饲料中庆大霉素的测定 液相色谱-串联质谱法 编制说明

1 1 1 5 7 7 7 7 9 11 12 14 15 15 16 17 172.3.1检出限（LOD）与定量限（ 17 17 18 19 31三、试验验证的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济 31四、与国内、国际、国外同类标准技术内容的对比情况，或者与测试的国机的有关数据对比情况 32 32 32 32 32 331根据《国家标准化管理委员会关于下达2021年第四批推荐性国家标准计按无水物计算，每1mg的效价不得少于590庆大449.5（C1a463.6（C2+C2a）。是由小单孢子属产生的多组分氨基糖苷类疗效和毒理也存在差异：C1组份毒理副作用较小，也不容易产生抗药性，在23少网络上报道加入饲料中用于预防和治疗疾病；根据相关资料，一般庆大霉在人类正常生理pH值时，庆大霉素中游离的正电荷氨基基团和肾脏中肾小管上皮细胞或毛细胞表面的特异性受体结合→自由氨基基团和结合的受体合成，导致细胞代谢障碍，结构破坏。庆大农业部出台了一系列公告禁止抗生素在饲料中的使用，并于2019年发布1944号公告，规定自2020年起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添然而庆大霉素在饲料中非法添加和外源污染问题时有发生，对饲料工业发展、用的兽药之一，但由于其毒性，我国在GB31650-2019《食品安全国家标准食目前关于庆大霉素检测标准则有“GB/T21329-2007动物源性食品中庆大留检测高效液相色谱法”以及“GBT21323-2007动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定高效液相色谱-质谱/质谱法”等，不少学者也建立不同的庆大霉素谱分析方法无法准确测定庆大霉素各组分的含量。因此液相色谱-串联质谱法如DavidN.Heller等人在2005年开发并验证了几种牛组织中庆大霉素浓度的5析方法，方法检出限为10μg/kg，本标准旨在建立一种能同时提取并净化饲料中庆大霉素的前处理方法及表1标准主要起草人员和任务分工任务分工项目主持人，负责项目的全面工作检测方法研究，标准文本和编制说明编写和完善、方法验证实施方案制定，标准文本和编制说明编写和完善、征求意见样品检测、数据收集分析样品采集、数据收集分析标准文本和编制说明编写和完善、征求意见样品采集、标准文本和编制说明编写和完善标准文本和编制说明编写和完善6容和技术路线草案，确定标准修订的主要内容、技术路线（见图2）、LC-MS/MS方法研究、方法比较形成标准征求意见稿和编制说明形成标准征求意见稿和编制说明标准的预审、终审和报批1.3.3样品收集、方法学研究和实际样1.3.4编写编制说明和征求意见稿、定向征求意见和标准验证7二、标准编制原则和主要技术内容确定的依据（1）遵循国家颁布的相关法律法规；（2）有关国家或行业标准；（3）国内外有关标准和参考文献；（4）标准编制小组调研和实测的样品检测数据。2.2主要技术内容确定的依据2.2.1质谱条件的选择和优化89母离子子离子去簇电压（V）碰撞能量（eV）庆大霉素C1a450.2322.1*20庆大霉素C2+C2a464.2322.1*2025庆大霉素C1478.2322.1*25注：*为定量离子。2.2.2色谱条件的选择和优化过对出峰时间、分离效果、峰形和灵敏度等因素分别考察了0.1%甲酸溶液图4不同流动相的庆大霉素C1MRM色谱图），），05582.2.3不同浓度七氟丁酸甲醋酸溶液的比较0.85min、0.81min、0.81min；0.82min、0.81min、0.81min；分离度较差。分进行测定的方法[13]；也有利用2%三氯乙酸溶液对庆大霉素提取，用NaOH则有利用3%三氯乙酸溶液提取，SCX柱净化后使用LC-MS进行测定；利用5%三氯乙酸进行提取，用HLB柱净化后利用LC-MS进行测定。庆大霉素常较，用氢氧化钠和乙腈提取庆大霉素样品时需要调pH到酸取庆大霉素的常用提取液，根据样品成分复杂情况，常用的浓度一般为2%~洗固相萃取柱，最后PCX、MCX用3mL10%氨水甲醇溶液洗脱，加入3mL从图8可以看出，经过PCX固相萃取柱净化后，饲料中2.2.6洗脱试剂的选择和优化本试验研究了不同比例的氨水甲醇对庆大霉素的洗脱效果，按照上述操作，洗脱时用不同比例的氨水甲醇进行洗脱，最终上机检测，结2.2.7洗脱溶液用量的选择和优化洗脱溶剂用量的选择是一个关键参数，因此，试验评估了1.0mL~5.02.2.8标准储备溶液稳定性考察2.2.9样品提取和净化方法脱，收集洗脱液于10mL塑料离心管中，于40℃下用mL1%七氟丁酸甲酸溶液复溶，充分涡旋，用0.22µm滤膜过滤，滤液装塑料2.3.1检出限（LOD）与定量限（LOQ）的确定在空白基质中添加一定量的庆大霉素标准品，样品经前处理后，用大霉素的浓度即为检出限，样品中庆大霉素的峰的信噪比大于等于10时，添加庆大霉素的浓度即为定量限。该庆大霉素分析方法对饲料的检测限0.05共46.8%）各组分所占的比例，所以庆大霉素组分C1、C（90∶10，v/v）溶液配制的标准溶液对比，结果见图11。庆大霉素表现为基由低到高浓度的基质标准溶液，其质量浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、50量离子色谱峰面积与基质添加标准溶液浓度作标准曲线。结果见表5。基质添表5基质添加标准曲线的线性方程和相关系数2.3.4准确度和精密度考察表6猪配合饲料中庆大霉素的添加回收率、批内和批间精密度(mg/kg)测定批次回收率(%)平均回(%)批内RSD(%)批间RSD(%)Ⅰ83.481.282.00.942.18Ⅱ82.377.883.981.577.480.62.87Ⅲ82.682.384.283.978.382.22.350.2Ⅰ80.582.292.980.680.683.35.364.75Ⅱ77.283.079.892.483.55.82Ⅲ77.878.883.885.979.581.23.4925Ⅰ84.384.885.985.584.385.00.702.23Ⅱ84.085.883.583.583.90.94Ⅲ86.389.885.590.83.20Ⅰ79.589.880.389.379.083.65.464.60Ⅱ79.486.779.282.979.281.53.31Ⅲ83.291.077.278.083.382.55.50表7猪浓缩饲料中庆大霉素的添加回收率、批内和批间精密度(mg/kg)测定批次回收率(%)平均回(%)批内RSD(%)Ⅰ80.880.680.292.482.283.25.15Ⅱ78.379.683.982.477.980.42.64Ⅲ67.981.385.977.883.779.37.040.2Ⅰ80.967.582.080.885.979.47.00Ⅱ82.285.485.267.980.47.22Ⅲ92.992.962.982.867.679.8Ⅰ79.977.378.080.482.679.62.08Ⅱ81.878.083.482.379.9Ⅲ82.883.378.880.082.681.5Ⅰ82.978.081.578.680.82.41Ⅱ82.877.879.577.882.62.47Ⅲ80.679.379.383.880.980.8表8猪预混料中庆大霉素的添加回收率、批内和批间精密度(mg/kg)测定批次回收率(%)平均回(%)批内RSD(%)批间RSD(%)Ⅰ78.085.379.178.880.32.915.55Ⅱ94.087.289.590.680.088.35.23Ⅲ93.888.387.983.090.488.73.960.2Ⅰ79.985.862.878.99.267.67Ⅱ83.682.983.080.382.0Ⅲ92.392.280.383.867.483.2500Ⅰ67.179.862.867.385.372.59.618.72Ⅱ82.881.385.392.585.44.31Ⅲ83.892.579.983.984.084.84.645000Ⅰ79.692.883.681.267.981.08.956.20ⅡⅢ表9鸡配合饲料中庆大霉素的添加回收率、批内和批间精密度(mg/kg)测定批次回收率(%)平均回(%)批内RSD(%)批间RSD(%)Ⅰ78.890.183.885.684.34.10Ⅱ85.294.991.877.991.488.26.77Ⅲ82.687.282.978.283.2Ⅰ92.880.086.297.184.888.26.796.79Ⅱ86.884.977.877.15.42Ⅲ85.887.387.081.688.87.86Ⅰ96.886.096.097.281.64Ⅱ77.080.378.083.580.22.70Ⅲ77.878.284.081.080.82.79Ⅰ96.398.299.884.385.092.77.488.62Ⅱ80.382.386.281.583.382.72.24Ⅲ80.578.877.867.177.476.35.28表10鸡预混料中庆大霉素的添加回收率、批内和批间精密度(mg/kg)测定批次回收率(%)平均回(%)批内RSD(%)批间RSD(%)Ⅰ77.892.882.085.684.35.556.49Ⅱ92.980.692.680.867.983.0Ⅲ81.080.879.879.482.680.70.2Ⅰ80.482.385.481.892.984.65.025.78Ⅱ67.892.285.280.981.28.90Ⅲ85.381.279.483.982.882.52.31Ⅰ81.887.682.678.981.30Ⅱ82.480.382.281.281.40.86Ⅲ84.381.383.380.882.52000Ⅰ82.983.481.492.279.083.85.01Ⅱ85.982.2Ⅲ85.862.362.592.277.6表11鱼配合饲料中庆大霉素的添加回收率、批内和批间精密度(mg/kg)测定批次回收率(%)平均回(%)批内RSD(%)批间RSD(%)Ⅰ78.082.079.21Ⅱ83.480.979.486.980.582.23.02Ⅲ80.283.883.278.078.980.82.600.2Ⅰ80.281.579.097.683.884.47.596.50Ⅱ82.880.478.079.677.379.62.17Ⅲ82.592.382.997.183.587.76.6820Ⅰ77.180.878.877.078.8Ⅱ81.879.481.380.579.880.6Ⅲ79.980.082.585.282.82.21200Ⅰ81.481.478.378.581.580.25.53Ⅱ83.898.877.583.479.384.68.42Ⅲ82.491.686.082.982.085.04.01表12鱼浓缩饲料中庆大霉素的添加回收率、批内和批间精密度(mg/kg)测定批次回收率(%)平均回(%)批内RSD(%)批间RSD(%)Ⅰ76.0271.0572.9774.0973.1673.462.465.67Ⅱ83.3780.6879.3686.9180.4882.163.69Ⅲ80.2074.7174.2175.9678.8876.793.430.2Ⅰ69.2172.5376.9667.6274.7372.215.324.98Ⅱ71.8269.4178.0273.5575.3073.624.46Ⅲ82.4866.3371.8967.1374.4682.064.81Ⅰ75.0569.7978.8477.0473.975.866.54Ⅱ81.7673.3881.3080.5079.8279.354.31Ⅲ73.9269.0282.5268.2371.7382.683.19Ⅰ81.3981.4076.3478.4781.5479.832.935.46Ⅱ74.6378.6475.4974.3879.2776.483.01Ⅲ71.4172.6068.9971.9471.0371.19表13精料补充料中庆大霉素添加回收率、批内和批间精密度(mg/kg)测定批次回收率(%)平均回(%)批内RSD(%)批间RSD(%)Ⅰ83.280.467.879.292.280.68.745.26Ⅱ78.577.985.478.077.279.43.38Ⅲ79.182.084.979.877.980.72.750.2Ⅰ79.885.267.867.681.48Ⅱ81.582.582.486.085.983.7Ⅲ83.291.979.491.277.884.76.57Ⅰ81.579.985.285.892.885.04.983.74Ⅱ80.878.083.585.482.582.02.81Ⅲ78.180.885.585.384.082.83.19200Ⅰ81.580.280.967.965.58Ⅱ79.279.377.981.079.279.3Ⅲ91.380.381.877.678.381.95.53图13猪配合饲料添加样品特征离子色谱图图14猪浓缩饲料空白样品特征离子色谱图图15猪浓缩饲料添加样品特征离子色谱图图16猪猪预混料空白样品特征离子色谱图图17猪猪预混料添加样品特征离子色谱图图18鸡配合饲料空白样品特征离子色谱图图19鸡配合饲料添加样品特征离子色谱图图20鸡预混料空白样品特征离子色谱图图21鸡预混料添加样品特征离子色谱图图22鱼配合饲料空白样品特征离子色谱图图23鱼配合饲料肪添加样品特征离子色谱图图24鱼浓缩饲料空白样品特征离子色谱图图25鱼浓缩饲料添加样品特征离子色谱图图26精料补充料空白样品特征离子色谱图图27精料补充料添加样品特征离子色谱图条件下获得的三次独立结果的相对偏差值均不超过20%，符合本标准研究需以上结果表明，本标准建立的饲料中庆大霉素的超高效液相色谱-串联质还是庆大霉素总含量，该方法都能够满足饲三、试验验证的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果外样品、样机的有关数据对比情况五、采标情况，以及是否合规引用或采用国际国外标准七、重大分歧意见的处理经过和依据八、涉及专利的有关说明（1）首先应在实施前保证文本的充足供应，让每个使用者都能及时得到（2）发布后、实施前应将信息在媒体上广为宣传，建议全国饲料工业标[1]Gentamicin.(WHOFoodAdditivesSeries41).[2]JaoRL,JacksonGG.GentamicinSulfate,NewAntibioticagainstGram-NegativeBacilli[J].JAMA,1964,189:817–822.[3]McKellarQ1Antimicrobialresistance:Aveterinaryperspective[J].BMJ,1998,317:610–611.[4]RosenkrantzBE,GrecoJR,HoogerheideJG,etal.GentamicinSulfate[J].AnalyticalProfilesofDrugSubstances,1981,9:295–340.[5]谢桂芬.庆大霉素在猪病防治中的使用[J].现代农业科技,2008(19):302-304.XieGF.Applicationofgentamicininpreventionandtreatmentofpigdisease[J].ModernAgriculturalScienceandTechnology,2008(19)：302-304.(inChinese)[6]罗文柳.庆大霉素在兽医临床中的应用[J].兽医导刊,2020(13):106.LuoWL.Applicationofgentamicininveterinaryclinic[J].VeterinaryGuide,2020(13):106.(inChinese)[7]田强兵,巨欢,任惠丽,等.高效液相色谱-质谱法测定鱼肉中庆大霉素主要组分C1、C1a、C2[J].理化检验(化学分册),2019,55(01):97-100.TianQB,JuH,RenHL,etal.DeterminationofgentamicincomponentsC1,C1aandC2infishmeatbyhighperformanceliquidchromatography-massspectrometry[J].PhysicalandChemicalExamination(ChemistryBranch),2019,55(01):97-100.(inChinese)[8]PourfeiziHH,SalehP,AbbasalizadehS,etal.Gentamicin-mediatedototoxicityandnephrotoxicity:Aclinicaltrialstudy[J].NigerianMedicalJournal,2016,57(6):347–352.[9]李福刚,袁玉国.致病性大肠杆菌对庆大霉素的耐药性研究[J].江西畜牧兽医杂志,2002(01)：6-8.LiFG,YuanYG.StudyonresistanceofpathogenicEscherichiacolitogentamicin[J].JiangxiJournalofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,2002(01):6-8.(inChinese)[10]王秀英.禽大肠杆菌对庆大霉素的耐药性诱导试验[J].中国畜禽种业,2019,15(09):191.WangXY.InductionofresistancetogentamicininavianEscherichiacoli[J].ChineseJournalofLivestockandPoultryBreeding,2019,15(09):191.(inChinese)[11]中华人民共和国农业部公告第1519号,禁止在饲料和动物饮水中使用的物质[EB/OL].2010.中华人民共和国农业部公告第1519号()AnnouncementNo.1519oftheMinistryofAgricultureofthePeople'sRepublicofChina,Substancesprohibitedinfeedandanimaldrinkingwater[EB/OL].2010.AnnouncementNo.1519oftheMinistryofAgricultureofthePeople'sRepublicofChina().(inChinese)[12]中华人民共和国农业农村部公告第194号,发布药物饲料添加剂退出计划和相关管理政策[EB/OL].2019.中华人民共和国农业农村部公告第194号()MinistryofAgricultureandRuralAffairsofthePeople'sRepublicofChinaAnnouncementNo.194,Releaseofdrugfeedadditiveswithdrawalplanandrelatedmanagementpolicies[EB/OL].2019.AnnouncementNo.194oftheMinistryofAgricultureandRuralAffairsofthePeople'sRepublicofChina().(inChinese)[13]农业农村部畜牧兽医局，农业农村部畜牧兽医局关于2020年全国饲料质量安全监督抽查结果的通报[EB/OL].中华人民共和国农业农村部公报,2021(02)：122-123./nybgb/2021/202102/202110/t20211008_6378916.htmMinistryofAgricultureandRuralAffairsAnimalHusbandryandVeterinaryBureau,MinistryofAgricultureandRuralAffairsAnimalHusbandryandVeterinaryBureauon2020nationalfeedqualityandsafetysupervisionresultsNotice[EB/OL].TheagriculturalNongCunBucommuniqueofthePeople'sRepublicofChina,2021(02)：122-123./nybgb/2021/202102/202110/t20211008_6378916.htm.(inChinese)[14]TangSP,CanfarottaF,Smolinska-KempistyK,etal.Apseudo-ELISAbasedonmolecularlyimprintednanoparticlesfordetectionofgentamicininrealsamples[J].AnalyticalMethods,2017,9(19)：2853-285[15]XiaY,SuR,HuangR,etal.Designofelutionstrategyforsimultaneousdetectionofchloramphenicolandgentamicinincomplexsamplesusingsurfaceplasmonresonance[J].BiosensorsandBioelectronics,2017,92：266–272.[16]WuSM,YanCX,FanXH,etal.Developmentofenzyme-linkedimmunosorbentassayandcolloidalgold-basedimmunochromatographicassayfortherapiddetectionofgentamicininchickenmuscleandmilk[J].ChineseJournalofAnalyticalChemistry,2022,50(10).[17]RadhakumaryC,SreenivasanK.Gentamicininducedformationofgoldnanoparticlesasanassayprotocolforitsdetection[J].ColloidsandSurfacesA:PhysicochemicalandEngineeringAspects,2014,443:326–330.[18]LiC,ZhangY,EreminSA,etal.Detectionofkanamycinandgentamicinresiduesinanimal-derivedfoodusingIgYantibodybasedic-ELISAandFPIA[J].FoodChemistry,2017,277：48–54.[19]GukowskyJC,TanC,HanZ,etal.Cysteamine-ModifiedGoldNanoparticlesasaColorimetricSensorfortheRapidDetectionofGentamicin[J].JournalofFoodScience,2018,83(6)：1631–1638.[20]AdamsE,RoelantsW,DePaepeR,etal.Analysisofgentamicinbyliquidchromatographywithpulsedelectrochemicaldetection[J].JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis,1999,18(4–5):689–698.[21]MahonWA,EzerJ,WilsonTW.RadioimmunoassayforMeasurementofGentamicininBlood[J].AntimicrobialAgentsandChemotherapy,1973,3(5):585–589.[22]HellerDN,PegginsJO,NochettoCB,etal.LC/MS/MSmeasurementofgentamicininbovineplasma,urine,milk,andbiopsysamplestakenfromkidneysofstandinganimals[J].JournalofChromatographyB,2005,821(1):22–30.[23]刘雪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