湖南地标+水产养殖环境（水体、底泥）中地西泮的测定+液相色谱-串联质谱法（征求意见稿）1

ICS03.120.20A00湖DB43Determinationofdiazapaninaquacultureenvironment(water,sediment)byliquidchromatographytandemmassspec湖南省市场监督管理局发布IDB43/TXXX-2024 2规范性引用文件 3术语与定义 4方法原理 5试剂与材料 6仪器与设备 2 2 29结果计算和表述 10检测方法的灵敏度、准确度和精密度 5 DB43/TXXX-2024本文件按GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》给出的规则起草。请注意本文件某些内容可能涉及专利，本文件发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由湖南省农业农村厅提出。本文件由湖南省农业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：湖南省水产科学研究所、农业农村部渔业产品质量监督检验测试中心（长沙）、邵阳县畜牧水产事务中心。本文件主要起草人：李小玲、万译文、杨霄、索纹纹、谢仲桂、雷琴、谢玉昆、何咏、陈湘艺、曾春芳、黄向荣、张永勇、尹升福、刘伶俐、洪波、黄华伟、肖维。1DB43/TXXX-2024水产养殖环境（水体、底泥）中地西泮的测定液相色谱-串联质谱法本文件规定了水产养殖环境（水体、底泥）中地西泮的液相色谱-串联质谱测定方法。本文件适用于我省水产养殖环境（水体、底泥）中地西泮的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB17378.5海洋监测规范第5部分：沉积物分析HJ494水质采样技术指导SL187水质采样技术规程3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4方法原理水体试样经过滤，底泥试料经氨化乙酸乙酯提取，氮气浓缩。所得样液加入甲酸酸化，固相萃取柱富集净化，液相色谱串联质谱仪测定，内标法定量。5试剂与材料5.1试剂除特殊注明外，所用试剂均为分析纯，实验用水为符合GB/T6682规定的一级水。5.1.1乙腈（CH3CN色谱纯。5.1.2乙酸乙酯：色谱纯。5.1.3甲酸（HCOOH）：色谱纯。5.1.4氨水（NH3▪H2O）：分析纯。5.2溶液配制5.2.11%氨水-乙酸乙酯：取5mL氨水（5.1.4）加入495mL乙酸乙酯中，混合均匀，备用。5.2.21%甲酸-水溶液：取10mL甲酸（5.1.3）加入990mL水中，混合均匀，备用。5.2.35%氨水-乙腈溶液：取25mL氨水（5.1.4）加入475mL乙腈（5.1.1）中，混合均匀，备用。2DB43/TXXX-20245.2.4流动相（0.1%甲酸-水溶液）：取1mL甲酸（5.1.3）加入1000mL水中，混合均匀，备用。5.3标准品5.3.1地西泮（Diazepam,C16H13ClN2O,CAS号：439-14-5），纯度≥99.9%。5.3.2氘代地西泮（Diazepam-d5,C16H8D5ClN2O,CAS号：65854-76-4），纯度≥99.9%。5.4标准溶液配制5.4.1标准储备液（0.10mg/mL）：取10mg地西泮（5.3.1）标准品，用乙腈（5.1.1）溶解并稀释定容至100mL，配制成浓度均为0.10mg/mL的标准储备液。-18℃避光保存，有效期12个月。5.4.2内标储备液（0.10mg/mL）：称取10mg氘代地西泮（5.3.2）标准品，用乙腈（5.1.1）溶解并稀释定容至100mL，配制成浓度均为0.10mg/mL的标准储备液。-18℃避光保存，有效期12个月。5.4.3标准中间液（1.0μg/mL）：准确移取地西泮标准储备液（5.4.1）1mL，于100mL容量瓶中，用乙腈（5.1.1）稀释至刻度，配制成浓度为1.0μg/mL的标准中间液。-18℃避光保存，有效期6个月。5.4.4内标中间液（1.0μg/mL）：准确移取氘代地西泮标准储备液（5.4.2）1mL，于100mL容量瓶中，用乙腈（5.1.1）稀释至刻度，配制成浓度为1.0μg/mL的内标中间液。-18℃避光保存，有效期6个月。5.4.5标准使用液（0.10μg/mL）：准确移取5.00mL地西泮标准中间液（5.4.3）于50mL棕色容量瓶中，用乙腈（5.1.1）稀释至刻度，配制成浓度为0.10μg/mL的标准使用液。于4℃下避光保存，有效5.4.6内标使用液（0.10μg/mL）：准确移取5.00mL氘代地西泮内标中间液（5.4.4）于50mL棕色容量瓶中，用乙腈（5.1.1）稀释至刻度，配制成浓度为0.10μg/mL的内标使用液。于4℃下避光保存，有效期1个月。5.5材料5.5.1混合型强阳离子交换（MCX）固相萃取小柱：150mg/6mL，或者相当者。5.5.2微孔滤膜:0.22μm聚四氟乙烯滤膜。5.5.3玻璃纤维滤纸（GF/F）：孔径0.45μm。6仪器与设备6.1液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源。6.2分析天平：感量0.01g和0.0001g。6.3冷冻干燥机。6.4涡旋混合器。6.5高速离心机。6.6超声波清洗器。6.7固相萃取装置，带真空泵。6.8氮吹仪。7样品7.1样品采集水样按SL187规定的方法进行采集。底泥样品按HJ494规定的方法进行采集。3DB43/TXXX-20247.2试样的制备采集的水样经玻璃纤维滤纸（5.5.3）过滤后，置于样品瓶中，在0℃~4℃避光保存。采集的底泥样品经冷冻干燥机冷冻干燥后，剔除石块和植物体等异物，用研钵研磨后过60目（孔径0.25mm）网筛，在0℃~4℃避光保存。7.3空白试样的制备选取不含地西泮的同类样品，按照与试样制备（7.2）相同的步骤进行空白试样的制备。8测定步骤8.1提取8.1.1水体准确移取100mL水样置于离心管中，加入100μL内标使用液（5.4.6），加入1.0mL甲酸（5.1.3）调节pH，旋涡震荡，充分混合，8000r/min离心5min，待净化。8.1.2底泥称取5g（准确至±0.02g）底泥样品于50mL离心管中，加水3mL水润湿，加入100μL混合内标使用液（5.4.6加入15mL1%氨水-乙酸乙酯（5.2.1）涡旋混合2min，超声提取10min，8000r/min离心5min，取上清液转移至25mL比色管中，残渣用10mL1%氨水-乙酸乙酯（5.2.1）重复提取一次，合并提取液，45℃氮气吹干，加入5mL乙腈（5.1.1）溶解，加入250μL甲酸（5.1.3）涡旋混合，待净化。8.2净化MCX固相萃取小柱（5.5.1）依次用3mL乙腈（5.1.1）和3mL1%甲酸水溶液（5.2.2）活化。预处理水体和底泥提取试样全部转移过柱，控制流速不超过1.0mL/min。待水样全部通过小柱后，用3mL1%甲酸水溶液（5.2.2）和3mL乙腈（5.1.1）淋洗，减压抽干，用3mL5%氨水乙腈溶液（5.2.3）洗脱。收集洗脱液，洗脱液45℃氮气吹干。加入1mL乙腈（5.1.1）溶解残渣，过0.22μm微孔滤膜（5.5.2），供液相色谱串联质谱仪（6.1）测定。8.3底泥含水率测定称取5g底泥样品，按照GB17378.5中规定的方法进行含水率测定。8.4标准曲线的制备8.4.1水体分别移取标准使用液（5.4.5）和内标使用液（5.4.6），用乙腈（5.1.1）配制成地西泮的质量浓度为0.20μg/L、0.50μg/L、1.00μg/L、5.00μg/L、10μg/L、50μg/L，氘代地西泮质量浓度为10.0μg/L的系列标准工作液，供液相色谱-串联质谱测定。以测得特征离子质量色谱峰峰面积为纵坐标、对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程和相关系数。8.5测定8.5.1液相色谱参考条件a)色谱柱：C18(100×2.1mm,粒径2.6µm)，或相当者；4DB43/TXXX-2024b)流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸-水溶液。梯度洗脱条件见表1；c)进样量：5µL；d)流速：0.30mL/min；e)柱温：40℃。表1流动相梯度洗脱条件时间（min）A(%)B(%)0900.5904.09556.0955908.5908.5.2质谱参考条件a)离子源：电喷雾离子源；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应监测（MRM）；d)喷雾电压：5.5kV；e)脱溶剂气温度：550℃;f)多反应监测母离子、子离子、去簇电压和碰撞能量见表2。表2多反应监测母离子、子离子、去簇电压和碰撞能量化合物名称母离子m/z子离子m/z去簇电压V碰撞能量eV地西泮285.14440氘代地西泮290.140a为定量离子。8.5.3定性测定在相同测试条件下，试样中待测物的保留时间与标准工作液中待测物的保留时间一致，偏差在±2.5%以内，且试样中待测物定性离子的相对丰度与浓度相当的标准溶液对应的定性离子的相对丰度一致。其允许偏差应符合表3的要求。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度>50%>20%～50%>10%～20%≤10%允许的相对偏差±20%±25%±30%±50%8.5.4定量测定按8.5.1和8.5.2设定仪器条件，取标准工作溶液、试样溶液、空白试样溶液等体积进样测定，内标法定量。标准工作溶液和试样溶液中目标物的响应值均应在仪器检测线性范围内。上述液相色谱-质谱条件下，地西泮标准溶液特征离子质量色谱图见附录A。8.6空白实验5DB43/TXXX-2024按照与上述测定步骤相同的条件进行空白试样（7.3）的测定。9结果计算和表述水体中待测物含量按式（1）计算。计算结果须扣除空白值，保留两位有效数字。1X10V0…………式中：X1——试样中待测物的含量，单位为微克每升(μg/L）；Ci——从标准工作曲线得到的待测物溶液浓度，单位为微克每升(μg/L）；V——试样最终定容体积，单位为毫升（mL）；V0——试样体积，单位为毫升（mL）。底泥中待测物含量按式（2）计算。计算结果须扣除空白值，保留两位有效数字。2X2 VV…………(2)式中：X2——试样中待测物的含量，单位为微克每千克(μg/kg）；V1——试样提取液体积，单位为毫升（mL）。V2——准确移取的备用液体积，单位为毫升（mL）。m——试样质量，单位为克（g）。w——试样含水率，单位为质量分数（%）。10检测方法的灵敏度、准确度和精密度10.1灵敏度本方法在水产养殖环境水体中地西泮的检出限均为0.002μg/L，定量限