌株的选育为下一步进行的固体发酵产酶研究打下了坚实的基础，育种谱系如下图所示：图2.3黑曲霉菌株育种筛选系谱图2.4.4单宁酶高活性菌株产酶稳定性进行了产酶稳定性试验，把NO.2～1连续传代转种8次，每一代均进行摇瓶培养测定其单宁酶活力，NO.2～1菌株初始酶活力为92U/mL，传代数此后，其酶活力略微下降，至第6和第8代菌株时，其酶活力稳定在86U/mL，较初始酶活力下降6U／mL。NO.2～1菌株在连续传代过程中，酶活力稳定在86～92U／mL，见图2.4。显示出较高的传代稳定性。该菌株培养到72h时，菌落直径约2cm，圆形略微凸起，边缘较为粗糙，基内菌丝棕黄色，气生菌丝淡黄色，孢子颜色棕褐色，菌落周围是显著的黄色变色圈。PAGE62图2.4黑曲霉NO.2～1菌株在不同传代中单宁酶活性比较2.5本章小结（1）本研究采用的初筛方法行之有效，结果简单明了、快速灵敏，且微量的的溴酚蓝（0.004%）加入不会影响到黑曲霉的生长和单宁酶的活性。（2）本研究采用紫外诱变的常规选育手段进行黑曲霉菌株的诱变，成功的选育到了一株产单宁酶92U/mL的黑曲霉高产菌株。它的单宁酶活性较原始出发菌株提高了1倍多。而且紫外诱变设备简单、方法易行、操作安全、诱变效果好，所选育的菌株遗传性状稳定。PAGE62第三章单宁酶活力测定方法的构建3.1前言由于单宁酶应用广泛，因此建立一种方便快捷的酶活检测方法非常重要。尽管单宁酶的研究至今已近半个世纪，其酶活力的测定方法却始终没有统一，造成不同来源的酶活力值之间难以相互比较。在众多的单宁酶研究文献中，研究人员为了满足各自研究的需要，选用不同的底物、不同的测定参数，以底物的减少或产物的增加甚至是ph值改变等作为测定对象，构建出各具特色的单宁酶酶活力测定方法。这些测定方法大致归类为滴定法、紫外分光光度法、比色法和高效液相色谱法等。有研究表明［56］固体发酵与液体发酵不同，液体发酵黑曲霉所产酶为胞内酶，而固体发酵黑曲霉所产的单宁酶几乎全部都是胞外酶，固体发酵产酶量大，酶活性高。但是由于胞外单宁酶检测，无法象胞内单宁酶那样几乎完全除去单宁酸等干扰物质，因为胞外单宁酶提取液中往往含有比底物浓度高、具有与底物相似吸收波长的物质，这些物质干扰底物的吸收光谱，影响吸光值，从而影响检测的准确性。上述常用的测定方法只适用于测定胞内单宁酶活力，而不适用于测定胞外单宁酶活力。因此找到一种适合检测胞外单宁酶的方法，解决固体发酵所产酶，酶活检测难的问题显得尤为重要。本论文改进了Shwetasharma［57］建立的酶活测定方法，采用没食子酸丙酯（PG）作为单宁酶酶促反应底物，通过单宁酶水解底物产生的没食子酸与绕丹宁之间生成的色团物质在碱性条件下显色的原理，对固体发酵黑曲霉产胞外单宁酶的活性检测进行了考察，建立起了一种适合固体发酵黑曲霉所产胞外单宁酶的酶活检测方法，本方法简单、灵敏、重复性好。3.2实验材料与方法3.2.1菌种黑曲霉（Aspergillusniger）NO.2～1菌株，由黑曲霉菌株经紫外诱变选育而成。菌种在40C条件下保存在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，PAGE623.2.2培养基菌种保藏培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）固体发酵培养基单宁酸2.0％，NH4Cl1%w/v,MgSO4.7H2O0.1%w/v，NaCl0.1%w/v，97%麸皮，自然ph值。3.2.4试剂柠檬酸－柠檬酸钠缓冲溶液贮备液A：0.1mol/L柠檬酸（C6H8O719.21g配成1000mL贮备液B：0.1mol/L柠檬酸三钠（C6H5NaO7·2H2O29.41g配成1000mL）根据溶液ph的要求，贮备液A与贮备液B按照比例混合稀释。没食子酸丙酯底物溶液配置浓度为0.01mol/L的没食子酸丙脂溶液做检测酶活时的底物，称取0.021gPG用柠檬酸缓冲溶液定容到10mL。绕丹宁溶液配置浓度为0.667%(W/V)的绕丹宁溶液，称取0.0667g绕丹宁用甲醇溶液定容到10mL。3.2.5仪器UV2550型紫外－可见分光光度计。PHS-25型精密数显酸度计上海伟业仪器厂生产；TG328A型分析天平奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；梅特勒–托利多AG135天平上海梅特勒仪器公司；电热恒温水浴锅天津太斯特仪器有限公司；YXQ-LS-50SI型立式压力蒸汽灭菌器上海博迅实业有限公司医疗设备厂。3.2.5实验方法3.2.5用单宁酸和麸皮作为培养基基础。由NH4Cl1%w/v,MgSO4.7H2O0.1%w/v，NaCl0.1%w/v组成培养基的盐溶液。取5g单宁酸及麸皮的混合物装入250mL三角瓶中，加入5mL上述无机盐溶液，于1210C下灭菌20min，培养基冷却到室温后取1mL孢子悬液（11×109个孢子）移入三角锥瓶中，充分振荡使孢子与培养基混合均匀，放置于300C的恒温培养箱中培养96h。PAGE623.2.5取出培养箱中含单宁酶的固体培养基质，加入50mLph5.0的柠檬酸缓冲液，放置于160r/min摇床上1h后取出，用滤纸过滤即得粗酶液。3.2.5用没食子酸标准品配制没食子酸溶液。配制浓度为10μmol／L的没食子酸溶液，取该溶液0.5mL加入0.3mL甲醇绕丹宁（0.05mol/L）溶液，放入30℃水浴中保温5min，再在试管中加入0.2mL（0.5mol/L）的KOH溶液，再保温5min，加入4mL3.2.5用ph5.0的柠檬酸缓冲溶液来配制不同浓度的没食子酸标准溶液，从40μmol/L－260μmol/L配制12个不同的浓度梯度。分别取没食子酸标准溶液0.5mL，0.3mL甲醇绕丹宁溶液(0.05mol/L)加到所有试管中，在30℃条件下反应5min。0.2mL氢氧化钾(0.5mol/L)溶液加入到所有的试管后再次在30℃条件下恒温5min，最后在所有试管中加入蒸馏水4mL稀释，以蒸馏水作空白，用紫外－可见分光光度计在520nm波长下检测没食子酸标准溶液的吸光值，得到没食子酸溶液标准曲线。3.2.5此方法是根据没食子酸（单宁酶催化没食子酸丙酯水解产生）与甲醇绕丹宁之间形成色团物质的方法来测定单宁酶的活性，将30℃条件下每分钟产生1μmol没食子酸所需的酶量定义为一个酶活单位。取三支洁净的试管分别标记为空白管、测试管、对照管。将底物没食子酸丙酯以及粗酶液在反应开始之前先放入30℃水浴中预热5～10min。在被标记的三支试管中都加入0.25mL没食子酸丙酯溶液，接着0.25mL柠檬酸缓冲液加入空白管中，0.25mL粗酶液加入到测试管中后将三支试管都放入30℃水浴中保温5min，然后在所有试管中都加入0.3mL甲醇绕丹宁(0.05mol/L)溶液，30℃水浴中保持5min，在这之后取浓度为0.5mol／L的氢氧化钾0.2mL加入所有试管中，在30℃水浴中保持5min，然后仅在对照管的反应混合物中加入0.25mL粗酶液。最后每支试管都用4mL蒸馏水稀释，在30℃下保温5～10min后在520nm波长下用蒸馏水做空白，测定反应混合物的吸光值。所有测试都做三个重复。单宁酶的活性由吸光值的变化来计算ΔA520＝(Atest－Ablank)－(Acontrol－Ablank).PAGE623.2.5反应温度30℃条件下，每分钟产生1μmol没食子酸所需的酶量定义为一个酶活单位（U）。采用SadaakiIibuchi等[22]于1967年建立的紫外分光光度法：将0.3g单宁酸溶于1OOmLO.OlM乙酸缓冲液(ph5.0)中，配制成底物溶液。取4mL底物溶液于试管，加入lmL酶液迅速混合，置37℃水浴锅反应5min后，取O.lmL反应液，加入5m190%乙醇终止反应，混匀，测定光吸收值A310(单宁酸在310nm处有最大光吸收)；采用王征[55]等改进的酶活测定方法：取4支洁净的10mL具塞试管,分别设定为对照平行管与测定平行管。在每支试管中先后各加入1mol/L柠檬酸缓冲液和1mL酶液,40℃下平衡5min,先将4mL99%乙醇加入对照管中,使酶失活。5min后,在4支试管中加入底物PG溶液,40℃保温,准确反应10min,同法终止测定管的酶促反应。从上述4支反应管中各取1mL反应液,分别定容至10mL,并测定其在270nm处吸收值A。以重蒸水代替PG液重复上述操作作为空白。将反应温度为40℃条件下,1mL酶液每分钟使PG液在270nm处减少0.001个吸收值定义为1个酶活力单位；再3.3实验结果与讨论3.3.1没食子酸吸收峰波长图3.1没食子酸可见光区吸收光谱图由图可见没食子酸在可见光区的特征吸收峰在520nm处，与Shwetasharma[57]PAGE62的报道相符，该波长不仅避开了培养基中单宁酸的特征吸收波长310nm，而且还避开核酸和蛋白质的特征吸收波长260nm、280nm，从而在单宁酶活力测定过程中尽可能的减少上述物质对测定的干扰。由于固体发酵产胞外酶，提取的单宁酶粗酶液中含有大量的杂质，这些杂质都会影响测定水解产生的没食子酸的量。而采用520nm这个波长，成功的避开了其他物质的干扰，设定空白管、对照管更增加了酶活检测的准确性。3.3.2没食子酸标准曲线及其回归方程图3.2显示，波长520nm处没食子酸浓度与其对应的吸光值线性相关。对该组数据进行直线回归分析，得到直线回归方程：Y＝0.0042X-0.0138（r2=0.9992）.相关系数r≈1，表明水解生成物GA浓度（X）与其对应的吸光值（Y）线性相关显著。表3.1波长520nm下不同没食子酸浓度的对应吸光值浓度（μmol/L）concentration406080100120140160180200220240260吸光值absorbency0.1610.2410.3200.4020.4840.5630.6410.7500.8350.9010.9801.167AbsorbencAbsorbencyConcentrationofGA(μmol/L)图3.2波长520nm处没食子酸标准曲线图PAGE623.3.3单宁酶活力测定图3.3空白管(左)、测试管(中)、对照管(右)加入绕丹宁后的显色情况由图3.3可看出本论文建立的方法直观有效，可观察到明显的颜色变化。另外本方法非常灵敏，单宁酶水解底物产生微量的没食子酸都能检测到，浓度最小可达到5nmol。而Inoue和Hagerman［58］确定的方法，没食子酸的灵敏度为10μg(53nmol)。终止酶活时一般方法都是采用沸水浴、加入有机溶剂或者用液氮突然冷冻的方法，本实验在反应混合物中加入甲醇绕丹宁溶液有两方面的作用，一是可以终止酶活，二是可以与没食子酸结合形成色团物质，不需使用沸水或有机溶剂灭活，减少了对吸光值的干扰因素。吸光值在反应5min时达到最大，在此后20min内几乎没有变化。3.3.4单宁酶活力测定方法比较表3.2不同单宁酶活力测定方法比较紫外光区270nm波长下检测酶活紫外光区310nm波长下检测酶活可见光区520nm波长下检测酶活AtestAcontrolAt-cAtestAcontrolAt-cAtestAcontrolAt-c2.9552.8510.1043.3183.1320.1860.9610.1770.7842.9272.7400.1873.4833.3120.1710.9540.2080.7462.9202.7840.1363.3853.2800.1050.9320.1950.737现在国内的研究者在进行单宁酶活性测定时常用的方法主要有SadaakiIibuchi等[22]于PAGE621967年建立的紫外分光光度法,基本原理是根据底物单宁在310nm处吸光度的变化求酶活力；王征[23]的酶活检测方法，其方法在SadaakiIibuchi［22］构建的方法上作了改进，采用了没食子酸丙酯（PG）作为单宁酶底物，取得了较好的效果。表3.2数据表明，270nm下检测到的吸收值、310nm下检测到的吸收值均表现出大于1，处于2～3之间甚至>3,由此而得到的酶活力At-c值的可信度很小。随后将被测液的稀释倍数增加到100倍时，Ac和At的值才降至0～1之间，但由于稀释倍数过大造成的误差值增大，因此At-c值的可信度也不高。而在520nm下检测到的吸收值，将稀释倍数控制在5～10倍之间，Ac、At值均小于1，吸光值在测定的标准曲线范围内。Ac、At和At-c值的误差均不超过2％，这表明在520nm下测定固体发酵产单宁酶酶活的方法具有很高的精确度。分析原因，是由于固体发酵所产的几乎全为胞外酶，胞外酶的提取无法像胞内单宁酶提取那样几乎完全除去单宁酸等干扰物质，胞外单宁酶提取液中往往含有比底物浓度高，具有与底物相似吸收波长的物质，如培养基中的单宁酸和水解产物没食子酸及杂蛋白等干扰物质，干扰底物吸收光谱（额外增加对特征光谱的吸收）。尽管SadaakiIibuchi[22]等研究中单宁酸的特征吸收波长是310nm，但其所用的单宁酸是经过多次提取的纯品。而事实上多数研究中的单宁酸均为粗品，其特征吸收波长介于270～290nm之间，就会不可避免的干扰底物的吸光值。胞外酶粗酶液中的很多杂质的