心脑脉络复元汤对异丙肾上腺素致大鼠心肌损伤的保护作用

心脑脉络复元汤对异丙肾上腺素致大鼠心肌损伤的保护作用

大剂量异丙醇可复制心血管动物模型，导致类似于缺血性心肌损伤的病理改变。心脑脉络复元汤具有行气活血、化痰通络、扶正宁心的作用,笔者临床实践证明对防治冠心病有良好的疗效。本研究用异丙肾上腺素复制心肌损伤大鼠模型,采用心脑脉络复元汤进行干预,观察其对模型病理改变的影响和对心肌细胞凋亡的作用。1材料和方法1.1动物健康雄性Wistar大鼠40只,体重(300±20)g(由湖北省实验动物研究中心提供)。1.2心脑脉络复元汤、颗粒质量分数粉盐酸异丙肾上腺素注射液(上海禾丰制药有限公司生产,批号:120303)。复方丹参片(0.6g/片,北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂生产,批号:1123572),实验前研末以生理盐水配制成0.1g/mL浓度悬液。心脑脉络复元汤(主要由黄芪、麦冬、黄精、瓜蒌皮、薤白、丹参、川芎、郁金等组成,武汉市中医医院制剂室提供,水煎煮沸,再续煎30min,取汁2次,浓缩至含生药量1.5g/mL药液)。细胞凋亡检测试剂盒、Bax和Bcl-2免疫组化染色试剂盒(购自武汉市博士德生物工程有限公司)。1.3大鼠单次注射sdd大鼠先作ECG检查,弃去ST-T有异常改变者和心律失常者,完全随机分为4组,每组10只,分别为生理盐水对照组,异丙肾上腺素缺血组(模型对照组),复方丹参片对照组和心脑脉络复元汤干预组。动物饲养3d,以适应环境及消除麻醉药物对大鼠的影响。第4天开始灌胃给药,前两组灌服生理盐水,后两组给予相应的药液8mL/kg,每天1次,连续灌服9d。末次灌胃2h后,给生理盐水对照组大鼠皮下多点注射生理盐水80mL/kg,给其余3组大鼠皮下多点注射异丙肾上腺素40mg/kg。记录注射前和注射后20min时的ECG,观察ST-T等改变情况。注射异丙肾上腺素20min后,可见室性早搏,ST段明显抬高。注射2h后再灌服药物1次。皮下注射异丙肾上腺素24h后摘除大鼠心脏,进行各项检测。1.4免疫组织化学心肌组织切片制备:取出心脏标本于4%多聚甲醛中固定24h(4℃),常规石蜡包埋,切片数张,分别作HE染色、细胞凋亡及免疫组织化学染色法检测。1.4.1关于心肌组织病理学的观察光镜下观察心肌组织形态结构。1.4.2bax和bcl-2基因表达的表达心肌细胞凋亡按末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)标记凋亡细胞核的3’末端。细胞核或胞浆中有棕黄色颗粒的为阳性细胞。Bax和Bcl-2基因的蛋白表达按试剂盒说明书免疫组织化学染色法检测。细胞浆内见棕黄色颗粒沉着为阳性表达。将凋亡和免疫组化切片于光镜下放大400倍,随机选择10个视野,分别测定阳性细胞百分比,计算细胞凋亡指数(AI)和蛋白阳性表达指数(PEI)。1.5+标准差xs的解释用SPSS18.0统计学软件分析处理。数据以均数+标准差(x¯±s)(x¯±s)表示。多组间比较用单因素方差分析,两两比较用q检验,以P<0.05为有显著性差异,P<0.01为有非常显著性差异。2结果2.1病理组织学检测参照Rona方法对心肌病理损伤程度进行分级分析。生理盐水对照组心肌细胞未见明显变性与坏死,为0度;异丙肾上腺素缺血组见心肌组织呈灶性坏死,偶见灶间相互连接,组织病理损伤程度为Ⅱ-Ⅲ度;复方丹参片对照组多见点片状坏死,杂以灶性坏死,病理损伤程度多为Ⅱ度;心脑脉络复元汤干预组也可见心肌坏死灶形成,但多为点片状坏死,病理损伤程度多为Ⅰ度。2.2复方丹参片对心肌凋亡的影响生理盐水对照组仅见极少数散在性细胞凋亡存在,Bax蛋白和Bcl-2蛋白虽有表达,但量很低。异丙肾上腺素缺血组见灶性心肌坏死周围有明显的心肌细胞凋亡现象,心肌细胞Bax基因的蛋白表达也明显上调,心肌细胞Bcl-2蛋白表达也有所增加。复方丹参片对照组有较多的心肌凋亡细胞,Bax蛋白表达上调较高,Bcl-2蛋白表达仍较低。与之相比,心脑脉络复元汤干预组心肌凋亡细胞数量明显减少,Bax蛋白表达明显降低,Bcl-2蛋白表达明显升高。见表1。3心脑络复元汤干预大鼠心肌凋亡的机制用大剂量异丙肾上腺素注射可引起大鼠心肌细胞变性与坏死,坏死病灶多位于心尖部心内膜下,其光镜下病理改变类似于缺血性心肌坏死。大剂量异丙肾上腺素可引起部分心肌细胞凋亡,凋亡细胞主要位于心肌坏死灶周边区。异丙肾上腺素是一种β受体兴奋剂,通过激动心脏β1受体,增加心肌收缩力,加快心率。大剂量注射异丙肾上腺素后,心肌需氧量明显增加而供氧量明显减少,需氧、供氧失去平衡,导致心肌相对和绝对缺血缺氧。过量的异丙肾上腺素尚可引起细胞内钙离子浓度增高,使ATP分解并激活磷酸酶致线粒体出现不可逆性损伤,终致心肌细胞坏死。细胞凋亡是程序性细胞死亡方式,不同于细胞坏死的生理死亡过程。心肌细胞凋亡参与许多生理和病理生理过程,是多种心血管疾病发生与演变的细胞学基础。异丙肾上腺素诱导心肌细胞凋亡的机制,同样与异丙肾上腺素致心肌细胞缺血缺氧有关,因心肌细胞缺血缺氧可导致心肌细胞凋亡;心肌细胞凋亡的机制还与细胞内钙离子浓度增高有关,胞内钙超载不仅是致心肌变性坏死的重要因素,在诱导心肌细胞凋亡中也具有重要意义。细胞凋亡具有复杂的分子调控机制,受一系列基因及其表达产物的有序调控,而且基因间还存在正负调节和相互作用。Bax和Bcl-2分别是促进细胞凋亡的基因和抑制细胞凋亡的基因。Bax高表达时,凋亡指数高,Bax低表达或不表达时,凋亡指数低;相反bcl-2高表达,则凋亡指数低,bcl-2低表达或不表达,则凋亡指数高。本研究中,光镜下观察心脑脉络复元汤干预组病理损伤程度较异丙肾上腺素缺血组明显减轻,TUNEL法检测心脑脉络复元汤干预组心肌凋亡细胞数量较异丙肾上腺素缺血组也明显减少。以上检测结果不仅进一步证实了心肌细胞凋亡在心肌缺血损伤病理改变中起了不可忽视的作用,而且似可阐明,通过阻断或抑制心肌细胞发生凋亡可能是心脑脉络复元汤发挥显著的保护缺血损伤心肌作用的主要机制之一。进一步对凋亡相关基因Bax和Bcl-2的蛋白表达的观察显示,异丙肾上腺素缺血组大鼠心肌细胞Bax基因的蛋白表达明显上调,而心肌细胞Bcl-2蛋白表达也有所增加;心脑脉络复元汤干预组大鼠心肌细胞Bax蛋白表达显著减少,而Bcl-2蛋白表达则明显增加。以上结果表明,心脑脉络复元汤对心肌缺血损伤时凋亡相关基因的蛋白表达具有显著的调节作用。通过调节缺血心肌Bax、Bcl-2基因的蛋白表达,从而抑制和阻断细胞凋亡的发生,可能是中药心脑脉络复元汤防治冠心病