《环境微生物学实验》

环境微生物学实验环境科学实验教学示范中心本课程是环境科学、农业资源与环境等专业开设的一门独立的专业根底课实验,其目的是着重训练学习掌握微生物学最根本的操作技艺，如显微镜的运用方法，微生物的根本形状察看，细菌染色技术，土壤、水体、空气中微生物的检测等。了解微生物的根本知识，经过察看详细资料和实验结果以加深了解和稳定课堂讲授的某些环境微生物学实际；同时，经过实验，培育学生察看、思索、分析问题和处理问题的才干。本课件的内容主要包括：荧光原位杂交法检测活性污泥中的硝化细菌、微生物的接种技术、细菌染色及微生物察看，土壤、空气微生物检测、水体中大肠菌群细菌的检测等。<环境微生物学实验>多媒体课件简介实验一

细菌染色法及微生物的察看用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培育基pH值下降时，细菌所带正电荷添加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料．如伊红美蓝、伊红天青等。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形状的方法难于区分细菌细胞的构造。革兰氏染色法法可将一切的细菌区分为革兰氏阳性菌(G－)和革兰氏阴性菌(G＋)两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G－菌和G＋菌，是由这两类菌的细胞壁构造和成分的不同所决议的。G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，添加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G＋菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处置后反而使肽聚糖层的孔径减少，通透性降低，因此细菌仍保管初染时的颜色。一、实验目的和内容目的：稳定无菌操作技求，掌握细菌及其构造的染色技术。内容：1、学习细菌单染色操作技术。2、学习革兰氏染色技术。3、学习细菌的荚膜、芽孢及鞭毛染色方法。二、实验资料和器具1、单染色法：〔1〕大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的斜面菌种。〔2〕吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、无菌水〔3〕显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。2、革兰氏染色：〔1〕黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌〔E.coli〕菌液，待测菌菌液l～2种；〔2〕

革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸复红液等)、〔3〕

香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。3、荚膜染色：(l)在阿须贝(Ashby)无氮培育基上培育3—5天的团褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)或者培育2—3天的硅酸盐细菌(Bacillusmucilaginosussubspsilicus)(2)李夫森氏染色液、硼酸钠美兰染色液、石炭酸复红染色液、黑色液。(3)载玻片、接种环、洗瓶。(4)显微镜。4、鞭毛染色：(1)在牛内膏蛋白胨斜面上培育19—24小时的假单孢菌(Pseudomonas.sp)，此培育体在取用前经过每日移植—代，延续移植5～7代。(2)新配制的费氏及康氏鞭毛染色液A和B。(3)无菌水、无菌空试管、凹玻片。盖玻片、干净载玻片、接种环、洗瓶。(4)显微镜．5、芽孢染色：(1)在牛肉膏蛋白胨斜面上培育24～36小时的枯草杆菌或者苏云金杆菌。(2)载玻片、接种环、酒精灯、洗瓶、镊子。(3)显微镜。(4)香柏油、二甲苯、擦镜纸．(5)孔雀绿染色液、蕃红染色液。三、操作步骤

一、单染色法〔1〕涂片在干净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水〔图4－10a〕，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2〔图4－10b〕。〔2〕枯燥将涂片于室温中自然枯燥。〔3〕固定手执载片—端，使涂菌的一面向上，将载片经过微火2～3次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否那么细菌形状毁坏(图4—10c)。〔4〕染色将涂片置于程度位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min(图4—10d)。〔5〕水洗倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止(图4—10e)。〔6〕枯燥自然晾干或用吸水纸悄然地吸干，留意不要擦掉菌体(图4—10f)。〔7〕待标本完全枯燥后，先用低倍镜和高倍镜察看，将典型部位移至视野中央，再用油镜察看。图4－10单染色方法〔二〕革兰氏染色法

1、制片〔1〕涂菌用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在干净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。〔2〕枯燥于空气中自然枯燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速枯燥(温度不宜过高)。〔3〕固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片面向上，经过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。2、染色〔1〕初染：于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。〔2〕滴加卢戈氏碘液，1min后水洗：〔3〕滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min)。〔4〕复染滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。〔5〕用滤纸吸干，油镜镜检。3、结果革兰氏阳性菌染成篮紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。4、检测未知菌用以上方法对未知面进展革兰氏染色，并绘图、记录染色结果。1．石炭酸复红染色(1)取培育了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然枯燥(荚膜是多糖类物质，不可用火焰烘干)。(2)滴入1～2滴95％乙醇固定(不可加热固定)。(3)加石炭酸复红染液染色1～2min，水洗，自然枯燥。(4)在载玻片一端加一滴墨汁，另取一块边缘光滑的载玻片与墨汁接触，在以匀速推向另一端，涂成均匀的一薄层，自然枯燥。(5)枯燥后用油镜察看。菌体红色，荚膜无色，背景黑色。〔三〕荚膜染色法2．背景染色(1)先加1滴墨水于干净的玻片上，并挑少量褐球固氮菌与之充分混合均匀。(2)放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸收多余的菌液。(3)枯燥后用油镜察看。背景灰色，菌体较暗．在其周围呈现一亮堂的透明圈即荚膜。3．李夫森氏－硼酸钠美兰染色〔1〕取在阿须贝氏无氮培育基上培育3天的硅酸盐细菌少许，制成枯燥涂片(不要加热固定)。〔2〕加李夫森氏染色液染色l0min，倾之染液(勿用水洗)。〔3〕加硼酸钠美兰染色液染色5min，水洗，晾干。〔4〕油镜视察可见荚膜被染成红色，菌体处成蓝色。〔四〕鞭毛染色法

1．方法一：〔1〕用接种环由培育18～20h的斜面上取假单胞菌菌体少许，用菌滴制片法检查细菌的运动性。假设菌体的运动性很强，那么可作鞭毛染色。〔2〕用3～4mL无菌水，将培育体洗下，移入另一无菌试管中，适温培育10min，再检查运动性。〔3〕用无菌吸管由悬液上部取一小滴，置于一清洁载玻片的一端，将玻片倾斜。使菌液由一端流向另外一端。于是在玻片上做成2～3条菌液带。待水膜自然枯燥〔切勿用火焰烘〕。〔4〕用刚刚过滤的鞭毛染色液A染色5min(不要加热)。〔5〕倾去A液，加鞭毛染色液B染色10min。用蒸馏水悄然冲洗，晾干。〔6〕用齐氏石炭酸复红染色2～3min。悄然冲洗，晾干(不能用吸水纸吸干)。〔7〕先用低倍镜，再用高倍镜，最后用油镜检查。2．方法二：〔1〕制涂片：先加少量无菌蒸馏水于凹载玻片的凹窝中．再从培育10h左右的斜面菌苔上取菌一环，轻放在凹窝水面上(不要搅动)，放30度温箱静置5～10min．取出，从凹窝水面上悄然取菌液一环，轻放在干净的载玻片上(不要涂抹)，放回温箱，让其自然枯燥(不要加热固定)。〔2〕染色：在自然枯燥的涂片上，滴加含石炭酸的鞭毛染色液一滴，染色5min，用水悄然冲洗，让其自然枯燥。〔3〕镜检：用油镜察看。〔五〕芽孢染色法

1．方法一：(1)取37℃培育18～24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并枯燥，固定。(2)于载片上滴人3～5滴5％孔雀绿水溶液。(3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开场计算时间约4～5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。(4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。(5)用0.5％沙黄水溶液(或0.05％碱性复红)复染1min，水洗。(6)制片枯燥后用油镜察看。芽孢呈绿色，菌体红色。2．方法二：(1)加1～2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2～3环培育18～24h的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分均匀打散，制成浓稠的菌液。(2)加5％孔雀绿水溶液2～3滴于小试管中．用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。(3)将此试管浸干沸水浴(烧杯)中，加热15～20min。(4)用接种环从试管底部挑数环菌于干净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片经过微火3次固定。(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。(6)加沙黄水溶液，染2～3min后，倾去染液，不用水洗。(7)枯燥后用油镜察看。芽孢绿色，菌体红色。四、本卷须知

1．载玻片要干净无脂，否那么菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄，切忌过厚。2．在染色过程中，不可使染液干涸。3.在革兰氏染色过程中脱色时间非常重要，过长，那么脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌，另外，老龄菌因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。3.荚膜染色涂片不要用加热固定，以免荚膜伸展变形。4.鞭毛染色液最好当日配置，次日运用那么鞭毛染色浅，察看效果差。染色时一定要充分洗净A液后再加B液，否那么背景不明晰。5．供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保管在菌体上为宜。五、实验报告

(一)绘图1．单染色后察看到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形状图。2．大肠杆菌革兰氏染色视野图。3．金黄色葡萄球菌革兰氏染色视野图。4．褐球固氮菌菌体及荚膜的形状。4．绘出他所察看到的细菌的形状及鞭毛着生情况。6．枯草芽孢杆菌及宏大芽孢杆菌的菌体及芽孢形状，芽孢的着生位置。(二)单染色法操作要点。(三)记录革兰氏染色法法步骤，并进展结果分析。六、问题和思索

1．涂片在染色前为什么要先进展固定?固定时应留意什么问题?2．制备染色装片时应留意哪些事项，为什么?制片为什么要完全枯燥后才干用油镜察看？3．什么是革兰氏染色法?染色过程应留意什么?4．试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。5．组成荚膜的成分是什么?涂片普通用什么固定方法，为什么?6．鞭毛染色的菌种为什么要先延续传几代，并且要采用幼龄菌种?7．根据他的实验领会，哪些要素影响鞭毛染色的效果?如何控制?实验二

微生物的接种技术微生物接种技术是进展微生物实验和相关研讨的根本操作技艺。无菌操作是微生物接种技术的关键。斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的。由于接种方法不同，采用的接种工具也有区别，如固体斜面培育体转接时用接种环；穿刺接种时用接种针，液体转接用移液管等。一、实验目的：了解各种微生物接种方法：斜面接种技术液体接种技术固体接种技术穿刺接种技术二、实验资料和器具：已灭菌培育基、接种环、接种针、酒精灯、移液管、记号笔三、实验步骤：

1、斜面接种技术斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新颖斜面培育基上的一种接种方法。详细操作如下：(1)贴标签接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口约2～3cm的位置。(假设用记号笔标志那么不需标签)。。(2)点燃酒精灯。(3)接种用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。操作必需按无菌操作法进展。简述如下：1)手持试管将菌种和待接斜面的两支试管用大姆指和其他四指握在左手中．使中指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于程度位置。2)旋松管塞先用有于松动棉塞或塑料管盖，以便接种时拔出。3)取接种环右手拿接种环，在火焰上将环端灼烧灭菌．然后将有能够伸入试管中的其他部分均灼烧灭菌，反复此操作．再灼烧一次。4)拔管塞用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，然后让试管口渐渐过火灭菌(切勿烧得过烫)。见图4—6(a)所示。图4－6试管拔塞后过火灭菌和取菌8)塞管塞取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。不要用试管去迎棉塞，以免试管在挪动时纳入不洁空气。9)将接种环灼烧灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。2、液体接种技术(1)用斜面菌种接种液体培育基时，有下面两种情况：如接种量小，可用接种环取少量菌体移入培育基容器(试管或三角瓶等)中，将接种环在液体外表振荡或在器壁上悄然摩擦把菌苔散开，抽出接种环，塞好棉塞，再将液体摇动，菌体即均匀分布在液体中。如接种量大，可先在斜面菌种管中注入定量无菌水．接种环把菌苔刮下研开，再把菌悬液倒入液体培育基中，倒前需将试管口在火焰上灭菌。(2)用液体培育物接种液体培育基时，可用无菌的吸管或移液管汲取菌液接种。3、固体接种技术固体接种最普遍的方式是接种固体菌制剂。因所用菌种或种子菌来源不同分为：1)用菌液接种固体料可用菌苔刮洗制成的悬液。接种时可按无菌操作法将菌液直接例入固体培育基中，搅拌均匀。留意接种所用菌液量要计算在固体料总加水量之内，否那么往往在用液体种子菌接种后含水量加大，影响培育效果。2)用固体种子接种固体料包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培育的种子菌，直接把接种资料混入灭菌的固体料。接种后必需充分搅拌．使之混合均匀。4、穿刺接种技术穿刺接种技术是一种用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半固体的深层培育基中的接种方法。经穿刺接种后的菌种常作为保藏菌种的一种方式，同时也是检查细菌运动才干的一种方法，它只适宜于细菌和酵母的接种培育。详细操作如下：(1)贴标签。(2)点燃酒精灯。(3)穿刺接种，方法如下：1)手持试管。2)旋松棉塞。3)右手拿接种针在火焰上将针端灼烧灭菌，接着把在穿刺中能够伸入试管的其他部位也灼烧灭菌；4)用右手的小指和手掌边拔出棉塞。接种针先在培育基部分冷却．再用接种针的针尖沾取少量菌种。5)接种有两种手持操作法。一种是程度法，它类似于斜面接种法。一种那么称垂直法，如图4—8所示。虽然穿刺时手持方法不同，但穿刺时所用接种针都必需挺直，将接种针自培育基中心垂直地刺入培育基中。穿刺时要做到手稳、动作轻巧快速，并且要将接种针穿刺到接近试管的底部，然后沿着接种线将针拔出。最后，塞上棉塞，再将接种针上残留的菌在火焰上烧掉。(6)将接种过的试管直立于试管架上，放在37℃或28℃恒温箱中培育。24h后察看结果(留意：假设具有运动才干的细菌，它能沿着接种线向外运动而弥散，故构成的穿刺线较粗而散、反之那么细而密)。图4－7斜面划线法〔a〕和不同细菌直线接种长出的菌苔形状〔b〕图4－8穿刺接种：〔a〕程度穿刺接种；〔b〕垂直穿刺接种四、实验报告

列表比较各种接种方法及本卷须知。五、问题和讨论

1.斜面接种取菌前为什么要将灼烧过的接种针在无菌培育基上沾一下？2.穿刺接种时能否将接种针直接穿透培育基？实验三

荧光原位杂交法检测活性污泥中的硝化细菌

DetectionofNitrifyingBacteriaWithFluorescenceInSituHybridization一、实验目的1、经过本次实验掌握荧光原位杂交技术的原理及操作方法；2、经过本次实验了解硝化细菌在活性污泥生物膜中的分布和数量。二、实验原理原位定性、定量及相对定位检测特定核酸序列的技术。杂交所用探针最早用位素作标志，后来改用荧光作标志，称为荧光位杂交〔FISH，Fluorescenceinsituhybridization〕。杂交技术(insituhybridization)，1969年由Pardue和John等人发明，是在玻片或纤维膜上以标志的单链核酸为探针，与组织或细胞中的特定DNA序列进展杂，经过标志信号的有无及强弱来定性、定量及相对定位检测特定核酸序列的技术。硝化细菌有亚硝酸细菌和硝酸细菌。亚硝酸细菌的探针：NSO190，5’-CGATCCCTGCTTTTCTCC-3’FAM标志〔绿色〕。硝酸细菌的探针：NIT35’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3’HEX标志〔蓝色〕。竟争性探针：CNT35’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’三、主要实验资料主要试剂探针、1%稀盐酸、双蒸水、丙酮、2%硅烷丙酮、明胶、明矾、PBS，4%多聚甲醛、NaOH，50%、60%、70%、80%及96%的乙醇，荧光素HAM、HEX、杂交液。四、操作步骤1.玻片预处置〔1〕、普通处置热肥皂水洗自来水冲洗12-15次蒸馏水冲3次1%盐酸中浸泡24h双蒸水冲3次121度灭菌20分钟。〔2〕硅化处置70%乙醇洗1分钟丙酮浸泡1分钟2%硅烷丙酮浸泡10S丙酮浸泡10S蒸馏水浸泡10S双蒸水冲3次50℃烘干2.样品预处置涂片：活性污泥生物膜样品直接涂布于硅化处置后的玻片上。热固定：50℃烘2h。脱水：固定后样品于50%、60%、70%、80%及96%的乙醇脱中室脱水3min。3.杂交反响原位杂交反响：10uL探针+90uL杂交液，混匀后取5-10uL加到预处置过的样品上，暗盒中46℃杂交2-3h。探针的清洗：取出玻片，放入50mL探针清洗液，48℃浸泡20min。双蒸水室温下漂洗2-3次。空气中风干。4.镜检：用荧光显微镜察看，采用蓝色和绿色滤光片。拍照。五.实验的本卷须知1.严厉处置玻片：玻片的预处置应严厉按操作步骤来做，防止有残留的核酸。2.设对照：将实验室富集培育的硝化细菌经过充分分散，稀释1000倍，取样50ul，与亚硝化细菌探针杂交。六、思索题1.荧光原位杂交的原理是什么？2.进展本实验要留意哪些事项？附录一.杂交液的配制探针杂交液去离子甲酰胺/%SDS/%Tris-HCI，PH7.2/mol/LNaCI/mol/LISO190550.01200.9NIT3400.01200.9CNIT3400.01200.9附录二.探针清洗液配制20mmol/LTris–HCI(PH7.2),0.01%SDS,5mmol/LEDTA,40mmol/LNaCI,56mmol/L探针溶液〔NIT3探针〕实验四

水中大肠菌群(Coliformgroup)细菌的检测

一、实验目的了解大肠菌群的检测方法。二、资料与器皿

(—)培育基1、普通乳糖蛋白胨培育液蛋白胨10g牛肉膏3g乳糖5g氯化钠5g1.6％溴甲酚紫乙醇液1.0mL蒸馏水1000mLpH7.2~7.4将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调理pH为7.2~7.4，再参与1.6％溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混匀，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管10mL，115℃灭菌20min。2、三倍浓缩乳糖蛋白胨培育液按上述普通乳糖蛋白胨培育液浓缩三倍配制，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管5mL。3、品红亚硫酸钠培育基〔供平板分别用〕蛋白胨10g乳糖10gK2HPO43.5g琼脂15～20g蒸馏水1000mL无水亚硫酸钠5g左右5％的碱性品红乙醇溶液20mLpH7.2~7.44、伊红美蓝培育基〔EMB培育基〕〔供发酵法平板分别用，3和4可任选一种〕蛋白胨10g乳糖10gK2HPO42.0g琼脂20g蒸馏水1000mL2％伊红〔曙红〕水溶液20mL5％美蓝〔亚甲蓝〕水溶液13mLpH7.2~7.4(二)灭菌移液管、灭菌稀释水、试管、杜汉氏小管、革兰氏染色液、灭菌培育皿。三、方法与步骤

(一)水样的采集供细菌学检验的水样，必需按普通无菌操作的根本要求采集，并保证再运送、储存过程中不受污染。水样从采集到检验不应超越4小时，在0～4℃下保管不应超越24小时，如不能在4小时内分析，应在检验报告上注明保管时间和条件。〔1〕自来水取样：应在水龙头翻开放水5分钟，再用无菌容器接取水样，待分析。如水样内含有余氯，那么采样瓶灭菌后按每500mL水样加3％Na2S2O3.5H2O溶液1mL。江、河、湖、池自然水体取样：可用采样器，采样瓶应先灭菌。采样后，瓶内应留有空隙。假设与其他化验工程结合取样，细菌学分析水样应采在其他样品之前。〔二〕初发酵实验水样稀释：制备水样10-1、10-2的稀释液，方法为用无菌移液管汲取水样10mL放于盛有90mL无菌水和假设干玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡使混合均匀，并使其中的细菌尽量呈单个存在，即为10-1稀释液；再从10-1制备10-2稀释液。以此类推，稀释到所需倍数。

〔2〕接种和培育：以无菌操作于5支三倍浓缩培育基〔接种前一定应先检查杜汉氏小管内有无气泡〕中各参与水样10mL，5支普通培育基试管中参与水样1mL，5支普通培育基试管中参与10-1稀释液1mL，小心混匀放入37℃培育箱中培育24小时。此即5管法。〔3〕结果察看：37℃中培育24h后取出察看，察看有无气体〔杜汉氏小管内有无气体〕和酸产生〔培育基有无变色〕。在48h之间，培育管内倒置的杜汉氏小管内有任何量的气体积累，或培育基颜色从紫色变为黄色，便可初步断定为阳性反响。假设实验所测定的15支管中均为阳性反响，阐明浓水样污染严重，可将样品进一步稀释后，再按上述方法接种、培育和察看。(三)平板培育实验将初发酵实验中产酸产气的后只产酸或只产气的试管中的培育物用接种环取少许，划线接种在品红亚硫酸钠培育基或伊红美蓝培育基平板上，为了确保获得分别的单菌落，须留意以下事项：〔1〕划线间距至少相隔0.5厘米；〔2〕接种钉尖端要稍弯；〔3〕先对试管轻击并使之倾斜，以免接种针挑取到任何膜状物或浮渣；〔4〕划线时要用针尖的弯曲部分接触琼脂培育基平面．以免刮伤或戳破培育基。划线后培育皿倒置，于37℃培育18～24h。24h后，察看在平板上出现的单个菌落，其中心有深绿色金属光泽者为较典型的大肠菌群菌落。尽能够挑取典型的或接近典型的大肠菌群菌落，在营养琼脂斜面上划线，置37℃培育24h。挑取斜面培育物制成涂片，进展革兰氏染色，凡属革兰氏阴性杆菌，即确认了大肠菌群细菌的存在．(四)复发酵验证明验经上述经染色为革兰氏阴性的典型菌落，用接种环刮取部分接种于盛有乳糖培育基的试管中，在37℃培育24h，阳性反响者即确以为大肠菌群细菌。四、结果计算在初发酵实验中，能够有极少数能发酵乳糖产气的非大肠菌群细菌混在阳性可疑反响管中，经过对初发酵中的阳性可疑管进展平板和复发酵实验，并进展革兰氏染色和细菌形状的察看，可将那些少量的非大肠菌群细菌(“假阳性管〞)删除去，故在记录时只能把三步实验都呈阳性的试管计入阳性反响管。假设初发酵接种水样量为10mL、1mL、0.1mL，可直接查表4－2求出原水样100mL中大肠菌群指数〔MPN〕。假设接种水样量低于上述水样量，那么经下面的换算式计算。目前我国系以1L水样中的菌数为报告值，即为MPN×10。表4－2水样的总大肠菌群检索表出现阳性反响的试管数每100ml中的细菌的MPN出现阳性反响的试管数每100ml中的细菌的MPN10ml管中1ml管中0.1ml管中10ml管中1ml管中0.1ml管中000000000000012345024579000000222222012345467911130000001111110123452467911000000333333012345679111315000000444444012345891113151711111133333301234581012151719五、实验报告

1、简述实验过程。2、计算实验结果。六、问题与思索

实验过程中有什么问题，他以为缘由何在，如何抑制？实验五

土壤及空气中微生物的检测一.实验目的

1.学会土壤微生物的检测方法，了解土壤中微生物的数和组成。2.了解一定环境空气中微生物的分布情况，学习并掌握检定和计数空气微生物的根本方法。(注:每组两人)二、资料和仪器(—)培育基1.肉膏蛋白胨琼脂培育基〔培育细菌〕2.高氏一号琼脂培育基〔培育放线菌〕3.查氏培育基〔培育霉菌〕(二)灭菌稀释水、灭菌吸管、灭菌培育皿。(三)土壤样品、天平、称重纸。〔四〕恒温箱、气体流量计三、方法和步骤

〔一〕土壤微生物检测(1)土壤样品的延续稀释取新颖土壤样品1g，在酒精灯火焰旁加到一个装有99mL无菌水的锥形瓶中〔锥形瓶内装有几个玻璃珠〕，将锥形瓶依左右方向振荡数十次使土与水充分混合，将菌分散，即为10-2mL菌液。然后将菌悬液进一步稀释。不断稀释到适宜的稀释倍数〔使接种1mL菌液的培育皿平板上出现30～300个菌落。(2)根据样品中各种微生物的数量选择适宜的稀释度，每种选择三个稀释度，每个稀释度设两个反复。选择出适宜的稀释度后，用移液管将悬液1mL转移到培育皿中。〔3〕将已灭菌的培育基融化后冷却至45℃〔温度过高，培育皿盖上凝结水太多，菌易被冲掉；温度过低，那么培育基凝