Chap紫外可见分光光度法

Chap.11吸光光度法AbsorptionSpectrophotometry可见光1.化教分析化学本章内容§11.1吸光光度法根本原理§11.2吸光光度法仪器§11.3显色反响及其影响因素§11.4吸光度的测量及误差控制§11.5吸光光度分析方法§11.6吸光光度法的应用实例2.化教分析化学吸光光度法根本概念和特点吸光光度法：是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。开展阶段：目视比色法、光电比色法、分光光度法。分类：可见分光光度法、紫外光谱法、红外光谱法。3.化教分析化学吸光光度法的特点〔1〕灵敏度高：测定下限可达10-5～10-6mol·L-1；10-4%～10-5%〔2〕作为微量分析方法，准确度较高：能够满足微量组分(<1%)的测定要求：Er：1%～5%〔3〕仪器设备简单，操作简便快速〔4〕应用广泛4.化教分析化学一、物质对光的选择性吸收§11.1吸光光度法根本原理〔一〕单色光与复合光1、光的波粒二象性光是一种电磁波，具有波粒二象性。5.化教分析化学

c－真空中光速：~3.0×108m/s

－波长：1

m=10-6m,1nm=10-9m,1Å=10-10m

－频率，单位：赫兹Hz次/秒

n－折射率，真空中为1：

=c

；波数=1/

=

/c光的传播速度:〔1〕光的波动性6.化教分析化学

h－普朗克(Planck)常数6.626×10-34J·s

－频率

E－光量子具有的能量单位：J(焦耳)，eV(电子伏特)1eV=1.602×10－19J〔2〕光的微粒性光是由光子流组成，光子的能量：7.化教分析化学

结论：一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越低)，光量子的能量越低。

光具有波粒二象性8.化教分析化学光谱区间

射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可见光400～750nm0.1nm～10nm~750nm~0.1cm0.1mm～1m1m～1000m10nm~200nm200~400nm远紫外近紫外（真空紫外）9.化教分析化学2、单色光与复合光单色光

复合光单一波长的光由不同波长的光组合而成的光白光青蓝青绿黄橙红紫蓝互补色10.化教分析化学1.吸收光与透射光当复合光照射到物体上时，一局部光被吸收，而另一局部光那么被透射过去。即：入射光=吸收光＋透射光

吸收光透射光互补〔二〕物质对光的选择性吸收11.化教分析化学物质的颜色与光的关系完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意光的作用方式表观现象示意复合光12.化教分析化学不同颜色的可见光波长及其互补光蓝黄紫红绿紫黄绿绿蓝橙红蓝绿/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-600黄蓝600-650橙绿蓝650-760红蓝绿13.化教分析化学2.吸收光谱(AbsorptionSpectra)用不同波长的单色光照射，测吸光度—吸收曲线紫外可见吸收光谱：分子价电子能级跃迁。电子跃迁的同时，伴随着振动能级、转动能级的跃迁。带状光谱。14.化教分析化学A

c增大定性分析基础物质对光的选择性吸收定量分析基础在一定实验条件下,A∝cAB

A

最大吸收波长

max3.吸收曲线15.化教分析化学300400500600700

/nm5451.00.80.60.40.2AbsorbanceMnO4-的吸收光谱16.化教分析化学〔1〕吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的ΔΕ所决定，反映了分子内部能级分布状况——定性分析根底〔2〕吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比——定量分析根底同一种物质不同浓度下，其吸收曲线形状相似λmax不变。在λmax处吸光度A随浓度变化的幅度最大。所以测定最灵敏。此特性可作为定量分析时选择入射光波长的重要依据。

Lambert-Beer定律吸收曲线的讨论：17.化教分析化学1.透光率(透射比,Transmittance)透光率定义:T取值为0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光强度I0透射光强度It一束平行单色光二、朗伯-比尔定律〔一〕朗伯-比尔定律的数学表达式18.化教分析化学2.吸光度(Absorbance)T=0.0%A=∞T=100.0%A=0.0溶液的T越大，说明对光的吸收越小，浓度低；T越小，溶液对光的吸收越大，浓度高1.00.50AcA100500T%TA,T,C三者的关系19.化教分析化学K--吸光系数b--吸光液层的厚度(光程)，cmc--吸光物质的浓度，g/L,mol/L

当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比.Lambert-Beer定律3、朗伯-比尔定律20.化教分析化学吸光度与光程的关系

A=Kbc

0.10b0.202b0.00光源检测器显示器参比朗伯定律(1760)21.化教分析化学吸光度与浓度的关系

A=Kbc0.10c0.202c0.00光源检测器显示器参比比尔定律(1852)22.化教分析化学K

K

a吸光系数，L·g–1·cm-1c：mol/Lc：g/Lc：g/100mLK

比吸光系数,100mL·g-1·cm-1吸光系数(K)入射光波长物质的性质温度与浓度无关,取值与浓度的单位相关摩尔吸光系数，L·mol–1·cm-123.化教分析化学4.朗伯-比尔定律的适用条件单色光

应选用

max处或肩峰处测定.

稀溶液

浓度增大，分子之间作用增强.

吸光质点形式不变

离解、络合、缔合会破坏线性关系,

应控制条件(酸度、浓度、介质等).24.化教分析化学溶液浓度的测定A＝

bc工作曲线法(校准曲线)外标法5.朗伯-比尔定律的分析应用01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx25.化教分析化学6.摩尔吸光系数ε的讨论

摩尔吸光系数ε

(L·mol-1·cm-1)在数值上等于浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；同一吸光物质在不同波长下的ε值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，以εmax表示说明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能到达的最大灵敏度。26.化教分析化学吸光光度法的灵敏度的表示方法>105超高灵敏度=(6～10〕×104高灵敏=(2～6)×104中等灵敏度;<2×104不灵敏.〔1〕越大,灵敏度越高27.化教分析化学A=

bc=0.001

bc

＝0.001/

变换单位:bcmcmol/L=bcM106

g/1000cm2定义：当产生吸光度为0.001时，单位截面积(1cm2)的液层内所能检测出的吸光物质的最低含量。用S表示，单位：

g·cm-2S小灵敏度高；相同的物质，M小那么灵敏度高。〔2〕Sandell(桑德尔)灵敏度(S)28.化教分析化学例1邻二氮菲光度法测铁:

(Fe)=1.0mg/L,

b=2cm,A=0.38,计算，S

解：c(Fe)=1.0mg/L=1.0×10-3g/L

/55.85g/mol=1.8×10-5mol/LS=M/

=55.85/1.1×104=0.0051(

g/cm2)29.化教分析化学〔二〕朗伯比尔定律的推导〔自学〕1.吸光度的加合性在多组分体系中如果各吸光物质之间无相互作用这时体系总的吸光度等于各个吸光物质的吸光度之和。2.朗伯比尔定律建立的前提条件〔1〕入射光为平行单色光且垂直照射；〔2〕吸光物质为均匀非散射体系；〔3〕吸光质点之间无相互作用；〔4〕辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程，无荧光和光化学现象发生。30.化教分析化学§11.2吸光光度法的仪器紫外-可见分光光度计一般包括光源、单色器、吸收池和检测显示几局部，根本结构如下：通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光，波长可调,应选择性好,准确度高。光源单色器检测系统吸收池31.化教分析化学

可见分光光度计广州泰纳UV-4501紫外可见分光光度计

32.化教分析化学

紫外-可见分光光度计33.化教分析化学1、光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够 的光强度,稳定。 可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)

紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)

氙灯：紫外、可见光区均可用作光源

/nm钨灯（热辐射光源）4006008001000氙灯（气体放电光源）氢灯强度一、分光光度计的构成34.化教分析化学氙灯氢灯钨灯35.化教分析化学2、单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的 装置。

〔1〕棱镜:依据不同波长光通过棱镜时折射率不同入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ2800

600

50040036.化教分析化学〔2〕光栅：在镀铝的玻璃外表刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。M1M2出射狭缝光屏透镜平面透射光栅光栅衍射示意图原理：利用光通过光栅时发生衍射和干预现象而分光.波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便37.化教分析化学3、吸收池(比色皿)：用于盛待测及参比溶液。 可见光区：光学玻璃池〔350～3200nm〕 紫外区：石英池玻璃〔185～4000nm〕5、显示器：

低档仪器：刻度显示中高档仪器：数字显示，自动扫描记录4、检测器：利用光电效应，将光能转换成

电流讯号。 光电池，光电管，光电倍增管38.化教分析化学吸光光度法仪器主要差异比较可见光(400～750nm)紫外光(200～400nm)光源钨灯碘钨灯320～2500氢灯氘灯180～375吸收池材料玻璃（350～3200）石英（185～4000）39.化教分析化学二、分光光度计的类型单光束分光光度计双光束分光光度计其他类型分光光度计多通道仪器

同时测量200～820nm范围内的整个光谱，比单个检测器快316倍，信噪比增加3161/2倍。

纤维光度计

将光度计放入样品中，原位测量。

对环境和过程监测非常重要。40.化教分析化学0.575光源单色器吸收池检测器显示1.单波长单光束分光光度计简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。41.化教分析化学2.单波长双光束分光光度计比值光源单色器吸收池检测器显示光束分裂器自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。42.化教分析化学§11.3显色反响及其影响因素一、显色反响的类型及要求被测元素在某种试剂的作用下，转变成有色化合物的反响，称之为显色反响。mX(待测物)＋nR(显色剂)＝XmRn(有色化合物)主要有配位反响(为主)和氧化复原反响。43.化教分析化学配位显色反响当金属离子与有机显色剂形成配合物时，通常会发生电荷转移跃迁，产生很强的紫外—可见吸收光谱。氧化复原显色反响例如：钢中微量锰的测定，Mn2＋不能直接进行光度测定

2Mn2＋＋5S2O82-＋8H2O=2MnO4-+10SO42-＋16H+将Mn2＋氧化成紫红色的MnO4-后，在525nm处进行测定。44.化教分析化学1.配位显色反响类型二元配合物体系三元配合物体系多元配合物体系混合配合物显色体系离子缔合物显色体系金属离子-配体-外表活性剂显色体系45.化教分析化学混合配合物显色体系：由一种金属离子与两种不同配体通过共价键结合成有色配合物的显色体系。如：V：H2O2：PAR〔吡啶偶氮间苯二酚〕离子缔合物显色体系：金属离子首先与配体生成配阴离子或阳离子，然后再与带相反电荷的离子缔合物的显色体系。如：Ag+:邻二氮菲：溴邻苯三酚红〔深蓝色离子缔合物〕。特点：第一配体已使金属离子配位饱和，但电荷尚未饱和，可与带相反电荷的离子缔合；这类缔合物在水中溶解度低，易溶于有机溶剂，多用于萃取光度法。46.化教分析化学金属离子-配体-外表活性剂显色体系如：稀土元素：二甲酚橙：溴化十六烷基吡啶〔蓝色配合物，测定稀土总量〕常用的外表活性剂：溴化十六烷基吡啶、溴化十六烷基三甲基铵十二烷基磺酸钠曲通X-100、OP等。47.化教分析化学2.对显色反响的要求选择性好灵敏度足够高：>104比照度要大：>60nm有色化合物的组成恒定，且稳定性好。显色条件易于控制，重现性好。48.化教分析化学二、无机离子的常用显色剂：：：：助色团：－NH，－OH，－X(孤对电子)neO生色团：－N＝N－，－N＝O，OC=S,－N〔共轭双键〕πe无机显色剂:

SCN-

[Fe(SCN)]2+

；H2O2

[TiO·H2O2]2+有机显色剂:49.化教分析化学CH3－C－C－CH3HO－NN－OH＝＝NNOHCOOHSO3HOO型：NNNOH

OHON型：PARNHNHNSNS型：双硫腙NN型：丁二酮肟邻二氮菲磺基水杨酸

有机显色剂50.化教分析化学三、影响显色反响的因素c(R)c(R)c(R)1.显色剂用量

Mo(SCN)32+

浅红Mo(SCN)5

橙红Mo(SCN)6-浅红Fe(SCN)n3-n选择曲线变化平坦处。51.化教分析化学2.溶液的酸度OH-酸度的影响影响被测物质的存在状态M+nR=MRnH+影响显色剂的平衡浓度和颜色RH=R-+H+

影响配合物的组成和颜色例，磺基水杨酸(ssal)–Fe3+pH=2~3FeR紫红色pH=4~7FeR2橙色pH=8~10FeR3黄色

pH>12Fe(OH)3

沉淀52.化教分析化学pH1<pH<pH2选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区ApH酸度的影响53.化教分析化学邻二氮菲－亚铁反响完全度与pH的关系pH3～8(柠檬酸盐介质)为适宜的酸度范围32+3NNFe

桔红色

max柠檬酸盐介质+Fe2+54.化教分析化学3、显色反响的时间和温度〔1〕显色时间：不同的显色反响需要放置不同的时间，才能到达溶液颜色的稳定形成。另一方面，不同的显色物具有不同的稳定持续时间，测定一定要在其稳定期进行，否那么，有较大的测定偏差。〔2〕显色温度25℃50℃t/minA55.化教分析化学4.有机溶剂和外表活性剂有机溶剂：降低有色化合物的接力度，提高显色反响的灵敏度；影响显色反响速率、配合物的颜色、溶解度和组成等。外表活性剂：具有胶束增溶、增敏作用，提高显色反响的灵敏度，增加有色化合物的稳定性。56.化教分析化学共存干扰离子的消除Co2＋,Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2(蓝)⑴NaFSCN－Co2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN－测Co2＋(含Fe3+):

(掩蔽法)

化学法5.共存离子的干扰57.化教分析化学如无法通过控制酸度和掩蔽的方法消除干扰，那么需采取别离法。测Fe3＋:(控制pH)，用磺基水杨酸Fe3+,Cu2+Fe(ssal)+〔紫红〕Cu2+pH2.5ssal58.化教分析化学

物理法—选择适当的测定波长415500钴-亚硝基红盐A络合物试剂

/nm59.化教分析化学测量条件的选择：除高效显色剂外，分光光度法的准确度和灵敏度还与适宜的测量条件相关，包括入射光波长、吸光度读数范围和参比溶液的选择。§11.4吸光度的测量及误差控制

60.化教分析化学1.测量波长的选择原那么：“吸收最大，干扰最小〞A

X

maxY(2)一、测量波长和参比溶液的选择61.化教分析化学2.参比溶液的选择参比液的选择方法溶剂作参比

试液空白(不加显色剂)作参比试剂空白(不加试样溶液)作参比加掩蔽剂(M)后的试液作参比试液无吸收，显色剂无吸收试液有吸收，显色剂无吸收试液无吸收，显色剂有吸收试液有吸收，显色剂有吸收62.化教分析化学二、比尔定律的偏离依据Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面〔一〕光学因素〔二〕化学因素63.化教分析化学〔一〕光学因素1．非单色光的影响：

Beer定律应用的重要前提——入射光为单色光照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜或光栅的分辨率决定为了保证透过光对检测器的响应，必须保证一定的狭缝宽度这就使别离出来的光具一定的谱带宽度64.化教分析化学2．杂散光的影响：杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值3．反射光和散色光的影响：反射光和散色光均是入射光谱带宽度内的光直接对T产生影响散射和反射使T↓，A↑，吸收光谱变形注：一般可用空白比照校正消除4．非平行光的影响：使光程↑，A↑，吸收光谱变形65.化教分析化学〔二〕化学因素Beer定律适用的另一个前提：稀溶液浓度过高会使C与A关系偏离定律〔三〕介质均匀程度66.化教分析化学微分：两式相除得：以有限值表示可得：假设读数的绝对误差为△T=1%，用不同的T代入上式，可得相应浓度测量的相对误差△c/c，作图测定结果的精度常用浓度的相对误差△c/c表示,〔Δc/c〕不仅与仪器的透光度误差ΔT有关，而且与其透光度读数T的值也有关三、吸光度测量的误差

67.化教分析化学1086420204060800.70.40.20.1AT%Er(36.8)0.434浓度测量的相对误差与T(或A)的关系实际工作中，应控制T在10～70％,

A在0.2～0.7之间(调c,b,

)最正确值最正确读数范围68.化教分析化学【例】某一有色溶液在2.0cm的吸收皿中，测得透光率T＝1％，假设仪器透光度的绝对误差△T＝0.5％，计算〔1〕测定的浓度的相对误差△c/c〔2〕为使测得吸光度在最适读数范围内，溶液应稀释或浓缩多少倍？〔3〕假设浓度不变，而改变比色皿厚度〔0.5cm,1.0cm，2.0cm,3.0cm〕,那么应选择那种厚度的吸收皿最适宜，此时△c/c为多少？69.化教分析化学解：〔1〕〔2〕A=-lgT=-lg1%=2设有色溶液原始浓度为cº，当b一定时，A＝εbc＝Kc,要使A＝0.2～0.7，那么即稀释3～10倍70.化教分析化学〔3〕当c一定时即cº，A＝εbc＝Kb,要使A＝0.2～0.7，那么bº=2cmb=0.5cm71.化教分析化学四、共存组分的干扰及消除

控制溶液酸度参加掩蔽剂配位掩蔽剂氧化复原掩蔽剂72.化教分析化学§11.5吸光光度分析方法1.校准曲线法(校准曲线，工作曲线法，外标法〕A＝

bc01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx标准系列未知样品一、经典光度分析方法73.化教分析化学1.单一组分的测定标准工作曲线法

先配制一系列标准溶液，在最大吸收波长处，测出它们的吸光度，作图，同条件测未知液的吸光度，从图中查出未知液的浓度cA标准工作曲线图Axcxc1c2c3c4c5A1A2A3A4A574.化教分析化学微量铁的测定氨基酸的测定邻二氮菲法茚三酮法(紫色化合物)蛋白质的测定考马斯亮蓝法总磷的测定海水中营养盐的测定磷钼蓝法单组分的测定75.化教分析化学

磷的测定：DNA中含P～9.2%,RNA中含P～9.5%，可得核酸量。H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O磷钼黄(

小)磷钼(V)蓝(ε大)

λmax=660nmSn2+76.化教分析化学

2.多组分的测定根据加合性原那么解联立方程，可求得Cx,Cy为物质的特征参数，可通过配制标准溶液测得:由x,y标液在

1,

2处分别测得.如果两组分吸收峰相互不重叠，可在不同λmax处测定A

XY

1

2x,y组分不能直接测定77.化教分析化学在

1处测组分x,在

2处测组分y.b)在

1处测组分x;在

2处测总吸收,扣除x吸收,可求y.2.多组分的测定78.化教分析化学二、示差光度法以浓度为Cs的标准溶液为参比〔Cx>Cs〕

ΔAx适宜高浓度的测定ΔA△C△CxΔAx差示工作曲线标准溶液cs

、

c1、c2、c3……。以cs作参比，调A=0.测

c1、

c2、c3……的△A，用△A对△c作图.同条件下测△Ax.从差示工作曲线中查出△cx.

79.化教分析化学示差法提高准确度的实质常规法TxT051050100

落在测量误差较大的范围示差法T051050100TrTsTs

落在测量误差较小的范围结论：示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度标尺扩展10倍80.化教分析化学三、络合物组成的测定(1)摩尔比法(饱和法)

固定cM,改变cR

从0开始增大M+nR=MRnCMRnCR81.化教分析化学在特定波长测定

R=0,

M=0,

MRn>0

R>0,

M>0,

MRn=0CR/CMAACR/CMnACR/CMn82.化教分析化学(2)等摩尔连续变化法〔Job〕:CM/C从0→1

R=0,

M=0,

MRn>0

R>0,

M>0,

MRn=000.51.0ACM/C0.33n=1,CM/C=0.5n=2,CM/C=0.3300.51.0ACM/C83.化教分析化学定性法简介：目视比色法标准系列未知样品特点利用自然光比较吸收光的互补色光准确度低(半定量)不可分辨多组分方法简便，灵敏度高84.化教分析化学1.了解分子对光的吸收。吸收曲线—定性分析根底。2.掌握光吸收根本定律：朗伯-比尔定律—定量分析的根底A=Kbc=-lgT式中各参数的物理意义，定量计算。3.分光光度计根本部件；4.灵敏度的