LSPR生物传感器的制备与测试

摘要近年来，金纳米材料因为其本身所具有的独特的光学、电磁学以及力学特性而被人们广泛关注。而对金纳米颗粒的局部等离子共振特性（LSPR）的研究更是成为在很多研究领域中的重中之重。本论文主要研究了金纳米颗粒的制作、组装、修饰以及检测。在此基础上，对金纳米颗粒的局部表面等离子共振（LSPR）特性进行了分析。本论文的具体工作主要包括以下几个方面：（1）总结了金纳米颗粒特性以及LSPR的基本原理；通过阅读大量的文献，总结和概括了现有的制备金纳米颗粒的方法，分析了各自的特点。（2）我们采用了柠檬酸钠还原法制备了球形的金纳米颗粒溶液，并在玻璃片上进行组装，通过紫外-可见分光光度计，TEM和AFM的测量来比较金纳米颗粒的各项性能指标，以此来研究金纳米颗粒的特性。（3）我们通过对金纳米颗粒进行蛋白修饰来研究金纳米颗粒表面覆盖多层膜的光谱特性，以及蛋白修饰后的金纳米颗粒对周围环境折射率变化的灵敏度。在这篇论文中我们通过调节柠檬酸钠与氯金酸的摩尔比可以控制金纳米颗粒的尺寸大小，制备了多种尺寸的金纳米颗粒；同时根据我们对金纳米颗粒的消光光谱分析以及对周围环境折射率变化产生的光谱变化的研究发现，当金纳米颗粒尺寸大约为33nm时，对周围环境折射率的变化灵敏度是最高的；同时我们实现了对金纳米颗粒的蛋白修饰，并测量得出其对周围环境折射率变化的灵敏度为103nm，相关结论对LSPR生物传感器的进一步研究具有参考意义。关键词：金纳米颗粒局部表面等离子共振柠檬酸钠还原法消光光谱蛋白修饰AbstractDuetoitsownuniqueoptical,electromagneticandmechanicalproperties，goldnanomaterialhasdrawnextensiveattentioninrecentyears.Thestudyofgoldnanoparticlesonlocalizedsurfaceplasmonresonance（LSPR）isthepriorityamongprioritiesinmanyresearchfields.Inthispaper,mostresearchisputontheproducing,assembly,modificationandtestingofgoldnanoparticles.Onthatbasis,wemakeafurtherstudyofLSPR.Specificworkofthispaperincludesthefollowingaspects:(1)SummaryofthecharacteristicsofgoldnanoparticlesandthebasicprinciplesoftheLSPR;Byreadingalargenumberofreferences,thispapersummarizestheexistingmethodsofproducinggoldnanoparticles,andgivesananalysisoftheirowncharacteristics.(2)Weproducethesolutionofsphericalgoldnanoparticles,usingsodiumcitratereductionmethodandassembleitonglass.UV-visiblespectrophotometer,measurementsofTEMandAFMareusedtocompareitsperformancesinordertostudythecharacteristicsofgoldnanoparticles(3)Throughtheproteinmodificationofgoldnanoparticles,westudythespectralpropertiesofmultilayerfilmsontheirsurfaces,aswellasthesensitivityofproteinsmodifiedgoldnanoparticlestotherefractiveindexchangesofthesurroundingenvironmentsInthispaperwecancontrolthesizeofgoldnanoparticlesandproduceavarietyofsizesofgoldnanoparticlesbyadjustingthemolarratioofSodiumcitrateandchloroauricacid.BasingonourextinctionspectrumanalysisofgoldnanoparticlesandtheSpectralchangesaccordingtorefractiveindexchangesofthesurroundingenvironment,wefindthatwhenthegoldparticlesizeisabout33nm,ithasthehighestsensitivitytothechangesoftherefractiveindextothesurroundingenvironment;Atthesametimewerealizetheproteinmodificationofgoldnanoparticlesandobtainedfromthemeasurementthatitssensitivitytochangesoftherefractiveindextosurroundingenvironmentis103nm.TheseresultsofferreferencesforadvancedresearchonLSPRbiosensor.Keywords:Goldnanoparticles,Localizedsurfaceplasmonresonance,Citratereduction,Extinctionspectra,Proteinmodification目录TOC\o"1-4"\h\z\u第一章绪论 1第一节金纳米材料 11.1.1金纳米材料的历史 11.1.2金纳米的定义 31.1.3金纳米颗粒的特性 4第二节局部表面等离子共振(LSPR) 71.2.1LSPR的原理 81.2.2LSPR理论模型 91.2.3LSPR与SPR的比较 10第三节本论文的主要研究目的及内容 11第二章金纳米颗粒的制备 12第一节物理方法 122.1.1真空蒸镀法 122.1.2软着陆法 122.1.3激光消融法 132.1.4光刻技术 142.1.4.1电子束刻饰技术 142.1.4.2纳米球光刻技术 142.1.4.3纳米压印光刻技术 152.1.4.4胶体光刻技术 16第二节化学方法 172.2.1柠檬酸钠还原法 172.2.2晶种法 172.2.3相转移法 182.2.4胶束与反胶束法 20第三节物理辅助方法 20第三章柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒 22第一节柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒 223.1.1试剂和仪器 223.1.2制备过程 23第二节对金纳米颗粒溶液的研究 243.2.1对金纳米颗粒溶液的TEM图的研究 253.2.2对金纳米颗粒溶液消光光谱的研究 27第三节金纳米颗粒在玻璃片上的组装 29第四节对组装在玻璃片上的金纳米颗粒的研究 303.4.1对同一尺寸、不同浓度的金纳米颗粒进行组装的研究 303.4.2对不同尺寸的金纳米颗粒进行组装的研究 323.4.3金纳米颗粒组装后在不同溶液中的研究 34第五节本章小结 40第四章金纳米颗粒表面进行蛋白修饰 41第一节金纳米颗粒与巯基丙酸的结合 414.1.1实验过程 414.1.2测试与结果 434.1.3硼氢化钠还原法 47第二节金纳米颗粒的蛋白修饰 484.2.1金纳米颗粒蛋白修饰的实验过程 484.2.2实验检测与结论 50第三节本章小结 53第五章总结与展望 54第一节总结 54第二节展望 55参考文献 56致谢 59个人简历 60第一章绪论近年来，纳米材料[1-3]因为它们所具有的独特的光学、电磁学以及力学特性而被广泛关注。而在纳米材料中，贵金属纳米颗粒在紫外-可见光区域产生一个很强的吸收带，这在绝大多数的金属纳米材料中是不会发生的。科学研究表明，贵金属纳米颗粒的这些特有性质取决于光的强烈程度，而对纳米颗粒光学领域的研究又使得我们对于材料的成分、尺寸、形状以及周围环境等等之间的关系有了更深层次的理解。对贵金属纳米颗粒的特有性质的研究在理论和实践上都具有非常重要的意义。从理论上讲，它对于系统研究纳米量级结构和引起光学性质变化的局部环境因素，以及预测结构的变化等等方面都十分重要；从实践上讲，纳米结构的光学性质如果可调试，则可以应用于表面增强光谱、光学滤波器、等离子体设备和传感器等领域。目前作为贵金属纳米颗粒的研究对象我们主要采用两种材料，那就是金和银。这两种贵金属纳米颗粒材料的光学特性在各方面都对我们的研究具有很大的吸引力。我们知道贵金属纳米颗粒，譬如说金和银，在可见光区域内都有很强的消光效果，通常被认定为局部表面等离子体共振（LSPR）现象。这种LSPR现象发生时，入射光子的频率与贵金属纳米颗粒或者传导电子的整体振动频率是基本上一致的。纳米量级的金和银颗粒在紫外可见光区域也同样表现出独特的光学响应，同时它们的消光效率也会随着光子能量的减少而呈指数衰减。在我们的研究过程中，因为金纳米颗粒是最稳定的贵金属溶胶之一，具有很多独特的与形貌尺寸特性相关的性质。近年来关于通过对金纳米颗粒进行功能团修饰来进行生物检测标记物的研究也是层出不穷，人们对金纳米颗粒在生物、医学等领域的应用的研究非常关注。因此在我们这篇论文中，我们选择贵金属金作为纳米材料研究对象来进行一系列的研究。第一节金纳米材料1.1.1金纳米材料的历史金的提取开始于公元前五千年的时候[4]，在大约公元前1200-1300年，当时埃及人在建造Touthankamon雕像时，提取量就已经达到了10吨每年，而且“可溶性”金的出现是在埃及和中国。在古代，金被赋予了审美以及医疗目的这样的社会生态意义。胶体金曾经被用于制造红宝石玻璃以及用于陶瓷着色，这些应用到现在也仍在继续。最著名的例子就是公元前五世纪到四世纪建造的Lycurgus杯，它在传输光时颜色是宝石红，而在放射光时颜色则是绿色，这些都是因为金溶胶的缘故。直到中世纪，由于对各种疾病，如心脏病、性病、痢疾、癫痫、肿瘤以及对梅毒的诊断等都有着惊人的药效，可溶性金引起了人们的广泛关注，变得名声大振。这是在一本由哲学家和医学博士FrancisciAntonii于1618年发行的著作里有详细描述，该书被认为是关于胶体金的第一著作。这本书在关于胶体金溶液的形成及其在医学上应用方面包括了可观的信息量，其中还包括成功的实例。1676年德国化学家JohannKunckels出版了另一本书，这本书的第七章是关于“含有金属金的中性、淡紫色溶液中的可服用金对几种疾病有惊人的医疗效果”。他总结“金必须以肉眼看不到的形式存在”，这在MichaelFaraday前就已经描述的很充分了。在十七世纪流行的一种叫“PurpleofCassius”的玻璃着色剂就是由金颗粒和二氧化锡混杂凝聚制备的胶体。而关于胶体金的完整论述的著作则是在1718年由HansHeinrichHelcher出版。在这篇论述中，这位哲学家和博士表明在可服用金的制备过程中加入煮过的淀粉会明显增加金颗粒的稳定性，此观点在18世纪已经形成共识，这在1769年的法国词典中就有指出。在“或者可饮用”的前面标明了“可服用金必须是以元素形式存在的，而不是以极端亚分离的形式悬浮在溶剂中”。1794年，Fuhlame女士在一本书中报道她用胶体金给丝绸染色。1818年，JeremiasBenjaminRichters给出了一个为什么在可服用金的制备过程中会有不同颜色的解释：粉色或紫红溶液所含的金是分散的、不团聚的最好尺寸，而黄色溶液则是颗粒已经聚集了的结果。在1857年，Farada报道了用磷在二硫化碳（CS2）中还原一种氯金酸盐的水成溶液得到深红色的胶体金溶液，这个实验非常的著名。他通过干燥胶体金溶液制备金薄膜并研究其光学特性，而且研究观察它的颜色变化。尽管在中世纪胶体金在医学上的主要应用是来诊断梅毒，这种方法一直用到二十世纪，但是这种方法并不是完全可靠的。在二十世纪，各种不同的制备金胶体的方法被报道和使用。尤其是在Schmid[5,6]和Brust[7]取得突破性进展之后，由于胶体金的基本原理和应用方面都与量子效应有关系，这一点在二十一世纪的文献中多半才被提到，因此胶体金这个课题更多地被集中研究。1.1.2金纳米的定义在上一节中我们所提到的可服用的金就是指的金纳米颗粒，它是保存在溶液中的金纳米颗粒。金纳米颗粒是指直径在1-100nm之间的金材料。金纳米颗粒在溶液中并不是溶解在溶液中的，而是呈现出透明的悬浮状态，因此我们把金纳米溶液也称之为金纳米胶体。所谓胶体我们可以用以下实验来定义：如果将一把泥土放在水中，大颗粒的泥沙很快沉淀下去，浑浊的细小颗粒的泥土因受重力的影响最后也沉淀到容器底部，而泥土中的盐类物质则溶液成真溶液，但是混杂在真溶液中的还有一些极为微小的土壤颗粒，它们既不会沉淀，也不会溶解，人们就把这些即使在显微镜下也观察不到的微小颗粒称之为胶体颗粒。由于金纳米的尺寸、形状各不相同，折射和吸收峰不同，因此金纳米颗粒在溶液中的颜色也各不相同。根据金纳米颗粒的结构形态不同，我们可以把它分为以下几种类型：（1）零维材料就是纳米颗粒的三维尺寸都在我们所规定的纳米尺寸内。包括球形（nanosphere）、三角形（nanotriangle）、纳米立方体(nanocube)以及纳米环(nanoring)等等。如图1.1所示：图1.1几种零维纳米材料的形状（2）一维材料就是纳米颗粒的三维尺寸有一个不在所规定的纳米范围内。比如说纳米棒（nanorods）和纳米线（nanowires）。当他们的长度大于100nm时就是一维的金纳米材料。如图1.2所示：图1.2一维纳米材料示意图，左边是纳米棒，右边是纳米线（3）二维材料就是纳米颗粒的三维尺寸中有两个不在所规定的纳米尺寸范围内。比如纳米盘（nanoplate）。除了这些结构之外，再加上其他的空心结构以及核壳结构，综合起来，纳米颗粒的结构有以下这些种，如图1.3所示图1.3各种纳米颗粒结构的示意图1.1.3金纳米颗粒的特性金纳米颗粒有很多非常独特的性质，例如说局部等离子共振特性、表面增强拉曼散射特性、荧光特性、电化学特性和超分子与分子识别特性等等，下面我们就一一介绍下这几种特性。1.局部表面等离子共振特性（LSPR）局部表面等离子共振是由于入射光的电磁场引起的金纳米颗粒表面电子云的集体振动，当入射光的电磁场频率和金纳米颗粒表面电子云振动频率二者相一致的时侯，就会在波长520nm附近产生一个很宽的消光峰。这一特性的结果就是使得金纳米颗粒呈现不同的颜色，这一性质对我们将来的研究非常的重要。局部表面等离子共振特性是金纳米颗粒最重要的特性之一，对于此特性的研究无论对于科学研究，还是对于应用发展都有着极其重要的意义。局部表面等离子共振的原理在1908年被Mie理论[8]所解释。根据Mie理论和Maxwell-Garnett理论[9],金纳米颗粒随着粒径的变化以及形状大小的变化，消光峰的位置和带宽都会相应的发生变化，基本上是随着尺寸的不断增大，消光峰会发生红移。当金纳米颗粒表面被修饰，其消光峰也会发生移动和峰形的变化，我们根据这些性质，就可以利用金纳米颗粒来检测一些生物指标，这个我们在接下来的论文中会做详细的介绍。2.表面增强拉曼散射[10,11]（SERS）金纳米颗粒除了可以产生局部表面等离子体共振（LSPR）之外，还能发生表面增强拉曼散射效应（SERS），两者是同时发生的，如图1.4所示：图1.4受到光激发的时候，（a）LSPR和（b）SERS同时发生的示意图从图1.4中我们可以看到，当有入射光照射金纳米颗粒时，就会同时发生LSPR现象与SERS现象，我们需要用特殊的仪器来检测出SERS现象所产生的拉曼光谱。拉曼光谱(Ramanspectroscopy)是用来表征分子振动能级的指纹光谱,它在很多领域的应用都是非常广泛的。拉曼光谱的优点很突出，譬如说我们已经知道的它有很高的光谱灵敏度以及非常好的空间分辨率。但是除此之外，拉曼光谱也有着很明显的缺陷就是它的散射截面极小，这样就很容易导致背景荧光经常会把它直接淹没。因此，利用一般的拉曼散射就无法去探测那些容易产生荧光和低浓度的生物样品。但是金纳米材料的拉曼散射非常强，比传统的拉曼散射要提高了大约1010个数量级，这就使得信噪比得到了很好的提高。下图就是一个表面增强拉曼的散射示意图，如图1.5所示：图1.5表面增强拉曼的散射示意图目前，科学界公认SERS主要是由两种因素的共同作用形成的，一种是电磁场增强（EM机理），另一种是化学增强（CT机理）。EM机理的作用受到很多因素的影响，主要有纳米材料的种类、形状和尺寸等等。CT机理的作用受材料种类以及表面吸附的分子影响，而且在目前的研究领域中，我们一般可以忽略CT机理的作用；从另一方面我们也可以说EM机理对SERS的贡献远远超过CT机理的贡献。其实等离子共振可以产生电磁场增强效应，但这并不是唯一一种方法，根据金属椭球模型的计算，还有一种叫做避雷针的效应，它可以在一定范围内使的拉曼信号得到最大增强。这两者如果共同作用就会产生非常强大的电磁场增强效应。我们可以简单地理解，吸光后，首先产生LSPR，电子云震荡开始，相当于表面粗糙了，表面积增大，因此拉曼散射提高了很多倍。SERS的过程可以用图1.6来表示：图1.6SERS过程图1.6SERS过程如下：（1）激光入射在金属基底上；（2）产生LSPR现象；（3）散射开始；（4）一部分拉曼散射回到里面重新振荡，一部分散射到空气中；（5）得到拉曼散射信号。3.荧光特性目前对于金纳米颗粒荧光特性的研究在很多方面都已经展开了[4,12,13]。例如如果芘基、聚辛基苯硫基等探测体覆盖在金纳米颗粒周围时，当入射光照射时就会产生共振能量转移，从而引起荧光特性，这方面的研究目前深受人们的重视并引起了生物光子学和材料科学的广泛兴趣。金纳米的荧光特性与金纳米颗粒的尺寸和形状，以及跟金纳米颗粒自组装修饰的分子都有很大的关系，在很多研究领域人们已经利用这些关系设计了很多与现实生活相关的产品，例如光控开关等。4.其他特性除了以上我们所说的几种比较重要的特性之外，金纳米颗粒还包括很多其他特性[4,14-17]，比如说超分子和分子识别特性、电化学特性以及其他应用于很多方面的电子特性等等。这些特性之中对我们实验检测比较有帮助的就是超分子与分子识别特性，这一特性对现在的生物传感器以及医学检测领域都有着非常重要的意义。上面介绍了很多金纳米颗粒的特性，在我的论文中主要研究的就是金纳米颗粒的局部表面等离子共振特性（LSPR），这个性质作为金纳米颗粒最重要的特性之一，在很多方面有着广泛的应用。我们主要用LSPR来检测生化量，未来我们可能更多的会去研究和发展表面增强拉曼散射特性（SERS）和荧光特性。第二节局部表面等离子共振(LSPR)LSPR现象[18-21]是贵金属纳米颗粒特性中最重要的特性之一，它主要发生在金属纳米颗粒表面。LSPR现象随着金属纳米颗粒的种类、形状以及大小等很多因素的不同会表现出非常独特的光学性质，而这些性质在传感器领域都具有得天独厚的优势，备受关注。下面我们就重点介绍一下贵金属纳米颗粒的局部表面等离子共振特性。1.2.1LSPR的原理在介绍LSPR的原理之前，我们不得不先简单的介绍一下表面等离子共振（SPR）现象。SPR[22]是一种物理光学现象，我们知道当一束光从高折射率的介质中入射到低折射率的介质的界面时，如果入射角高于一个临界角时，就会产生全反射，入射光能量几乎全部发射回高折射率介质中。根据这一理论，当入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质表面（比如玻璃表面的金属镀层）时，金属表面的自由电子就会产生表面等离子振荡，这样就使得自由电子消耗了一部分入射光能量，从而使反射光强度在一定角度内大大减弱。我们称这种现象是表面等离子共振现象（SPR）。SPR随着表面折射率的变化而变化，而折射率的变化和结合在金属表面的生物分子质量成正比，这样我们就可以利用这个关系来检测生物分子。而局部表面等离子共振（LSPR）则与之有些不同。由于纳米颗粒具有大的比表面积，自由电子的运动往往受到颗粒边界的强烈影响，因而光学性质主要由表面自由电子的性质来决定。许多金属表面的自由电子都可以形象地看作电子云，电子云的集体激发称作等离子体，如果激发只局限在表面区域，就叫做局部表面等离子体。图1.7为球形金属纳米颗粒的局域表面等离子体共振示意图。当一束光照射在球形金属纳米颗粒上时，金属纳米颗粒里的传导自由电子就会在振荡电场的影响下产生移动，当电子云偏离原来的位置时，因为电子云带负电，原子核带正电，它们之间就会产生一个静电回复力，把电子云往回拉，这样就使得电子云相对于原子核做来回的振荡。当入射光的频率和金属内这个来回振荡频率相同时，就会产生共振，这种共振在宏观上就表现为金属纳米颗粒对光的吸收。这种现象我们就称之为局部表面等离子体共振，简称LSPR[23]。其共振频率与电子密度、电子有效质量、电子分布形状和大小等密切相关。图1.7LSPR原理示意图从原理上我们可以看出，LSPR现象相当于离散的SPR现象，相当于SPR的现象不再是连续的了，而只是集中在单个的纳米颗粒上，因此LSPR的灵敏度不如SPR。1.2.2LSPR理论模型最简单的纳米颗粒光学响应模型是Mie理论[24-27]，这是由G.Mie在1908年的时候提出来的，这也开辟了微粒对光散射和吸收作用的新方向，也描述了球形金属纳米颗粒的消光情况。具体形式如式1.1所示：（1.1）其中，E(λ)为消光量，即吸收和散射的总和；NA是纳米颗粒的局部密度；a是金属纳米球体的半径；εm是金属纳米球体周围介质的介电常数（假设为正实数，且与波长不相关）；λ是入射光波长，εi是金属纳米球体介电常数的虚部；εr是金属纳米球体介电常数的实部。容易看出，当分母中的共振项(εr+2εm)2接近零时，这就是发生LSPR共振的条件所在。从Mie理论的模型中可以看出，金属纳米球体颗粒的LSPR光谱特性与纳米颗粒的半径a、纳米颗粒材料（εi和εr）以及纳米颗粒周围介质的介电常数εm这四个参数有关。更深一步的进行研究表明，如果纳米颗粒不是球体时（通常为实际情况），消光光谱将取决于纳米颗粒的直径、高度和形状。在这种情况下，分母中的共振项应写作ε其中χ是形状因子项，用来描述纳米颗粒形貌比例。5:1的纳米颗粒形貌比率所对应的χ的值随着二者（对于球体来说）同17的差值而增加。此外，很多样品为沉积在衬底表面的纳米颗粒集合。因此，LSPR还取决于颗粒间距和表面绝缘常数。从式(1.1)中还可以看出，贵金属纳米颗粒的最大消光位置高度取决于周围环境的电介质性质，并且纳米颗粒最大消光波长的移动能够被用于检测纳米颗粒周围由分子引起的变化。1.2.3LSPR与SPR的比较经过很多的研究表明，现在基于LSPR的纳米生物传感器是SPR生物传感器的拓展和延伸[28,29]。而且现在因为在LSPR传感技术中采用了具有特殊光学性质的纳米颗粒，因此这种技术相对于SPR传感器技术，有着其独特的优势：1.由于LSPR的共振条件对温度不敏感，不需要额外添加温度控制系统，所以较以往的SPR传感器简单。2.不同形状的纳米颗粒所表现出来的敏感度不同，可以通过选用不同的纳米颗粒形状来配合检测系统中激发光源的波长，以此提高检测敏感度。3.几种纳米颗粒可以通过统一的光谱响应来检测，这样就可以将多种颗粒集成在一个芯片上，以达到对多种生化分子同时完成快速、实时检测。4..LSPR可以采用更简单的光路设计，更容易实现大规模的阵列式检测，大大提高了检测的效率；而且容易实现设备的小型化和低成本化。5.样品扩散至纳米颗粒表面会比扩散至连续膜层表面更快，可以加快分子之间的反应速率。由于LSPR中的消光现象是由于纳米颗粒对光的吸收作用和瑞利散射作用共同作用引起的，我们对LSPR的效果的实验就不需要像我们实现SPR（表面等离子体共振）那样，必须要有很多很复杂的实验装置。因此我们利用LSPR生物传感技术能够制作出体积小、系统设置简单和操作便捷的生物传感器，与传统的SPR生物传感器有很大的差别。我们通过总结和比较，总结出LSPR与SPR之间的区别和共同点。首先SPR与LSPR检测系统的检测方法就不同，SPR是根据共振角的偏移来测量最后的实验结果，而LSPR是根据消光光谱的消光峰的偏移来检测实验的结果。其次它们都是基于金属表面的等离子体共振对外界环境的影响来探测生物分子的特异性结合的，所以具有灵敏度高，无标记检测，实时性强等优点。相比于SPR的折射率灵敏度2×106nm/RIU，LSPR的折射率灵敏度低，为2×102nm/RIU。因为SPR的折射率灵敏度高，对温度的影响也不能忽略，所以一般需要温控的设备，增加了SPR检测系统的设计成本。再次SPR检测系统已经成熟，可规模化生产，其成本大约为$150,000-$300,000，而LSPR检测系统的成本为$5,000（多颗粒），$50,000（单颗粒），由于成本更低，而且不需要温控等设备，所以当研发条件成熟以后，可规模化生产，也有着很高的商业价值。最后由于LSPR是在单个纳米颗粒或者多个纳米颗粒的表面引起的共振反应，而SPR是在整个金属表面的共振反应，所以LSPR传感器的空间分辨率高，有更好的小分子灵敏性。第三节本论文的主要研究目的及内容对于金纳米颗粒LSPR现象的研究现在已经在生物学、医学、分子学等很多领域引起了足够的重视，我们的主要研究目的是研究金纳米颗粒的制作方法，通过不同的制作方法（包括物理方法和化学方法）制作不同尺寸、形状的金纳米颗粒，通过测量比较各种金纳米颗粒的优缺点，寻求最佳的尺寸形状，用于在生物医学传感器上的使用。本论文的主要内容安排如下：第一章绪论就如前所述，主要讲金纳米颗粒以及LSPR现象的基础知识，为之后的研究做个铺垫。第二章通过阅读大量文献，总结了目前比较被关注的各种金纳米颗粒的制备方法，分析它们各自的特点，选择合适的方法进行我们的实验。第三章是我们的重点，主要是用柠檬酸钠法还原法进行制备金纳米颗粒，并在玻璃上进行组装，通过紫外-可见分光光度计，TEM和AFM的测量来比较金纳米颗粒的各项性能指标，以此来研究金纳米颗粒的特性。第四章研究对金纳米颗粒进行蛋白修饰的方法，并研究修饰蛋白后的光谱特性，以及蛋白修饰后的金纳米颗粒对周围环境折射率变化的灵敏度。第二章金纳米颗粒的制备金纳米颗粒作为最好的贵金属纳米颗粒之一，具有很多独特的性质，譬如说极其稳定、还有光学和电学特性，在现在的生物医学检测领域、材料领域以及物理化学领域都有着至关重要的作用，为了能够更好的研究金纳米颗粒的这些特殊性质，金纳米颗粒的制备就显得尤其重要。金纳米颗粒的制备在纳米科技开始发展的上世纪八十年代末九十年代初就有很多的课题组在进行探索了。比如说Turkevich[30]和Frens[31]等在很早之前就做了很多早期的工作。到目前为止，金纳米颗粒的制备方法有很多种，根据我们的总结和归纳，主要包括以下三个大方面：一是物理方法，二是化学方法，最后是物理辅助方法。接下来就从这三个大方面分别介绍金纳米颗粒的制备方法。第一节物理方法2.1.1真空蒸镀法真空蒸镀法是一种比较简单、常见的金纳米颗粒的制备方法，就是在在真空环境下对金进行高温加热或者电子束轰击使得金原子蒸发，并使其在冷的石英衬底上冷凝，这样就可以制备出粗糙的金纳米颗粒。虽然这种方法比较简单，但是通过这种方法制备的金纳米颗粒形状和尺寸都不均一，这种方法不好控制。这种方法的缺点非常明显，一般很少采用。2.1.2软着陆法软着陆法其实类似于真空蒸镀法，但是由于在真空蒸镀法的过程中很难对金纳米颗粒的尺寸和形状进行精确控制，因此我们对此方法进行了改进。软着陆法就是在真空蒸镀法的基础上，在金原子蒸发的过程中不断地吹入氩气流，使得金纳米颗粒在轻轻地沉积在固体基底上之前，固体基底已经被一层冷冷的氩气覆盖，金纳米颗粒沉积在被氩气覆盖的基底上。这种方法制备的金纳米颗粒的形态完全不同于简单的真空蒸镀法制备的金纳米颗粒，它们更加趋于球形，而且尺寸分布比较均一，但是尺寸大小不太容易控制。这种方法用的也比较的少。2.1.3激光消融法Henglein，Cotton和他们的同事发现了在液体下用激光消融法可以制备金属纳米颗粒[32]。最近Yeh和他的团队也用激光消融法制备了铜纳米颗粒。在最近的研究中，发现通过SDS（十二烷基磺酸钠）的水溶液中用激光消融金盘可以制备金纳米颗粒[33]。通过调节SDS的浓度和激光的波长可以控制金纳米颗粒的尺寸。激光消融法的具体结构图如图2.1所示：图2.1激光消融法结构示意图从图2.1中可以看出，金盘（纯度大于99.99%）放置在玻璃容器的最底部，容器中装入10ml的SDS水溶液。金盘被波长为532nm的激光通过透镜会聚后进行照射，透镜的焦距为250mm，调节透镜和金盘表面的距离，使得金盘表面的光斑直径在1-3mm范围内。控制激光的输出能量最大在90mJ每一个脉冲。在激光束的照射下，溶液逐渐变成酒红色，这就制备出了金纳米颗粒，在整个制备过程中要使用表面活性剂来阻止金纳米颗粒的团聚。随着SDS浓度的不断提高，纳米颗粒的尺寸单分散性就越好。不过这种方法制备的金纳米颗粒尺寸一般在1-5nm之间，不太适合大尺寸纳米颗粒的制作，但是一个优点就是这种方法可以适用于很多种类金属纳米颗粒的制备，重复性高，操作比较简单。2.1.4光刻技术在目前的研究成果中，纳米光刻技术发展的很快，有很多种不同的方法，早期比较常用的有电子束刻饰技术（EBL）和纳米球光刻技术（NSL），后来又发展了很多新的、方便实用的技术，比如说纳米压印光刻技术[34,35]（NanoimprintLithography）和胶体光刻技术[36,37](ColloidialLithography)等等。下面就分别进行简单介绍。2.1.4.1电子束刻饰电子束刻饰技术是比较早被人使用的光刻技术，它是一种在衬底上制备规则排列纳米结构的方法，主要是通过用高能量的电子对一层薄薄的光刻胶膜进行冲击，随后进行化学处理，沉积贵金属，目前很多课题组对二维排列纳米颗粒的光学特性研究，以便利用这些纳米颗粒组装成表面增强的光谱基底。虽然电子束刻饰在纳米范围内提供了精确地控制，但是它是一种十分昂贵，而且耗时长的技术，这种方法产量也比较少，因此不适合大面积的生产。2.1.4纳米球光刻技术是一种方便操作、便宜而且高产出的一种光刻技术，人们主要运用这种技术制备纳米三角形颗粒。这种方法适合很多金属或者非金属的纳米三角形颗粒的制备。我们就以纳米金三角形颗粒的制作过程为例，来简单介绍一下纳米球光刻技术。首先清洗基片；然后将单一溶剂的聚苯乙烯纳米球悬涂覆盖在基片上；之后通过加热烘干，使得聚苯乙烯纳米球紧密排列，形成纳米球掩膜，之后蒸发金使之沉积在上面，在乙醇中通过超声波作用去除掉聚苯乙烯纳米球掩膜，最后就留下了金纳米微粒样品。这种方法由于聚苯乙烯纳米球尺寸的多分散性，导致了有很多的不可弥补的缺点，比如说大小尺寸的不均匀性、位置比较随机等问题。但是这种方法整体上操作比较简单，比较廉价，产量大，输出高，适合大面积的制备金纳米颗粒，这种方法主要是用来制备纳米三角形颗粒。2.1.4纳米压印光刻技术是一个高产出率，可重复性强的非常有发展前景的光刻技术。这种方法对于制备尺寸大小可控的金纳米环和纳米盘都非常的有指导意义。操作过程如下所说：首先用电子束蒸发器在玻璃基片上镀2nm厚的铬层，用来增加金和玻璃基底的粘附性，然后镀上40nm的金膜。然后配制不同浓度的聚苯乙烯（ps）溶液，然后悬涂在薄的金膜上，在高于玻璃转换温度的一个温度下进行退火，压印一个按照规范流程制作的PDMS模板。这个压印过程要在150摄氏度的温度和不高于1.6kpa的真空中进行30分钟到一个小时。图2.2纳米压印光刻技术示意图在图2.2A中是高浓度的ps溶液，ps膜足够厚可以填充整个PDMS模板和基底之间的圆柱形空洞。同时当ps浓度低于0.8wt%时，ps膜厚度很薄，部分填充在圆柱形空洞，就像图2.2B所示。在这种低浓度的情况下，ps是在毛细作用力的作用下沿着PDMS膜填充，这样就形成环的形状。之后用CF4/O2离子刻蚀作用去掉多余的没用的ps膜，离子刻蚀会细微的改变一点ps图形的尺寸。在冷却到室温以后，以ps图形为模具进行氩离子刻蚀两分钟。这样就可以只留下ps模具下的金的排列，其余的都被去掉。氩离子刻蚀需要400v的直流电，氩气压保持在5*10-4我们可以通过控制ps浓度来控制纳米环和纳米盘的形成，金膜的厚度据定了纳米环和纳米盘的高度，PDMS模具的孔径决定了纳米环和纳米盘的外径，ps的浓度决定了纳米环的厚度，ps浓度越高，纳米环的厚度就越大，越向纳米盘靠近；反之，则纳米环的厚度就越小，研究表明，纳米环的厚度越小，吸收峰的位置就越靠外，对于环境改变所引起的改变就越大，灵敏性越高。这种方法比较适合于要求排列整齐，精度要求比较高，产量比较大的制备。但是制备纳米级别尺寸的PDMS模板是非常不容易的，而且利用这种方法制备的纳米环的外部由于刻蚀会产生比较严重的毛疵，会给实验结果带来一定的影响。2.1.4胶体光刻技术最早是J.Aizpurua等人在论文“纳米环的光学特性”（OpticalPropertiesofGoldNanorings）中提出来的。这种方法是一种非常简单，同时效果也非常不错的制备纳米环和纳米盘的途径。整个过程如下：第一步，用静电自组装的方法在玻璃（碱石灰）基底上沉积聚苯乙烯胶体球（硫酸盐修饰的）。第二步，然后在上面垂直蒸发形成一层15-40nm的金膜，金膜的厚度控制金纳米环的厚度，聚苯乙烯球的直径决定纳米环的内径。第三步，进行氩离子束刻蚀，除去金膜，同时在这个过程中产生二次溅射，在聚苯乙烯胶体球的底部形成一种环状包围。最后，用紫外臭氧处理出去聚苯乙烯球，然后进行水洗，形成金纳米环。如果要制备纳米盘，只需要将第一步和第二步进行顺序颠倒，同时通过加热处理改变聚苯乙烯球的形状即可。这种方法的关键是聚苯乙烯球和基底之间的静电自组装。而静电自组装又是一种非常常用的技术，已经非常成熟，因此用胶体光刻技术制备纳米颗粒是行之有效的，做出来的纳米环和纳米盘形状比较规则，排列分布也比较好。第二节化学方法2.2.1柠檬酸钠还原法在众多的金纳米颗粒的制备方法中，柠檬酸钠还原法是最早，也是最常被使用的方法。1951年，Turkevitchtl[30]就发现了可以使用柠檬酸钠把三价的金离子还原成金原子，形成金纳米颗粒。之后在1973年，Frens[31]同样利用这种方法制备了金纳米颗粒，但不仅仅是如此，他还发现通过改变柠檬酸钠和三价金离子之间的比例可以控制制备的金纳米颗粒的尺寸大小，并通过这种方法制备出直径为16-147nm的金纳米颗粒。柠檬酸钠还原法的具体过程如下：首先要彻底清洗所有将要使用的玻璃容器，以避免因容器不干净引起制备的金纳米颗粒的团聚和变质；其次配制质量体积比为1%的氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液；接着取100ml去离子水放进三口烧瓶中，在电磁搅拌器的油浴中进行加热，油浴温度设置在高于100℃的温度，一般选择120℃。加入一定量配制好的氯金酸溶液加热至沸腾，然后迅速加入一定量准备好的柠檬酸钠溶液，加热十五分钟。在加热三到五分钟之后，溶液就开始变色，从黄色变成酒红色；最后关闭电磁搅拌器，把烧瓶取出冷却到室温，把制备的金纳米溶液在4℃的温度下遮光保存。这种方法操作简单，比较容易控制金纳米颗粒的形状和尺寸。制备金纳米颗粒的尺寸范围也比较大，但是柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒随着尺寸的增加，单一性逐渐变差，形状越来越不接近球形，尺寸分布也越来越不均匀，我们将在下一章重点对柠檬酸钠还原法进行研究讨论，在此就不过多的介绍了。2.2.2晶种法上面提到的柠檬酸钠还原法随着颗粒尺寸的增大，单分散性就会越来越差，在50nm以内时单分散性还行，但是当尺寸超过了50nm，则出现一下两种情况，一是多分散性，尺寸不均匀；二是有很多纳米颗粒是非球形的，形状不规则。而晶种法其实就是对于柠檬酸钠还原法的一个完善和补充，它可以利用柠檬酸钠法制备的小尺寸的纳米颗粒，通过不断地生长，制备单分散性好，形状规则的大尺寸的纳米颗粒。因此晶种法是一种实现单分散性和形状规则的大尺寸金纳米颗粒制备的好方法。晶种法制备金纳米颗粒主要分两步，第一步就是采用强还原剂（如柠檬酸钠等）使得三价金颗粒还原成金原子，形成小尺寸的金纳米颗粒；第二步就是把制得的小尺寸的金纳米颗粒作为晶种，通过加入弱的还原剂，在氯金酸溶液中使晶种不断长大，通过控制还原剂量的多少来控制纳米颗粒的尺寸。为什么要加入弱的还原剂呢？因为如果我们还用强的还原剂，那加入晶种不仅使晶种不断成长，同时也会产生新的、小的纳米颗粒，这样就存在一个二次成核的问题，结果使得制备的金纳米颗粒单分散性不好，这就与我们的目标背道而驰，而选择弱的还原剂，如对苯二酚、抗坏血酸等弱还原剂，它们本身是不能直接把氯金酸中的三价金离子还原成金原子的，只能还原成一价金离子，而在加入晶种之后，由于金纳米颗粒的表面活性，使得可以在晶种上把一价金离子还原成金原子，吸附在晶种表面，这样金纳米颗粒就会不断的增大。一系列的实验证明，在不存在晶种的前提下，弱的还原剂是不会还原出金纳米颗粒的；同时有晶种，没有弱还原剂也不会完成实验。随着晶种的不断减少，氯金酸和还原剂不变的情况下，颗粒的尺寸越来越大。晶种的增长都是通过在晶种溶液中增加或者减少氯金酸中三价金离子和晶种金原子的比例来调节。如果选择抗坏血酸作为还原剂，它本身是不能把金离子还原成金原子的，只有当晶种存在的情况下，抗坏血酸才能把金离子在晶种表面还原成金原子，从而使得晶种不断的增长。这样就避免了金纳米颗粒二次成核的问题。通过研究和归纳总结，可以用下面方程（2.1）来计算金纳米颗粒的直径。Dfinal=Dseed｛（[Au(0)]+[Au(Ⅲ)]）/[Au(0)]｝1/3（2.1）其中D代表颗粒的直径。2.2.3相转移法在双相体系下制备胶体金最早是由Faraday发明的，他是在二硫化碳中用磷还原了一种水相的金盐并得到了一种红宝石颜色的分散的金纳米颗粒的水溶液。如果我们把这种双相方法和最新的颗粒萃取和烷烃硫醇单层自聚合技术结合起来，就会得到我们现在所要介绍的想转移法。这种方法是1994年，Brust最早发现并使用的。这种方法包括通过即时联结自聚合的硫醇单层到一个增长的单核上从而让金属簇不断变大。为了让表面反应能够在金属成核并增长的过程中发生，颗粒需要在两相中培养。两相的氧化还原反应能通过选择一种合适的氧化还原反应及在两相相接的部分起作用。在这种情况下，氯金酸根在相转移试剂四辛基溴化铵的作用下由水相转移到苯里，并在十二硫醇参与下由水相的硼氢化钠来还原。在还原剂作用的时候，有机相几秒钟内从橙色变成深棕色。整个反应过程我们可以用下面的方程式（2.2）和（2.3）来表示：AuCl4-(aq)+N(C8H17)4+(C6H5Me)→N(C8H17)4+AuCl4-(C6H5Me)(2.2)mAuCl4-(C6H5Me)+nC12H25SH(C6H5Me)+3me-→4mCl-(aq)+(Aum)(C12H25SH)n(C6H5Me)(2.3)其中电子来源是BH4-，反应条件决定了由硫醇到金的比率。整个制备的过程如下面所讲。把30ml30mmol/L的氯金酸水溶液与80ml50mmol/L四辛基溴化铵苯溶液混合，不停地搅拌双相混合物直到所有的氯金酸转移到有机层中，然后把170mg十二硫醇加入到有机相中，把刚刚制备的25ml0.4mol/L的硼氢化钠水溶液在不断搅拌下慢慢加入进去。在继续搅拌3小时分离有机层，在旋转蒸发仪中蒸发至10ml并加入400ml乙醇出去多余的硫醇。混合物在-18℃下保存4个小时，把析出的深棕色沉淀过滤出来并且用乙醇冲洗。得到的产品用10ml苯溶解后再用400ml乙醇析出，这样我们就可以得到我们所想要的被硫醇修饰的金纳米颗粒。我们通过研究发现，这种方法制备的金纳米颗粒，尺寸分布一般在2-5nm之间，颗粒分散性好，尺寸分布均匀。我们从颗粒和十二硫醇的红外光谱相似可以证明硫醇确实是金纳米颗粒的一部分。它的存在使得金纳米颗粒之间不会发生聚合，形成很好的分散性。在后来，李亚栋[38]等人利用亚油酸钠-亚油酸-乙醇水溶液体系也制备了金纳米颗粒。这种方法制备的金纳米颗粒同样是不仅分散性好，而且尺寸均一。但是这种方法制备的金纳米颗粒尺寸范围比较小，对于我们用于传感器的很多方面都不符合。虽然有很多优点，但是操作也相对复杂，一般我们不作为首要选择。2.2.4胶束与反胶束法胶束与反胶束法，又被称之为微乳液法，是用微乳液、共聚物胶束、反胶束、表面活性剂、隔膜以及其他亲水脂分子来研究制备金纳米颗粒的方法，这在整个金纳米颗粒制备的研究领域都是具有非常重要的意义。这种方法在有或者没有硫醇配合基的情况下都可以合成稳定的金纳米颗粒。胶束是表面活性剂溶解于有机溶剂达到一定浓度时，表面活性剂分子或者离子组合成胶体，当胶体和溶液的离子之间处于平衡状态时，在溶液中形成的聚合体。反胶束是当表面活性剂浓度超过临界胶束浓度（CMC）时，在非极性有机溶剂中形成的亲水极性投朝内，疏水极性头朝外的胶束。反胶束的颗粒大小一般都小于10nm。当颗粒大于10nm但是小于100nm时，我们就称之为微乳液。利用胶束与反胶束法制备金纳米颗粒可以使金纳米颗粒表面形成一层表面活性剂，防止团聚，这样可以保证制得的金纳米颗粒分散性好。在反应过程中我们可以通过改变表面活性剂与反应物的浓度比来控制金纳米颗粒的大小。在之前的研究中很多人都已经通过不同的表面活性剂和反应物制备了稳定的金纳米颗粒。譬如Lin[39]等通过选用CTAB/辛烷和1-丁醇/水的反胶束中用硼氢化钠还原氯金酸制备了金纳米颗粒。这种方法制备的金纳米颗粒稳定性好，尺寸分布比较均匀，但是尺寸比较小，一般都在10nm以下，方法操作起来也比较复杂，但是对于10nm以内金纳米颗粒的制备还是可以参考选用的。第三节物理辅助方法除了我们上面所介绍的物理方法和化学方法外，金纳米颗粒制备方法中还有一种叫做物理辅助方法，它主要包括光化学法和超声化学法两种。经过实验证明，在制备金纳米颗粒的过程中如果引入光波或者是超声波，往往会有一些意想不到的效果，对纳米颗粒的尺寸和形状都有很好的改善作用。例如我们可以用一个杀菌灯作为一个UV（紫外）放射源，对装有适量的氯金酸和TX100（中文名字是辛基苯基聚氧乙烯醚）的封闭的石英试管进行光照射。照射条件是试管在距离光源3厘米的地方照射25分钟，这样就可以得到粉红色的金纳米颗粒。这种方法制备的金纳米颗粒尺寸非常的均匀，形状也非常的接近球形。在这里面TX100既是还原剂，又是稳定剂。在氯金酸一定量的情况下，TX100越多，形成的金纳米颗粒就越小，反之，则越大。这种方法制备的金纳米颗粒可以作为晶种，然后再用晶种法进行继续增长，光化学法与晶种法的结合使用在金纳米颗粒的制备上很有前景。而在超声化学法中，我们能够通过调整超声的功率以及溶液温度高低等参数的方式，来调整和控制所制备的金纳米颗粒的尺寸大小[40]。现在我们对于物理辅助方法的研究和探索工作做的还不是很多，但是这种方法已经显示出它在很多方面的优势和独特性，我们在今后的实验和研究中会越来越多的投入更多的精力在此类方法中。第三章柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒金纳米颗粒是最稳定的贵金属溶胶之一，具有很多独特的与形貌和尺寸相关的光学和电学性质。近年来，关于对金纳米颗粒进行功能团修饰来进行生物检测标记物的研究层出不穷，其中利用金纳米颗粒发展起来的金标免疫层析检测技术备受人们关注。但是这些技术的首要核心技术就是金纳米颗粒的制备。目前制备金纳米颗粒的方法有很多种，就像我们在之前所讲述到的，有水相的柠檬酸钠还原法，相转移法，晶种法，还有很多物理辅助方法，譬如说光化学法，超声化学法等等。这几种方法中，相转移法虽然可以制备出分散性好，尺寸均一得金纳米颗粒，但是一般适用于5nm一下的金纳米颗粒的制备。晶种法是柠檬酸钠还原法的延伸和拓展，晶种法的第一步就是用柠檬酸钠法获得小粒径，单分散性好的金纳米，然后再在其基础上生长单分散性不错的大的金纳米颗粒。另外物理辅助方法需要引入光波或者超声波来控制金纳米颗粒的尺寸，要合成尺寸大小均一的金纳米颗粒需要控制很多的参数，操作复杂，不利于实验的重复性。柠檬酸钠还原法可以通过改变柠檬酸钠和氯金酸的比率还控制形成金纳米颗粒的形状和大小。在适当的比例下可以形成单分散性好，尺寸均一的金纳米颗粒，而且操作方便，过程简单，可重复性高。因此我们最终选择用柠檬酸钠还原法来制备金纳米颗粒。第一节柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒3.1.1试剂和仪器我们在实验中所需要的试剂和仪器主要有：柠檬酸钠（AuCl3·HCl·4H2OAR）：买自Alfa公司，纯度是99%；氯金酸（HAuCl4·3H2OAR）：买自Alfa公司；APTMS：3-氨丙基三甲氧基硅氧烷，买自上海西域公司；所用的水均为高纯水：电阻率为18.2M欧；紫外-可见分光光度计；透射电子显微镜（TEM）：待测样品滴在Formvar膜覆盖的250mesh铜网上，然后经自然干燥后成为待测物；恒温加热磁力搅拌器：购买于巩义市予华仪器有限责任公司；原子力显微镜（AFM）和电子天枰。3.1.2制备过程柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒我们主要依据1973年Frens提出来的方法，通过不断的实验去调整和改善，整个过程如下：首先要彻底清洗所有将要使用的玻璃容器，以避免容器不干净引起制备的金纳米颗粒的团聚和变质；这一步是至关重要的，我们目前主要是先用体积比7:3的98%的浓硫酸和30%的双氧水溶液浸泡清洗一个小时，然后用去离子水反复超声清洗，每次20分钟，最后在烘箱中进行干燥数个小时后方可使用。其次配制质量体积比为1%的氯金酸溶液和柠檬酸钠溶液；接着取100ml去离子水放进三口烧瓶中，在电磁搅拌器的油浴中进行加热，油浴温度设置在高于100℃的温度，一般选择120℃。加入一定量配制好的氯金酸溶液加热至沸腾，然后迅速加入一定量准备好的柠檬酸钠溶液，加热十五分钟。在加热三到五分钟之后，溶液就开始变色，从黄色变成酒红色；最后关闭电磁搅拌器，把烧瓶取出冷却到室温，把制备的金纳米溶液在4℃的温度下遮光保存。整个制备过程我们可以用图3.1进行表示：图3.1柠檬酸钠还原法实验过程从上面的操作过程来看，柠檬酸钠还原法还是非常的简单、易操作的。在整个反应过程中，反应原理如反应图3.2所示：图3.2柠檬酸钠还原法反应原理在整个反应过程中，柠檬酸钠起到了一个双重作用，柠檬酸钠既是还原剂，同时它也是稳定剂。首先柠檬酸根将氯金酸根AuCl4-还原成金原子（Au0），金原子首先吸附性质与其相似的氯金酸根AuCl4-，而带正电，但由于表面电位差较小，很不稳定，所以之间很容易聚集。随着氯金酸根浓度的不断减小，金团簇表面（因为吸附氯金酸根而带正电）开始吸附柠檬酸根（负电），这是因为静电吸引所导致的。随着柠檬酸根的不断增多，金表面电势为负，互相排斥，随着颗粒的逐步增大，颗粒之间的静电斥力也随之增大，直至产生稳定的金纳米颗粒。尽管与其他金属胶体相比，金纳米颗粒溶液的稳定性是很好的，但是当金纳米颗粒溶液被稀释或者遇到电解质以及温度的急剧变化或者长时间光照等都会引起金纳米颗粒的团聚和变性。为了提高金纳米颗粒的稳定性，我们可以在金纳米颗粒表面修饰其他分子，譬如学习相转移法，修饰硫醇就比较稳定。第二节对金纳米颗粒溶液的研究根据我们上面提到的实验过程我们通过改变柠檬酸钠和氯金酸之间的摩尔比，我们采用固定氯金酸的量，通过改变柠檬酸钠的量来改变二者之间的摩尔比，制备三种不同的金纳米颗粒溶液。第一种我们用1ml的氯金酸溶液和2.5ml的柠檬酸钠溶液，通过计算柠檬酸钠和氯金酸的摩尔比是3.5:1。第二种我们用1ml的氯金酸溶液和3.28ml的柠檬酸钠溶液，通过计算柠檬酸钠和氯金酸的摩尔比是4.6:1。第三种我们选用1ml的氯金酸溶液和1ml的柠檬酸钠溶液，通过计算柠檬酸钠和氯金酸的摩尔比是1.4:1。下面我们就对这三种不同的金纳米颗粒溶液就行研究。3.2.1对金纳米颗粒溶液的TEM图的研究我们对这三种金纳米颗粒溶液分别做了TEM图，下面的图3.3是对第一种溶液做的不同比例下的TEM图：ABC图3.3A从图3.3中我们可以看出我们所合成的金纳米颗粒形状还是比较规则的，通过测量我们可以测得金纳米颗粒的尺寸大约在20nm左右，在20nm比例下的图3.3A中可以看出金纳米颗粒分布还是比较分散的，没有团聚现象，而在图3.3B和图3.3C中我们发现所得到的金纳米颗粒好像有团聚现象，其实不是这样的，这是因为在制作TEM测量样本时，我们需要把样液沾在一个很小的铜网上，并且是干燥之后才会进行测量，干燥之后由于面积太小，就会在图中显示出类似于团聚的现象。接下来我们来研究不同摩尔比的柠檬酸钠和氯金酸制备的不同金纳米溶液的TEM图，柠檬酸钠和氯金酸的摩尔比分别是4.6:1，3.5:1和1.4:1。如图ABC图3.4A是摩尔比为4.6:1时的金纳米颗粒溶液;B是摩尔比为3.5:1时的金纳米颗粒溶液;C是摩尔比为1.4:1时的金纳米颗粒从该图中我们通过测量，可以很轻松地得到当柠檬酸钠和氯金酸摩尔比为4.6:1时，金纳米颗粒的直径大概为15nm左右，当它们二者之间的摩尔比为3.5：1时，金纳米颗粒的直径大概为20nm左右，当它们二者之间的摩尔比为1.4:1的时，金纳米颗粒的直径平均为33nm左右。从这些数据中我们可以很清楚的看到，随着柠檬酸钠和氯金酸的摩尔比的增加，金纳米颗粒的形状由稍显不规则的椭球形逐渐向各向同性的圆球形颗粒转变，形状越来越规则。并且随着柠檬酸钠和氯金酸的摩尔比的不断增加，金纳米颗粒的尺寸越来越小，这与我们之前在反应原理中提到的柠檬酸钠既是还原剂，同时又是稳定剂相符合，因为稳定剂越多，金纳米簇就会在更快的时间内吸附了更多的稳定剂而互相排斥，这个过程时间越短，颗粒的尺寸就会越小。同时不仅是尺寸越来越小，而且随着它们摩尔比的增加，金纳米颗粒的尺寸分布也越来越小，大小也趋于均一，单分散性越来越好，这些结论都与Frens的结论相一致。因此我们可以推断出，在利用柠檬酸钠作为还原剂制备金纳米颗粒的反应过程中，柠檬酸钠作为稳定剂，对于金纳米颗粒的尺寸均一性以及形状规则性上起到了非常重要的作用。从前面的TEM图中我们可以粗略的看到柠檬酸钠和氯金酸的摩尔比与金纳米颗粒尺寸的大小有着一定的关系，从之前的计算我们得知，当摩尔比为4.6:1时，尺寸约为15nm；当摩尔比为3.5:1时，尺寸约为20nm；当摩尔比为1.4：1时，尺寸约为33nm。经过我们进一步的实验和测量，当摩尔比为1.3:1时，尺寸大概在40nm。摩尔比为7:1时，尺寸大概在12nm。根据这些实验数据我们在Origin中进行拟合绘图，得到图3.5：图3.5摩尔比与纳米颗粒尺寸的拟合关系图从图3.5中我们可以看到金纳米颗粒尺寸与柠檬酸钠和氯金酸的摩尔比基本上成反比，摩尔比越高，柠檬酸钠越多，每个金纳米颗粒分到的柠檬酸钠就越多，尺寸就会越来越小，这跟Frens的结论是相一致的。同时我们还可以根据这条曲线的规律，有目的、有选择的选择合适量的柠檬酸钠去制备我们所想要制备的尺寸的金纳米颗粒，虽然有误差，但是不会太大，这样就会有的放矢，很大的节约了时间，提高了效率。3.2.2对金纳米颗粒溶液消光光谱的研究我们对三种不同柠檬酸钠/氯金酸摩尔比制备的金纳米颗粒溶液都用紫外-可见分光光度计进行测量了它们的消光光谱，方法是我们首先选择在比色皿中放入纯水进行测量，这个测量结果作为我们对其他三种溶液测量的基准，然后分别放入装有三种金纳米颗粒溶液的比色皿进行测量，测量结果通过Origin绘图，可以得到图3.6：图3.6三种不同摩尔比金纳米颗粒溶液的消光光谱为了方便比较我们这三条曲线的消光峰值，我们分别从这三条曲线的原始数据中截取消光光谱峰值附近的一段来进行对比，制作成表格3.1：表3.1三种金纳米溶液在消光峰附近的数据摩尔比4.6:1（15nm）摩尔比3.5:1（20nm）摩尔比1.4:1（33nm）波长（nm）消光量波长（nm）消光量波长（nm）消光量5160.3059705160.3093805260.3736205170.3069305170.3101605270.3744205180.3076705180.3107205280.3750405190.3081005190.3109305290.3753905200.3081905200.3108205300.3756405210.3080905210.3104705310.3755805220.3075305220.3097605320.3753905230.3067305230.3086605330.3750105240.3056505240.3073405340.3744205250.3041605250.3056105350.373730从表格3.1中我们可以很清楚地看到，在金纳米颗粒尺寸为15nm左右时，溶液的消光峰波长为520nm，最大消光量为0.308190；在金纳米颗粒尺寸为20nm左右时，溶液的消光峰波长为519nm，最大消光量为0.310930；在金纳米颗粒尺寸为33nm左右时，溶液的消光峰波长为530nm，最大消光量为0.375640。根据Frens的结论应该是随着金纳米颗粒尺寸的增大，消光峰会逐渐地红移，而在我们的实验结果中，在金纳米颗粒尺寸为15nm和20nm的时候，从表格的数据看出现了1nm的蓝移，根据我们的分析这个结果可能是由于当时实验环境，以及20nm的金纳米颗粒溶液的尺寸分布不均匀性引起的，还有另外一种原因就是因为我们实验仪器的精度引起的，因为我们所用的紫外分光光度计是以一个纳米为单位进行扫描的，如果这两个尺寸的消光峰都在519nm和520nm之间，相差不多，就可能出现我们表格里所显示的实验结果。经过我们的讨论分析，这次实验结果出现蓝移的原因大多是因为金纳米颗粒溶液中的颗粒尺寸分布不均匀引起的，存在很大的偶然性，因为我们在之后的多次测量中发现，20nm的金纳米颗粒溶液的消光峰大约在523nm左右，是相对于15nm的金纳米颗粒溶液发生了红移。从这一点上更进一步的印证了我们之前结论就是柠檬酸钠还原法制备的金纳米颗粒尺寸越小，单分散性就越好，单次的实验结果就越可靠。但是从总体上我们还是可以看出，随着金纳米颗粒尺寸的增大，消光峰产生红移的趋势是显而易见的，而且消光强度也在逐渐地变大。第三节金纳米颗粒在玻璃片上的组装为了更好的对金纳米颗粒进行研究，以便把金纳米颗粒的这些独特性质应用到很多实际的领域中，把金纳米颗粒组装到玻璃片上就显得尤为重要。在组装之前，我们还是要把要组装的玻璃片以及要用到的所有玻璃仪器进行一次全面的清洗，以保证上面没有任何杂质，这一步非常重要，因为一旦有杂质，金纳米颗粒就会发生团聚，对其的组装就会以失败而告终。我们依然选择用98%的浓硫酸和30%的双氧水，二者按照体积比为7:3的比例进行混合之后对所用的所有玻璃仪器和玻璃片进行清洗一个小时，然后用去离子水进行反复的超声清洗，每次二十分钟，然后放入防尘装置内在烘箱中干燥若干小时后方可使用。整个组装过程如下：首先将清洗后的玻璃基片浸泡在体积比为8%-10%的APTMS（或者APTES,两者的区别只是碳链的长度不同）和乙醇的混合溶液中，进行自组装十五分钟，这样可以实现对玻璃基片的硅烷化处理；其次我们用无水乙醇超声清洗五次，之后将玻璃片放在120℃的烘箱中干燥三个小时，这一步非常的重要，因为只有足够长时间的干燥才可以避免玻璃表面形成多层硅烷化物，引起金纳米颗粒的团聚；最后将硅烷化后的玻璃基片放置在我们之前制备的金纳米颗粒溶液中，进行自组装二十四小时，这样就可以实现金纳米颗粒在玻璃基片上的组装。这个时间是经过反复的实验才得到的结果，因为我们发现在自组装二十四小时之后玻璃片的消光峰不再变化，而不到二十四小时的时候它会一直变化，因此金纳米颗粒组装二十四小时可以达到稳定状态，实现组装完毕。整个组装过程我们可以用图3.7进行简单表示:图3.7金纳米颗粒在玻璃基片上的自组装过程图第四节对组装在玻璃片上的金纳米颗粒的研究3.4.1对同一尺寸、不同浓度的金纳米颗粒进行组装的研究对于同一尺寸、不同浓度的金纳米颗粒组装的研究，我们选择柠檬酸钠和氯金酸摩尔比为3.5:1时制备的20nm的金纳米颗粒溶液为研究对象。我们把实验制备的原溶液定义为浓度为1的原液，取3ml的原液放在离心管里作为浓度为1的金纳米颗粒溶液；接着我们取三次2ml的原液，分别放在三个离心管里进行离心十分钟，转速超过1000转/min，然后在每个离心管里去掉1ml的水，再混合得到3ml的浓度为2的金纳米颗粒溶液；取1.5ml的原液再加入1.5ml的去离子水，混合均匀后作为浓度为0.5的金纳米颗粒溶液。我们把硅烷化后并且干燥处理后的玻璃基片，分别放入三种不同浓度的金纳米颗粒溶液中，在遮光的环境下进行自组装二十四小时，我们会发现组装后的玻璃片会有些许的红色，这就说明金纳米颗粒已经在玻璃片上完成了组装。如果玻璃片上颜色发蓝，则说明金纳米颗粒已经发生团聚，自组装失败，需要重新操作进行组装。我们通过紫外-可见分光光度计来测量不同浓度组装后的金纳米颗粒的消光光谱，首先在比色皿中装入去离子水进行测量，测量结果作为之后测量的基准，然后把三种不同浓度的金纳米颗粒组装后的玻璃片放入装有去离子水的比色皿中进行测量，测量结果用Origin绘制图形如图3.8：图3.8为对20nm金纳米颗粒不同浓度溶液进行组装后的消光光谱图，三种浓度分别是Low为0.5；Middle为1；High为2从图3.8中我们可以很清楚的看到随着金纳米颗粒溶液浓度的不断增加，消光强度会不断地增大，更加详细的实验结果我们可以从原始数据中得到，当浓度为0.5时，峰值波长为524nm，最大消光强度是0.118470；当浓度为1时，峰值波长为526nm，最大消光强度为0.137260；当浓度为2时，峰值波长为528nm，最大消光强度为0.154620。从这些数据中我们发现，随着金纳米颗粒溶液浓度的不断增加，不仅是最大消光强度随之增大，而且组装后的金纳米颗粒的消光光谱还发生了微小的红移。消光强度的增加我们比较好理解就是因为组装后的金纳米颗粒紧密有序的排列，颗粒间的相互作用就会引起消光强度的增加。对于随着金纳米颗粒溶液浓度的不断增加，消光光谱发生红移，我们知道被吸附的金纳米颗粒之间由于等离子耦合会导致吸收峰的红移，这其中金纳米颗粒的团聚就是一个最直接的例子，当金纳米颗粒发生团聚后我们会发现在600nm到700nm之间会出现一个很强的消光峰。根据研究表明金纳米颗粒之间的相互作用对消光峰红移的影响是随着金纳米颗粒之间的相互距离的拉大成指数衰减，所以随着浓度的增加，组装在玻璃基片上的金纳米颗粒之间的距离就会越来越小，这样就会引起更多的红移，这跟我们得到的结论是相符合的。从上面的数据我们知道最大消光强度随着浓度的不断增加而增大，但是这个趋势并不是一直延续下去的，随着我们实验的不断继续，我们发现，当浓度增大到一定值之后，消光光谱的最大消光强度就会达到一种饱和状态，不会再继续增大。3.4.2对不同尺寸的金纳米颗粒进行组装的研究对于不同尺寸的金纳米颗粒在玻璃基底上进行组装的研究，我们还是选择柠檬酸钠与氯金酸摩尔比为4.6:1,3.5:1以及1.4:1所制备的尺寸分别为15nm，20nm和33nm的金纳米颗粒溶液为研究对象。同样的方法我们依然分别取3ml这三种金纳米颗粒溶液放在三个离心管中，把硅烷化并且已经干燥处理后的玻璃基片分别放在装有三种金纳米颗粒溶液的离心管中，在遮光环境下自组装二十四个小时。我们用紫外分光光度计对组装有不同尺寸金纳米颗粒的三个玻璃片进行消光光谱测量。方法还是一样，以去离子水的测量结果为基准，然后分别测三个组装后的玻璃片的消光光谱。测量结果用Origin绘制图形，如图3.9：图3.9不同尺寸金纳米颗粒组装后的消光光谱图，三种尺寸分别为15nm，20nm，33nm具体的信息我们可以从原始数据中得到，当金纳米颗粒尺寸为15nm时，消光光谱峰值波长为529nm，最大消光强度为0.145910；当金纳米颗粒尺寸为20nm时，消光光谱峰值波长为526m，最大消光强度为0.137260；当金纳米颗粒尺寸为33nm时，消光光谱峰值波长为529nm，最大消光强度为0.408140。从这些个原始数据中我们依据发现，在15nm到20nm的转变过程中，消光光谱发生了蓝移，蓝移量为3nm，而且最大消光强度也降低了0.008650，这与我们的理论结果是不相一致的，按照Frens方法的结论，应该是随着金纳米颗粒尺寸的不断增大，组装后的消光光谱会发生红移，最大消光强度也会逐渐增大。这一点的原因我们现在还只能用因为金纳米颗粒尺寸的单分散性不是非常好，而且我们通过紫外分光光度计测量玻璃片上的金纳米颗粒的消光光谱也只能测得它的局部，而不是整体，这就会引起误差的存在。才会造成目前的这种结果。这个仍需要我们再继续进行更多次的验证。我们把这三种不同尺寸在玻璃基底上组装后的金纳米颗粒的消光光谱与之间三种金纳米颗粒溶液的消光光谱进行比较可以看出，15nm和20nm的金纳米颗粒都发生了红移，这是与理论相符合的，而33nm的金纳米颗粒却发生了蓝移，蓝移量为1nm。我们用比33nm还大尺寸的金纳米颗粒做对比，结果还是会发生蓝移。我们认为这种不合情理的波长移动可能是由另外的因素（除了颗粒间的耦合）的相互作用引起的。这些因素可以影响组装后的单层波的光学特性。其中一种可能是因为玻璃基底的存在，使得纳米颗粒周围环境折射率各向异性的增加；另外金纳米颗粒上吸附的分子也有可能改变金纳米颗粒的电子特性，从而影响消光光谱。如果电子转移是从金纳米颗粒到吸附物上，这样会引起红移，这是我们所期望看到的，但是如果电子转移是从吸附物质到金纳米颗粒上，那将会产生蓝移。相似的，组装在胺基上的金纳米颗粒之间的电子相互作用同样可以影响消光光谱的移动；最后就是入射光的偏振作用也会对消光光谱的移动产生相应的影响。这些因素都是我们以后研究的方向。3.4.3金纳米颗粒组装后在不同溶液中的研究对金纳米颗粒组装后在不同溶液中消光光谱的研究，我们首先研究一种尺寸的金纳米颗粒，我们选择柠檬酸钠和氯金酸摩尔比为3.5:1的尺寸为20nm的金纳米颗粒溶液为研究对象，还是以在装有去离子水的比色皿放入一片空的玻璃基底的测量结果为基准，把组装好金纳米颗粒的玻璃基底分别在去离子水、乙醇、甲苯以及乙醇和甲苯1:1体积比混合的溶液中用紫外分光光度计进行测量金纳米颗粒的消光光谱。测量结果用Origin绘图，如图3.10所示：图3.1020nm的金纳米颗粒组装后在四中不同溶液中测得的吸收光谱1是去离子水，2是乙醇，