宫内移植骨髓间充质干细胞对胚胎期显性脊柱裂胎鼠神经元重建的研究

PAGEPAGE39目录一、摘要中文论著摘要3英文论著摘要6二、英文缩略语10三、论文前言11实验材料与方法11实验结果14讨论23结论26本研究创新性的自我评价27参考文献27四、附录综述31致谢41在学期间科研成绩42个人简介43PAGEPAGE39·中文论著摘要·目的神经管缺陷(Neuraltubedefects,NTDs)是常见的先天性畸形之一,世界范围内发病率占总出生儿数的1/1000～9/1000,是世界卫生组织常规监测的疾病之一,目前认为神经管缺陷是遗传因素和环境因素共同作用的结果,有家族遗传倾向。胚胎发育过程中神经管发育缺陷可出现脑和脊髓畸形,其中脑裂和脊柱裂占所有类型的95%,脊柱裂根据椎管内容物是否突出脊柱皮肤分为显性脊柱裂和隐性脊柱裂。随着产前诊断技术的不断提高，越来越多的神经管畸形在孕中期或孕早期被发现，但是产前治疗方面的研究却进展缓慢，许多母亲被迫选择终止妊娠，出生后的神经畸形患儿的致残率和死亡率也较高。目前国内外应用胎儿外科技术进行产前修补可以减少脑积水和脑疝的发生率，但对神经功能的恢复仍不理想，下肢感觉运动功能障碍和尿便障碍仍然是常见的术后并发症。干细胞移植治疗出生缺陷是目前较先进的治疗方法，宫内移植的优点包括:1.由于胎儿在宫内生长发育快，因此为植入的干细胞生长繁殖提供了有利时机；2.MSCs经诱导分化后进行自体移植，不存在免疫反应，而且避免了社会伦理问题；3.能够在疾病的早期得以及时治疗。目前利用干细胞移植技术治疗白血病及先天性免疫缺陷性疾病以有报道，但关于宫内干细胞移植治疗神经管畸形的报道却很少。先天性神经管发育畸形的治疗一直是困扰国内外学者的难题。我们前期研究发现，先天性脊椎裂鼠支配肛门外括约肌和肛提肌的脊髓运动神经元数量明显减少，说明脊柱裂的脊髓神经元在胚胎期已经存在明显发育异常。因此我们认为在显性脊椎裂患儿术后神经功能恢复的治疗中，神经元的再生或修复才是最重要的治疗原则。移植的骨髓间充质干细胞（MSCs）可以转化为神经细胞，这为先天性神经系统发育异常和神经系统退行性疾病的细胞替代治疗提供了可能。因此本研究尝试利用MSCs进行宫内移植治疗先天性脊椎裂，并对移植后干细胞的迁移和分化情况进行评价，探索先天性脊椎裂的治疗新方法。材料和方法PAGEPAGE39一、实验动物1、原代培养4周龄Wistar鼠40只，体重90-100g。由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。2、动物模型10-12周龄Wistar孕鼠100只，体重250-300g。二、方法1、原代培养及腺病毒-EGFP转染：无菌条件下取大鼠骨髓用全骨髓贴壁培养法进行原代培养，腺病毒-EGFP（MOI值300-500）转染P0-P15代骨髓MSCs。2、胎鼠先天性脊椎裂动物模型的建立：孕10天进行4%维甲酸（140mg/kg）胃管给药，利用药物致畸方法制作先天性脊椎裂动物模型。3、干细胞移植：利用胎仔外科方法将转染EGFP的MSCs经纤细玻璃针注射到先天性脊椎裂胎鼠的脊髓中，并存活至20天，剖宫取胎。4、冰冻连续切片计数移植细胞的存活数量：取20天先天性脊椎裂胎鼠的脊椎，固定脱水后做冰冻切片，计数脊髓中绿色荧光细胞数量及分布情况。5、免疫荧光方法检测移植细胞的分化情况：免疫荧光方法检测脊髓冰冻切片中EGFP阳性MSCs中Nestin、NF、GFAP、Myod的表达。结果1、细胞浓度流式细胞仪鉴定全骨髓细胞悬液贴壁法得到MSCs纯度，发现细胞培养时间越长，干细胞的纯度越高。2、孕鼠及胎鼠存活率被移植孕鼠共86只，术后存活并得到脊柱裂标本的孕鼠共81只，孕鼠存活率94%。每只孕鼠平均移植2-3只胎鼠，最后存活的胎鼠比例为78%。3、细胞存活情况通过对实验结果计数分析，移植MSCs的总存活率为24%。并且发现不同浓度MSCs、不同代数的MSCs和不同移植时间对MSCs存活率都有不同的影响：在孕16天、17天和18天时移植相同代数的MSCs，结果发现孕16天存活率PAGEPAGE39明显低于孕17和18天，（P﹤0.05）；在相同移植时间（16天移植MSCs），P0代MSCs存活率最低，P3-6和P10-14代无明显差别（P﹥0.05）；移植MSCs细胞数量不同对存活率影响不大（P﹥0.05）。4、细胞分化情况免疫荧光法检测MSCs移植到脊髓中分化情况，发现移植MSCs不仅分化为不同神经细胞，包括神经干细胞（nestin）、神经元（Neurofilament）和神经胶质细胞（GFAP）。而且可分化为肌原细胞(MyoD)。分化率在P10-14代MSCs明显高于P3-6代MSCs，在16天移植明显高于孕17天和18天（P﹤0.01）。结论1、提示利用胎仔外科进行宫内干细胞移植治疗先天性脊椎裂可能是可行的办法。2、移植MSCs可在胎鼠脊髓组织中分化为神经干细胞、神经元、神经胶质细胞和肌原细胞。3、P10-14代MSCs在孕16天移植可获得较高的分化率，在本实验中是胚胎期移植的最佳条件。关键词骨髓间充质干细胞；宫内移植；先天性脊椎裂；分化；神经元；重建。PAGEPAGE39·英文论著摘要·ObjectiveNeuraltubedefects(NTDs)arecomplexcongenitalmalformationsresultingfromfailureofcompleteneurulationduringthefourthweekofembryogenesis.SpinabifidaandAnencephalyarethemostcommonandsevereformsofNTD,withaprevalenceofabout1in1,000births,althoughthisvariesthroughouttheworld.Individualswithspinabifidahavesubstantiallyenhancedsurvivalratethankstorecentimprovementsinmedicalandsurgicalmanagement.However,thesepatientscontinuetobeatincreasedriskformorbidityandmortalitythroughouttheirlife,eventhoughvariousprenatalorpostnataltreatmentstrategieshavebeenappliedinclinic.Prenatalrepairisanacceptablefetalsurgerybutwithunprovenbenefits,updatedreportssuggestareducedincidenceofshunt-dependenthydrocephalus,aswellasanimprovementinhindbrainherniation.However,theexpectationsforimprovedneurologicaloutcomehavenotbeenfulfilledandnotallpatientsbenefitfromfetalsurgeryinthesameway.Individualswithlumbosacralspinabifidacontinuetoexperiencevaryingdegreesofmotorandsensorydysfunctionoflowerlimbsandfailureofanalandurethralsphinctersafterbirth.Fetalcellulartherapyisanotheroptionforthetreatmentofavarietyofbirthdefects.Thereareseveralperceivedadvantagesofinuterotransplantation(IUT):(1)Therapidgrowthofthefetusprovidesopportunityforengraftmentandexpansionofdonorcells,(2)theundevelopedimmunesystemofthefetuscannotrejectforeigntissues,and(3)earlytreatmentofdiseaseisbeneficialorcriticalforeffectivetreatment.Althoughtransplantationofhealthycellsintoafetusissuggestedtoofferthepotentialtotreatalargenumberofbirthdefects(havetherapeuticpotentialforalargenumberofgeneticdisorders),uptonow,itislimitedtothetreatmentofcongenitalhematologicdisordersandimmunodeficiencydiseaseOnly.Ourpreviousstudieshavedemonstratedthedefectivedevelopmentofsensoryandmotorneuronsinfetalratspinalcordwithspinabifidaaperta,andtheintrinsicneurondeficiencyisaprimaryanomalythatcoexistswiththespinalmalformationduringfetaldevelopment,whichlikelytocontributetopoorpostoperativeneuralfunction(ureaandrectalincontinienceandlegparalysis)despitesurgicalrepair.ThuswesupposedthatPAGEPAGE39treatmentbasedonneuronregenerationorreplacementshouldbeanalternativechoicetoachievebetterfunctionaloutcomeinspinabifidapatients.Concerningregenerationmedicine,mesenchymalstemcelltransplantationhasbeenwidelyusedduetotheirconvenientisolation,theirlackofsignificantimmunogenicitypermittingallogenictransplantationwithoutimmunosuppressivedrugs,theirlackofethicalcontroversy,andtheirpotentialtodifferentiateintotissue-specificcelltypeswithtrophicactivity.Basedonallthese,inthisstudyweforthefirsttimetreatedspinabifidaapertawithinuterobonemarrowderivedmesenchymalstemcell（MSCs）transplantationusingratmodel.Method1．Experimentalanimal1.1MSCsprimarycultureFortyWisterratsaging4weeks,weighting90-100gwereinvolved.AllratswereprovidedbylaboratoryofAffiliatedShengjingHospital,1.2AnimalmodelOutbredwisterratsof10-12weeksofage(250-300gm,100rats)purchasedfromanimalcenterofchinamedicaluniversitywereusedinthisstudy.2Method2.1PrimarycultureandTransfectionInsterilecondition,ratmarrowwasflushedandcellswereseededincultureflask.Passage0toPassage14ofmarrowMSCsweretransfectedbyadenovirus-EGFP(MOIvalue300-500).2.2RatcongenitalspinabifidamodelTheappearanceofvaginalplugsinthefemaleratthemorningaftermatingwastimedastheembryonicday0(E0).Spinalbifidaapertawereinducedwithasingleintragastric140g/kgretinoicacidadministrationonE10morning.2.3CelltransplantationByfetussurgeryEGFPtransfectedMSCswereinjectedtospinalcordthroughfineglassneedle.Repairpregnantrats’uterusandfeedthemuntilday20gestation.2.4CryosectionsandCountingcellsUntilday20gestation,pregnantratunderwentoperationagain.Spinalcordoffetusratswereremovedfollowingfixation,dehydration.Countcellswithgreenfluorescenceinfrozensection.2.5DifferentiationoftransplantedcellsExpressionofNestin,NF,GFAPandPAGEPAGE39MyoDintransplantedMSCsweretestedbyimmunofluorescence.Result1．FlowcytometryanalysisshowedthepurityofourcultureMSCwasincreasedwithlongerculture.2．Total86pregnantratsreceivedfetalsurgeryandmicroinjectiononE16,E17orE18,and5diedbeforeE20,81ratsweresacrificedonE20forspinesamplecollection.Theoverallsurvivalrateofratfetusafterfetalsurgerywas94%.Onaverage,2to3fetusescouldbiinjectedinonedam.Mostoftheoperatedfetus(﹥75%)couldsurviveaftertransplantation,andtotally24%oftransplantedMSCssurvivedonfetalspinalvertebrateregion.3．Thereisatendencyofhighersurvivalratewithmorecellsinjected,itisnotstatisticallysignificant(P〉0,05).ThepassagesofinjectedMSCs,onlyP0cellsshowedlowersurvivalrate,cellsinP3-6orinP10-14presentedsimilarsurvivingrate.itisnotstatisticallysignificant(P〉0,05).Thethirdfactoristhestagesoffetaldevelopment.LesseGFPpositiveMSCssurvivedonE16fetalspinalvertebratethanonE17andE18.MSCsmigratedintodifferentregionofspinalvertebrateawayfromtheinjectionsite.4．Duringthe2-4daysofdevelopment,transplantedMSCsdefferentedintovariouscelltypesofspinalvertebra,aseGFPpositiveMSCsexpressedthespecificmarkersofneuralstemcell(Nestin),neuron(neurofilament),neurogliocyte(GFAP)andmyoblast(MyoD)aftertransplantation.ConcerningtheeffectofcellpassagesonMSCsshowedhigherneuronaldifferentiationrateinP10-14cellgroupcomparedwithinP3-6cellgroup(P<0.01).DevelopmentstagesalsoaffectneualdifferentiationofMSCs,MSCssurvivedonE16spinalvertebratehavesignificantlyhigherneuronallineagemarkerexpressioncomparedwithE17andE18group(P<0.01).Conclusion1．Itisanacceptabletechniquethatwetreatedspinabididaapertawithinuterobonemarrowderivedmesenchymalstem(MSCs)transplantationusingratmodelbyfetussurgery.2．TransplantedMSCsdifferentiateintoneuralstemcell,neuron,neurogliocyteandmyoDinfetusspinalcord.PAGEPAGE393.ThebetterneuraldifferentiationobtainedinthisstudywithlongercultureMSCstransplantedontoE16ratfetus,whichisthebestconditioninfetustransplantation.KeyWordsbonemarrowmesenchymalstemcells;uterotransplantation;congenitalspinabifida;differentiation;neurons;regeneration.PAGEPAGE39·英文缩略语·英文缩写英文全称中文全称NTDsMSCsNFGFAPMyoDFBSPBSNeuraltubedefectsMesenchymalstemcellsNeurofilamentGlialfibrillaryacidicproteinMyogenicDifferentiationAntigenfetalbovineserumphosphate-bufferedsaline神经管畸形骨髓间充质干细胞神经丝胶质纤维酸性蛋白成肌分化抗原 成肌分化抗原胎牛血清磷酸缓冲液 磷酸缓冲盐溶液PAGEPAGE39·论文·前言神经管畸形(neuraltubedefects,NTD)是一类发病率高且后果严重的出生缺陷,是神经沟关闭形成神经管时的缺陷，主要包括无脑、脑膨出及脊柱裂等[1,2]。由于畸形改变严重，发生机制复杂，目前尚无良好的治疗方法，严重畸形者在胚胎期死亡，畸形改变较轻的患儿生后虽然可以保住生命，但多数表现程度不同的神经功能异常，包括肢体瘫痪、尿便功能障碍、智力低下等，严重影响患儿的生理发育和生活质量[3-9]。因此有必要进行NTD的动物模型制备及详细病理改变的研究，为进一步探索新的治疗方法奠定基础。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓内的一种成体干细胞,具有自我增殖、多向分化的潜能。BMSCs的发现为运用细胞替代疗法治疗神经系统损伤及疾病展示了良好的前景。随着基因工程技术、细胞工程技术和组织工程技术的发展，利用BMSCs的多向分化潜能及其可在体内表达多种外源基因的特性，将其作为种子细胞用于细胞治疗和基因治疗已成为当前研究的热点[10-13]。本实验采用全骨髓贴壁法分离BMSCs，并通过腺病毒将绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)标记到BMSCs上，同时采用维甲酸致畸法建立胎鼠先天性脊柱裂模型，结合胎仔外科，显微外科和显微注射等技术进行细胞移植，观察不同代数及浓度的BMSCs在不同阶段的显性脊柱裂胎鼠脊髓中的存活及迁移情况，并利用免疫荧光方法研究BMSCs移植后在胎鼠体内向神经细胞分化的情况，从而探讨在胎儿期进行干细胞移植对神经管畸形的治疗潜能。材料与方法一、材料（一）实验动物BMSCs培养选用的4周龄Wistar鼠40只，雌雄不限，体重90-100g。动物模型制作选用2.5-3月龄，健康Wistar雌鼠100只，体重250-300g，由中国医科大学盛京医院实验动物（二）实验试剂PAGEPAGE39DMEM/F12培养基（Gibco公司）胎牛血清（Hyclone公司）0.25%胰蛋白酶（Sigma公司）青霉素，链霉素（华北制药股份有限公司）腺病毒-5F35-EGFP(SinoGenoMax.Co.,Ltd,Bejing,China)橄榄油4%维甲酸（sigma公司）4%多聚甲醛10%水合氯醛一抗：兔抗大鼠GFP单克隆抗体IgG（AG279，BeyotimeInstituteBiotechnology，China）小鼠抗大鼠nestin单克隆抗体IgG（MAB353,millipore）小鼠抗大鼠GFAP单克隆抗体IgG（MAB3402,millipore）小鼠抗大鼠NF单克隆抗体IgG（SMI-311,Abcam）小鼠抗大鼠myoD单克隆抗体IgG（BD公司）二抗：罗丹明标记的羊抗小鼠IgG(Chemicon,Millipore)羊抗兔AlexaFluor488单克隆抗体IgG（Invitrogen）DAPI核酸染剂(BeyotimeInstituteBiotechnology，China)10%血清封闭液PBS缓冲液（三）主要仪器设备CO2恒温培养箱（Heraeus）超净工作台（Haier）荧光倒置显微镜(NikonEdipseE800)激光共聚焦显微镜(日本尼康公司的TCS-SP2型)离心机（5810R,Eppendorf）显微外科手术器材(NarishigeScientificInstruments.Tokyo,Japan)PAGEPAGE39二、方法（一）骨髓间充质干细胞的体外培养及绿色荧光蛋白转染大鼠BMSCs体外培养及纯化取4周龄Wistar大鼠,无菌条件下取大鼠股骨，用20mlDMEM/F12(1∶1)+10%胎牛血清（FBS）细胞培养液冲洗骨髓腔，制作骨髓细胞悬液,全骨髓贴壁法分离BMSCs,37℃,5%CO2恒温培养箱中培养，此时细胞为原代（P0代。）2～3d半量换液，5～7d后传代，此时为第一代（P1代）。以后细胞每融合达80%时传一代，直至P15代。绿色荧光蛋白标记干细胞将干细胞按1×105个/孔接种于6孔板，转染腺病毒-5F35-EGFP，24小时后荧光显微镜下确定绿色荧光表达情况，消化，吹打，离心后，制成7000～35000个/µl浓度的eGFP-MSCs悬液用于移植。（二）动物模型的建立雌性Wistar大鼠100只（中国医科大学第二临床学院实验动物中心提供）体重250～300克。雌雄（比例4：1）交配后，清晨阴道涂片发现精子既定为孕0天（E0d），在E10d给维甲酸致畸，维甲酸（40mg/ml）溶于橄榄油中，以剂量为140mg/kg给药，经胃管注入。分别在大鼠孕16d、17d、18d时，进行干细胞移植。实验根据移植时间分3组：16d、17d、18d组。（三）骨髓间充质干细胞移植及实验分组1、移植分组：（1）将P3-6代细胞在不同时间移植，分孕16d、17d、18d三个组。（2）在孕16天移植不同代数BMSCs，分P0、P3-6和P10-14三个组。（3）在孕16天移植不同细胞数BMSCs，分1000-2000、2000-4000和4000-6000三个组。2、移植：孕鼠给予10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉。腹壁清理及消毒，无菌操作下依次打开腹壁，宫壁，羊膜囊，在手术显微镜下暴露显性脊柱裂胎鼠腰骶部。确认畸形后，经微量注射器注入0.2µl（大约2000-4000个eGFP-MSCs）细胞悬液。缝合宫壁及关闭腹腔，待麻醉清醒后送回笼内饲养。（四）标本制作及阳性细胞的计数PAGEPAGE39妊娠20天孕鼠再次麻醉后剖腹产取出经过干细胞移植的胎鼠，将胎鼠脊柱标本取出，放入4%多聚甲醛液体中固定，24小时后20%蔗糖脱水，24小时后取出，-80℃冻存。脊髓标本（OCT）包埋后，冰冻，取横断面连续切片，厚度30µm。同时荧光显微镜下计数每个切片内阳性细胞数，累计每根脊髓的阳性细胞总数。并且观察（五）免疫荧光染色法观察移植干细胞在胎鼠脊髓中分化的情况1、选片：已经确定eGFP阳性的MSC切片用PBS洗3次，每次5分钟。2、修复：柠檬酸修复液中加热至90℃3、加一抗：冷却后，PBS洗2次，10%血清封闭30分钟，不同移植天数的切片上的分别加上小鼠抗大鼠Nestin（1：100）、NF（1：500）、GFAP（1：200）、myoD（1：100）单克隆抗体，然后在每张片子上加兔抗大鼠GFP（1：200）单克隆抗体，阴性对照不加一抗，4℃4、清洗：次日，切片PBS洗3次，每次5分钟。5、加二抗：避光条件下加二抗：罗丹明标记的羊抗小鼠IgG（1：200稀释）4℃孵育一小时。羊抗兔AlexaFluor488单克隆抗体IgG6、核染及观察结果：PBS洗一次，加DAPI核酸染剂，激光共聚焦显微镜下观察双标记阳性细胞。（六）统计学方法所有数据统计采用双盲法，计数资料以±S表示，细胞存活率及分化率采用x2检验，P＜0.05有统计学意义.试验结果一、MSCs的浓度测定经流式细胞仪鉴定P0代的干细胞纯度60%，P1代的纯度在80-90%，P2-P15代均在90%以上。PAGEPAGE39图1，细胞浓度趋势，P0代干细胞的纯度为60%，P1代为90%，P10代为96%。二、移植后孕鼠及胎鼠的存活率（一）孕鼠存活率移植孕鼠共86只，术后存活并得到脊柱裂标本的孕鼠共81只，孕鼠存活率94%（81/86）。（二）胎鼠存活率每只孕鼠平均移植2-3只胎鼠，共移植胎鼠174只，获得先天性脊椎裂胎鼠脊髓136个，移植后胎鼠的存活率是78.1%（136/174）。但不同孕龄的胎鼠存活率也不同，孕16天﹤17天﹤18天，（表1，图2）。表1，三组孕龄胎鼠移植后的存活率（%）E16E17E18总数移植胎数1203123174存活胎数912520136存活率75.8%80.6%*87.0%**78.1%*P<0.05vsE16**P<0.01vsE16andE17PAGEPAGE39图2，三组孕鼠移植后胎鼠存活率的趋势表达三、移植EGFP-BMSCs存活情况（一）移植BMSCs在胎鼠体内的存活情况(表2.1-3,图3.1-3)每个脊髓中注射的EGFP阳性细胞数多少不等，范围在102-3171个之间。经过计数106根脊髓里共移植227568个EGFP细胞，共存活了56328个。总计移植BMSCs的存活率为24%（56328/227568）。观察三组胎鼠移植后干细胞存活率的差异，发现影响干细胞存活的因素有三种：1、孕龄的差异发现在孕17天时进行干细胞移植干细胞的存活数量最多，即E16﹤E18﹤E17，（表2.1，图3.1）。2、细胞培养时间的差异在相同移植时间（16天移植MSCs），P0代MSCs存活率最低，P3-6和P10-14代无明显差别（表2.2，图3.2）。3、注射细胞浓度的差异注射的细胞数越多存活的细胞也越多，1000-2000﹤2000-4000﹤4000-6000。（表2.3，图3.3）（二）BMSCs在脊髓内的迁移与分布（图3.4）MSCs存活位置远离注射位置，可见移植细胞有迁移现象，有的位于缺损的脊髓内，有的位于神经节内，还有一些位于皮下。PAGEPAGE39在不同部位存活的干细胞其形态也不同，有的为圆形或椭圆形，有的为长梭形，伸出一个或多个突起，也可为不规则形（图3.4）。表2.1，不同孕龄对移植干细胞存活率的影响孕龄E16E17E18干细胞存活率22.76%38.7%*34.6%**p<0.05vsE16有统计学意义图3.1，移植干细胞在三组胎鼠中的存活趋势表达（*P<0.05vsE16）表2.2，不同代数干细胞移植后其存活率的差异细胞代数P0P3-6P10-15存活率10.79%22.57%20.10%P﹥0.05，无统计学意义PAGEPAGE39图3.2，用不同代数干细胞进行移植，细胞的存活率不同，表2.3，不同细胞浓度移植后的存活率注射细胞数1000-20002000-40004000-6000细胞存活率17.82%22.24%24.18%P﹥0.05，无统计学意义图3.3，不同细胞数移植同一孕龄的胎鼠后存活率的趋势分析，(P﹥0.05，无统计学意义)PAGEPAGE39图3.4，移植干细胞分别存活于脊髓内（图A;图B，箭头指示长梭形或不规则形细胞）；神经节内（图C，箭头指向圆形细胞）；皮下（图D箭头指向皮下存活扁平细胞）.四、移植EGFP-BMSCs分化情况（一）分化方向的表达（图4.1-4）移植的BMSCs在先天性脊柱裂胎鼠脊髓中出现分化。经免疫荧光染色证实，存活在脊髓内的可分化为神经干细胞(Nestin)(图4.1)、神经元(Neurofilament)(图4.2)、和神经胶质细胞(GFAP)（图4.3）、存活在肌肉内的还可向肌细胞方向分化（成肌调节因子myoD）（图4.4）。（二）分化率的差异（表3.1-2，图4.5-6）1、孕16天注射的三组细胞，经过统计分化率表现出明显不同，发现P10-14代的分化率较P3-6代的增高。P﹤0.05，有统计学意义(表3.1，图4.5).2、在孕16、17、18天同时移植的P3-6代干细胞分化率也不相同，尤其孕16天较17和18天相比明显增加，P﹤0.01，有统计学意义(表3.2，图4.6)。PAGEPAGE39图4.1，骨髓间充质干细胞向神经干细胞方向分化，图A，eGFP阳性表达;图B，nestin阳性表达；图C，为eGFP/Nestin/DAPI的叠加表达；图D为200倍镜下双阳细胞的组织中的表达。图4.2，骨髓间充质干细胞向神经元方向分化，图A.eGFP-MSC阳性表达;图B.NF阳性表达；图C.eGFP/NF/DAPI双阳叠加表达；图D.eGFP/NF/DAPI,200倍镜下双阳细胞的组织中的表达。PAGEPAGE39图4.3，骨髓间充质干细胞向神经胶质细胞方向分化，图A.eGFP-MSC阳性表达;图B.GFAP阳性表达；图C.DAPI阳性表达；图D.eGFP/GFAP/DAPI,200倍镜下双阳细胞的组织中的表达。图4.4，骨髓间充质干细胞向肌细胞方向分化，图A.eGFP-MSC阳性表达;图B.MyoD阳性表达；图C.DAPI阳性表达；图D.eGFP/MyoD/DAPI，PAGEPAGE39200倍镜下双阳细胞的组织中的表达。表3.1，不同代数干细胞移植后的分化率P3-P6P10-P14Nestin13.9%(73/523)19.2%(61/318)*Neurofilament8.9%(52/593)16%(20/124)*GFAP27.2%(44/162)33%(28/84)**P<0.01vs.P3-P6group图4.5，不同代数的干细胞在孕16天分化为Nestin,NF,和GFAP的分化率的趋势分析。表3.2，不同孕龄移植的P3-P6干细胞存活率%(PC/total)E16E17E18Nestin13.9%(73/523)*8.3%(24/288)**7.6%(9/117)Neurofilament8.9%(52/593)*7.6%(16/201)**5.7%(11/194)GFAP27.2%(44/162)*16.8%(13/77)17%(98/577)*P<0.01vs.E17andE18group.**P<0.01vs.E18group.PAGEPAGE39图4.6，E16,E17和E18天移植的干细胞分化为Nestin,NF和GFAP的分化趋势。因此在本实验结果中虽然孕16天移植干细胞的存活率较低，但其分化率确最高，是神经元替代治疗最佳的选择。讨论先天畸形每年的出生率达5%，神经管畸形占有其中很大比例，是世界卫生组织常规监测的先天畸形之一[28,29]。因此先天畸形的早期诊断和治疗是具有重要意义的。虽然目前神经管畸形的产前诊断的技术日益提升，但是产前治疗确不尽人意。叶酸有利于预防神经管畸形的作用早在1990年就曾有人报道过[30]。然而，叶酸在孕期的预防知识普及并不理想，同时较高的意外怀孕率，这些都意味着目前产前预防的重要性未引起足够重视。脊膜膨出或无脑畸形仍然是产前能够检查出的常见先天畸形之一[31,32]。目前脊柱裂的治疗也仍不理想[3、4、6、7、8、9]。目前，先天性神经管畸形在治疗方面尚无突破性进展，这主要是由于神经损伤的恢复是极其困难的[14-18]。探索新的更有效的治疗方法是目前的当务之急。我们利用神经示踪、显微外科和胎仔外科相结合的技术首次发现先天性脊柱裂鼠支配肛门外括约肌和肛提肌的脊髓运动和感觉神经元数量明显减少[19]。因此神经系统损伤后进行细胞替代治疗为该病提供了一个新的治疗思路。近年来研究表明，干细胞可在损伤的脊髓中存活，并分化为神经元和星形胶质细胞，PAGEPAGE39能减少损伤造成的神经功能损失[20]。MSC有望成为一种新的细胞治疗和基因治疗的靶细胞作用于神经系统。传统观念认为，神经细胞一旦死亡或缺损就无法再生，如今这一观念已开始动摇，研究表明，MSC可以重建中枢神经系统的结构和功能。Azizi等将人MSC用荧光素标记后，注入大鼠纹状体中，分别于5、14、30、72天后取脑部冰冻切片，选择有荧光素标记的部分组织作免疫组化分析。结果发现，有20%的供体细胞成活，分化为神经样和星形胶质细胞。Chopp等多次将骨髓MSC应用于脑外伤或脑缺血动物模型，发现植入的MSC约1%分化为神经元，5-8%分化为神经胶质细胞，并明显促进神经功能恢复[21-25]。MSC移植治疗脊髓病变的移植方式很多，主要包括直接移植法、经脑脊液注入移植法、静脉注入移植法和腹腔移植法等[26-27,37,38]。直接移植法是将体外分化增殖后的MSC连同培养液多靶点直接注射的脊髓病变及其周围；经脑脊液注入移植法经MSC经静脉注入蛛网膜下腔，使之随脑脊液到达病变部位；经静脉注入移植是将MSC经静脉注入，随血液循环通过血-脊髓屏障到达病变部位。但目前尚不清楚何种移植方式更合适，人们多采用直接移植法[26-27,37]。Inoue等将MSC经静脉注入脱髓鞘处理的脊髓损伤模型的成鼠体内，发现移植的MSC可促进髓鞘再生和脊髓的自我修复。研究发现，经脑脊液注入移植不但能提高移植细胞在损伤脊髓内的分化率，而且可避免直接移植造成正常组织损伤和经静脉注入移植导致的移植细胞通过血-脊髓屏障数量有限和免疫反应较强的缺点。本实验中我们利用胎仔外科、显微外科和显微注射技术进行脊髓局部注射移植，可将细胞直接送到病变部位，让胎鼠在子宫内进行自行修复，其脊髓发育微环境更有利于移植细胞的存活、迁移和分化。结果发现，移植细胞在体内部分存活，形态发生很多变化，有的细胞为长梭形，类似神经元或星形胶质细胞，伸出一个或多个突起，也可见不规则形。免疫荧光证实，在MSC移植后3-4天，MSC表达神经干细胞、神经元及神经胶质细胞的标志物Nestin、NF及GFAP，说明已经向神经细胞分化。MSC向神经细胞分化及进行神经修复的机制目前尚不明确，可能与以下因素有关。首先是替代作用，PAGEPAGE39MSC移植后向病变组织渗透、融合，部分细胞表达神经细胞的表面标志，替代受损细胞，重建神经环路。在脊髓受损部位，移植的MSC聚集，弥合了脊髓之间的中断，分化的神经元和星形胶质细胞已经形成明显的树突，可能通过与神经细胞建立广泛的传入和传出联系重建神经通路、进行髓鞘再生而发挥神经保护作用[38-40]。有报道MSC在体内还有迁移的特性，无论局部移植还是经血管移植，MSC可向损伤区域聚集[41]。MSC通过静脉注入后，到达实质内的细胞多达几万个，但只有少数细胞表达神经细胞的特异表型。即使表达这些蛋白表型也并不真正表明已经有神经细胞的功能，因此组织的替代作用有待进一步研究[42]。另一个较合理的解释是MSC通过分泌一些因子和神经组织相互作用，激活细胞的修复再生机制。试验表明MSC能够产生NT-3,VEGF,NGF,BDNF及其他营养因子，然后通过这些细胞因子的共同作用（而不是某一个因子）改变损伤局部的微环境，促进细胞的增值、分化和迁移，从而恢复大脑或脊髓组织的功能。还有学者认为，MSC可以激活休眠的神经元，发挥功能代偿作用。MSC通过以表达骨形态蛋白，解除局部对神经干的抑制，使之增值和分化。总之，MSC移植促进神经损伤后修复是一个复杂的移植细胞与宿主相互作用的过程[38-44]。我们成功的将MSC在宫内移植入胎鼠体内，手术的成功率是78%，干细胞的存活率是24%，因此我们认为此项技术可作为神经管畸形产前治疗的方法之一。骨髓间充质干细胞可分化为神经干细胞、神经元和神经胶质细胞在本实验中得到证实，最佳的移植时间是将P10-14代MSC在母鼠孕16天时直接移植入显性脊柱裂胎鼠脊髓内，此时分化为神经干细胞的比率为19.2%，神经元是16%，神经胶质细胞是33%（图4.5，4.6）。MSC在大鼠及新生鼠体内移植后向神经方向分化在以往的研究中早有报道，在给大鼠移植术后28天观察神经元的分化率只有3%[33]。而另一项研究在大鼠移植术后12天观察未发现有神经元的分化[34]。然而我们的结果证实宫内移植术后4天神经元的分化率就以达到16%。这意味着在胎儿期进行移植，干细胞的增值与分化的速度是相当快的，可见胚胎环境对移植细胞的分化十分有利。在试验中还观察到MSC还可向肌肉方向分化，通常在成年大鼠的干细胞移植试验中，术后要观察2-3个月才能看见干细胞向肌肉方向分化[35,36]，这预示着先天性脊柱裂肌肉组织缺陷的修复在干细胞移植后也有可能实现，而这一点是脊柱裂治疗中重要的部分。PAGEPAGE39因为脊柱裂胎鼠在生后是不能存活的，本实验没有移植后的长期观察结果，目前结果证实了宫内移植MSC确实是脊柱裂胎鼠神经元替代治疗的可行办法。胎儿外科脊髓修补术和我们的胎儿期宫内干细胞移植的目的都是在怀孕早期进行治疗，以减少先天畸形的进一步病变。但不同的是，胎儿外科是组织缺陷的修补，而宫内干细胞移植是神经元的再生。在过去的8年里有330例应用胎儿外科技术进行脊髓修补，在一定程度上是减少的出生缺陷率，但在长期的随防观察发现大多数病例其感觉运动功能的恢复并不理想[4]，而本实验意在神经元的替代治疗从而改善感觉运动功能，和胎儿外科技术相比较而言，宫内注射干细胞技术创伤更小，且应用时机更早。试验的设计是在孕16天，17天和18天进行移植，结果显示虽然孕16天移植的细胞的存活率较低，但是其向神经方向的分化率确是最高。如果移植时间能够向前提到孕14天或15天，那么对脊柱裂生后感觉运动功能的恢复会更加有利，在进一步的研究中我们将重点研究神经功能恢复的长期观察。总之，在本实验中，我们首次建立了结合胎儿外科，显微外科及显微注射技术相结合的方法，宫内移植骨髓间充质干细胞，治疗显性脊柱裂。利用骨髓间充质干细胞多向分化潜能，实现了神经元替代的早期治疗。但在目前所取得的研究成果多数局限于动物模型，MSC移植后能在体内移行并分化成神经样细胞，这些细胞是否具有神经细胞的功能，能否与其他细胞形成突触联系，还需从形态学及电生理等方面进一步研究。如何提高存活率及分化率，如何进一步提高轴突的再生能力并引导轴突向合适的目标方向生长，也是有待解决的问题。相信随着研究的不断深入和上述问题的解决，先天性脊椎裂的治疗手段会有重大突破。结论1、提示移植后胎鼠的存活率是78.1%，利用胎仔外科进行宫内干细胞移植治疗先天性脊椎裂可能是可行的办法。2、移植MSCs可以在胎鼠脊髓组织中分化为神经干细胞、神经元、神经胶质细胞和肌原细胞。3、P10-14代MSCs在孕16天移植可获得最高分化率，在本实验中是胚胎期移植的最佳条件。PAGEPAGE39本研究创新之处本研究首次将显微外科、显微注射、胎仔外科等技术相结合，对先天性脊柱裂胎鼠进行MSC移植治疗，并对其在脊髓内的存活率和分化率进行客观评价。目前，先天性神经管畸形在治疗方面尚无突破性进展，治疗方法主要是应用胎儿外科技术进行脊髓修补术，但效果并不理想。本研究提出在胎儿期进行干细胞移植治疗先天性脊柱裂，利用其在胚胎发育过程中有利于分化的微环境，促进移植的干细胞分化为神经元。参考文献Elwood,J.M.,Little,J.&Elwood,J.H.,EpidemiologyandControlofNeuralTubeDefects.[M]OxforduniversityPress(1992).Zhu,L.andLing,H.,NationalNeuralTubeDefectsPreventionPrograminChina.FoodNutrBull29(2Suppl),S196(2008).Kohl,T.etal.,Percutaneousfetoscopicpatchcoverageofspinabifidaapertainthehuman--earlyclinicalexperienceandpotential.FetalDiagnTher2006.21,185-193Fichter,M.A.etal.,Fetalspinabifidarepair--currenttrendsandprospectsofintrauterineneurosurgery.FetalDiagnTher2008.23,271-286Yuan,Z.etal.,Constipationisassociatedwithspinabifidaoccultainchildren.ClinGastroenterolHepatol2008Dec;6(12):1348-53ACOGpracticebulletin.Clinicalmanagementguidelinesforobstetrician-gynecologists.Number44,July2003.(ReplacesCommitteeOpinionNumber252,March2001).ObstetGynecol.2008Oct;112(4):951-61.Hirose,S.,Farmer,D.L.,andAlbanese,C.T.,Fetalsurgeryformyelomeningocele.ClinPerinatol.2009Jun;36(2):43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·附录·综述骨髓间充质干细胞在移植治疗中的示踪方式研究生：马丽丽导师：袁正伟摘要：具有多向分化潜能的干细胞在损伤组织的修复再生方面已经表现出巨大的应用前景，自体干细胞和基因修饰的干细胞已经成功应用于动物试验和临床治疗中。研究表明，骨髓间充质干细胞具有自我更新和多向分化潜能【1】。间充质干细胞可分化为肝卵圆细胞、肝细胞【2】、胆管细胞【3】、神经元【4】、骨骼肌细胞【5】和上皮细胞【6，7】等多种组织细胞。由于移植的干细胞在不同组织的微环境作用下迁移和分化的方式也不同，为了研究干细胞在不同组织中迁移和分化规律，移植细胞在损伤组织和器官中准确定位具有极其重要意义。因此，近年来各种细胞追踪技术被应用于不同研究中，包括BrdU、荧光染料、绿色荧光蛋白、MRI、同位素标记和其他方式。然而，由于试验目的不同和干细胞的不同特征在干细胞的移植试验中标记的方式也不同。本文将应用于基础试验和临床前期试验的各种追踪方式和在干细胞移植中的应用做了总结。关键词：骨髓间充质干细胞移植示踪1.溴脱氧尿嘧啶（5-Bromodeoxyuridine，BrdU）：BrdU是胸腺嘧啶核苷的类似物，可与内源性胸腺嘧啶核苷竞争进入细胞S期的核酸序列，与掺入细胞的机制相似，因此，作为反映细胞增殖活性的指标确切可靠，常被应用于活体组织细胞的检测【8】。细胞增殖周期包括Gl,S,PAGEPAGE39G2和M4个时期，S期是DNA合成期，细胞内DNA进行半保留复制，各种构成DNA的原料掺入到DNA中。BrdU作为一种DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，当细胞处于DNA合成期而同时又有BrdU存在时，就会有BrdU掺入新合成的DNA中，只要细胞不死亡，这种BrdU在细胞核的DNA中将长期存留。有报道认为，标记BrdU的细胞只要不受紫外线照射，对细胞即无功能损害。近年来，国外已有学者将该技术应用到跟踪检测移植细胞的成活、分化和功能状态。Kopeal等曾用BrdU标记骨髓间充质干细胞（BMSCs）并将其移植到新生鼠的侧脑室。12天后，他们在被移植鼠的前脑和小脑内观察到了被BrdU标记的BMSCs，并且一些BMSCs已经分化为成熟的星型细胞【9】。BrdU标记的骨髓间充质干细胞也曾经被移植在小脑缺血的动物模型中，结果显示被标记的细胞不仅能够迁移到缺血组织的中心而且还转化成为神经细胞和胶质细胞【10】。然而，在最近的研究中有人给用环磷酰胺和粒细胞刺激因子进行刺激的新生鼠和成年鼠给予4-10天BrdU移植，停药后观察70天。在实验中观察到，不足6%造血干细胞BrdU阳性，而在被BrdU标记的造血细胞中造血干细胞不到0.5%。他们的结果表明随着细胞的分裂BrdU做为造血干细胞的标记物其特异性和敏感性较低，也就是标记强度会降低或标记丢失。并且移植的BrdU标记细胞在其死亡后，能将BrdU释放出来，并被临近的细胞摄取，从而出现假阳性【10，11】。尽管在心肌、皮肤、神经和肝脏疾病中进行干细胞移植时已经应用过BrdU标记细胞，但在组织中移植后存留的带标记的细胞中干细胞纯度至今没有得到验证【11-14】。2.荧光染料技术（FluorsentDye）：应用于细胞示踪的荧光染料有很多种，包括CM-DiI、CFSE、hochst33342、DAPI和PKH26。在这些染料中CM-DiI有45%-70%的细胞毒性并且在标记后