蛋白的分离纯化

2023/12/221一蛋白质的提取、分离纯化基本技术路线细胞破碎蛋白提取蛋白分离纯化蛋白浓缩蛋白贮存微生物、动物或植物细胞发酵液或细胞培养液蛋白处理离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。冷冻干燥、结晶等特征参数研究、酶分子修饰、固定化初分离和细分离2023/12/222蛋白分离纯化的一般步骤和原理层析法电泳法超离心法透析和超滤盐析（硫酸铵盐析）等点电沉淀有机溶剂沉淀离心│←前处理→│←粗分级→│←细分级→│材料选择与处理细胞破碎与蛋白的抽提生物组织→→提取液→

→粗产品→→结晶分子大小溶解度电荷性质吸附性质生物亲和力依据原理2023/12/223二细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内蛋白，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎2023/12/224JY92-IID超声波细胞破碎珠高压细胞破碎机DY89-I型电动玻璃匀浆机2常见的细胞破碎仪器组织捣碎机玻璃研钵2023/12/225细胞破碎方法的选择：动物细胞比较容易破碎，通过一般的研磨器、匀浆器、捣碎机等可达到目的细菌细胞壁较厚，破碎需要用超声波、细菌磨、溶菌酶、某些化学溶剂（如甲苯、去氧胆酸纳）或冻融等处理植物细胞因与细菌一样具有细胞壁，所以它们的破壁方法与细菌的破壁方法类似。2023/12/226细胞结构与酶分布2023/12/227

蛋白的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含蛋白原料，使蛋白充分溶解到提取液中的过程。也称为蛋白的抽提。蛋白提取时首先应根据蛋白的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般来说，相似相溶；酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。蛋白基本上都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些蛋白与脂质结合或含有比较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。三蛋白的提取2023/12/228蛋白的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02～0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的蛋白酸溶液提取pH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的蛋白碱溶液提取pH8～12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的蛋白有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的蛋白大多数蛋白类都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，蛋白的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。

2023/12/2291、沉淀分离2、离心分离3、过滤与膜分离4、层析分离GoGoGoGo5、电泳分离Go6、萃取分离Go四常见的分离纯化方法2023/12/22102.1、沉淀分离

沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使蛋白的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。2023/12/2211在盐浓度达到某一界限后，蛋白的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。注意与盐容的区别.2.1.1盐析沉淀分离法2023/12/2212

温度和pH值不变,改变离子强度使不同的蛋白分离的方法称为Ks分段盐析；离子强度的不变,改变温度和pH值，使不同的蛋白分离的方法，称为β分段盐析。

在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。2023/12/2213调整硫酸铵溶液饱和度计算表2023/12/2214

有机溶剂之所以能使蛋白沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20℃时水的介电常数为80，而82％乙醇水溶液的介电常数为40。同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。常用于蛋白的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等

2.1.2有机溶剂沉淀分离法2023/12/2215有机溶剂沉淀分离法的示意图2023/12/22162.1.3其他常见的沉淀分离方法沉淀分离方法分离原理

等电点沉淀法

利用蛋白质在等电点时溶解度最低，以及不同的蛋白质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使蛋白或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离

复合沉淀法

在蛋白液中加入某些物质，使它与蛋白形成复合物而沉淀下来，从而使蛋白与杂质分离选择性变性沉淀法

选择一定的条件使蛋白液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的蛋白，从而使蛋白与杂质分离2023/12/2217几种主要沉淀方法比较2023/12/22182.2、离心分离

离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。2023/12/2219

常速离心机又称为低速离心机,其最大转速在8000r/min以内，相对离心力（RCF）在1×104g以下，在蛋白的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于蛋白的结晶等较大颗粒的分离。2.2.1、常速离心分离2023/12/2220

高速离心机的最大转速为（0.8～2.5）×104r/min，相对离心力达到1×104～1×105g，在蛋白的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。2.2.2、高速离心分离2023/12/2221

超速离心机的最大转速达(2.5～12)×104r/min，相对离心力可以高达5×105g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。2.2、超速离心分离2023/12/22222.4.1常见的层析分离方法

层析方法分离依据吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化聚焦层析将蛋白等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离2023/12/2223吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。溶剂洗脱法置换洗脱法前缘洗脱法2.4.2吸附层析分离2023/12/2224

分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。

分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数。

在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相。当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。纸上层析分配薄层层析分配气相层析

2.4.3分配层析分离2023/12/2225

离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。2.4.3离子交换层析分离2023/12/2226

凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。

凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。2.4.4凝胶过滤层析分离2023/12/2227常用的凝胶：葡聚糖凝胶、琼脂凝胶与琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶

2023/12/2228

亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。

酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，酶RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用.2.4.3亲和层析分离2023/12/2229常用的亲和介质及专一性配体2023/12/2230几种主要层析方法比较2023/12/22312.5、电泳分离带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。电泳方法按其使用的支持体的不同，可以分为：

纸电泳薄层电泳薄膜电泳凝胶电泳自由电泳等电聚焦电泳颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。2023/12/2232毛细管电泳2023/12/2233SDSseparatesproteinsbyMW2023/12/22342023/12/22352023/12/22362023/12/2237

制备式电泳通常以不含SDS的原态disc

进行，以便回收具有活性的蛋白质；蛋白质样本要先经过部分纯化，否则效果不佳，并先以分析式电泳确定所要色帶的位置。2023/12/2238本节目录2023/12/2239五蛋白的纯化方法的分类(1)根据蛋白溶解度不同进行的纯化①盐析法②有机溶剂沉淀法③共沉淀④选择性沉淀⑤等电点沉淀法(2)根据分子大小进行的纯化①凝胶过滤②超滤③超离心2023/12/2240(3)建立在电学解离性质进行的纯化①吸附层析②离子交换层析③疏水层析④反相层析⑤电泳分离(4)利用专一亲和作用进行的纯化①亲和层析②亲和电泳③融合蛋白亲和分离法2023/12/2241(5).根据稳定性差别建立的纯化方法①选择性热变性②选择性酸碱变性法③表面变性法2023/12/2242六蛋白的组合分离纯化策略Resolution（分辨率）Speed（速度）Capacity（容量）Recovery（回收率）设计分离纯化工艺的基本要求2023/12/2243七蛋白的纯度检验方法(1)超速离心法(2)电泳(3)SDS电泳(4)等电聚焦(5)N-末端分析(6)免疫技术2023/12/2244八蛋白的浓缩、干燥与结晶

浓缩与干燥都是蛋白与溶剂（通常是水）分离的过程。在蛋白的分离纯化过程中是一