血友病a患者及家系中基因倒位的间接诊断

血友病a患者及家系中基因倒位的间接诊断

血友病（ha）是对患者的健康和生命威胁最大的遗传因素之一。其遗传规律为X连锁隐性遗传。目前对本病尚无有效根治方法,因此开展基因诊断、携带者检出,以及产前基因诊断,是防止新的患儿出生、阻断有害基因传递的有效措施。但FⅧ基因相当大,由26个外显子和25个内含子组成,全长达186kb。已知HA中的一半为重型,而重型HA中,约有40%～50%是由于发生在FⅧ基因22内含子中的倒位所致。已有报道用长距离PCR(LD-PCR)技术可以快捷、灵敏地查出这种基因倒位,这样约四分之一的家系可直接用此技术作出基因诊断、携带者检出及产前诊断。除此之外导致约70%～80%的血友病A的Ⅷ因子(FⅧ)基因突变呈高度异质性,因此完全靠直接查找其基因突变的直接诊断方法,工作量很大、时间长。我们运用3项以PCR技术为基础的基因连锁分析方法进行间接诊断,以期为所有的HA家系成员都能作出基因诊断。本文报道运用上述方法查出7例FⅧ基因倒位,并完成19个非倒位HA家系基因诊断的结果。对象和方法一、病例选择选择源于省域26例HA患者及数目不等的家系成员分别来自北京、天津、江苏、湖北、四川、山东、广西、广东、福建等地,均经省市级以上医院确诊。患者均为男性,年龄从1岁至73岁不等。家系成员中有患者的姐妹、兄弟、妻子、女儿、外孙女等。每人取3～5ml静脉血,乙二胺四乙酸或酸性柠檬酸葡萄糖溶液B抗凝,盐析法抽提基因组DNA,部分采用酚/氯仿法抽提。二、方法1.ycartgradint983/损害赔偿/双循环扩增ycarli1在0.2ml薄壁反应管内,按文献的方法加入PCR混合物,于梯度PCR仪(RobocyclerGradient96)上进行扩增,循环条件为:94℃12s,65℃15min,共30个循环,在后20个循环中,每一循环的65℃延伸时间延长20s。扩增后进行1×TBE配制的0.6%琼脂糖凝胶电泳,EB染色后用凝胶呈像仪观察,分析结果。2.pcr扩增条件用于BclⅠ多态性分析的引物根据FⅧ外显子18和内含子18基因序列自行设计:P1:5′TTCATTTCAGTGGACATGTG3′,P2:5′CCTATGGGATTTGAGATGGT3′。扩增片段长度为374bp,含有BclⅠ酶切位点的片段经BclⅠ酶切后长度为211bp和163bp,不含BclⅠ酶切位点的片段经BclⅠ酶切后长度仍为374bp。在25μl体系中,含基因组DNA0.1μg,引物P1和P2各0.4μmol/L,dNTP100μmol/L,1×buffer,TaqDNA聚合酶0.5U。按以下条件进行扩增:预变性94℃2min,94℃40s,60℃40s,72℃40s,30个循环后,72℃延伸5min。取PCR产物5μl进行2%琼脂糖凝胶电泳,观察到DNA扩增的特异片段后,取PCR产物5μl,用BclⅠ酶10U,50℃保温4h,酶解产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,确定酶切位点的有无,进行连锁分析。3.引物和扩增方法参考以家系各成员的基因组DNA0.1μg为模板,所用引物和扩增方法参考文献。取PCR产物5μl进行0.8%琼脂糖凝胶电泳,EB染色后用凝胶呈像仪观察扩增片段,进行连锁分析。4.显色条带的制备参照Lalloz法,但我们没有采用放射性标记法,而是用银染法和EB染色法。银染的主要步骤为:电泳结束后,将凝胶浸入固定液(10%乙醇、0.5%乙酸)中置摇床上慢速摇动15min,弃去固定液,换染色液(0.2%硝酸银)置摇床上染色10min,弃染色液,以蒸馏水漂洗两次,每次1min,然后加入显色液(1.5%氢氧化钠、0.4%甲醛)显色至条带清晰,及时终止显色。EB染色同常规操作。用凝胶成像仪照相或干胶保存。公正诊断家系1.16个重型血友病A家系FⅧ基因倒位的检测:在16个重型血友病A患者中查出7个具有FⅧ基因倒位,占43.8%。其中14个DNA标本LD-PCR产物电泳分析的图谱中,标本1、2、3、7、8、10、11、14只出现12kb带,为野生型,即非基因倒位;标本4、9、12只出现一条11kb带,这说明这3位男性患者的FⅧ基因有倒位;标本5、6、13有11kb、12kb两条带,此3例是该基因倒位的女性携带者(图1)。2.用BclⅠPCR/RFLP法对19个非倒位HA家系基因进行分析的结果:家系8先证者基因型为374/-,其母为374/211,由遗传规律可知先证者母亲的374bp片段与HA致病基因连锁。先证者之大姐基因型为374/211,其374bp来自母亲的致病性FⅧ基因连锁片段,故诊断其大姐为携带者。先证者的二姐基因型为211/211,诊断为正常人(图2)。用该试验可以对16个家系作出诊断,可诊断率为84.2%。3.用与FⅧ紧密连锁的St14/VNTR对19个非倒位HA家系进行基因分析的结果:家系15先证者及其母的基因型分别为-/700和1300/700,判断700bp片段与HA致病基因连锁。先证者之大妹基因型为1300/700,故大妹诊断为HA携带者;而小妹(1300/1300)为正常人(图3)。用该试验可以对其中17个家系作出诊断,可诊断率达89.5%。4.用二核苷酸重复序列多态性对19个非倒位HA家系基因进行分析的结果:家系18扩增产物在10%(A)和12%(B)的聚丙烯酰胺凝胶电泳,得出的两组多态性结果见图4。先证者内含子22中为(GT)19(AG)7,重复数为26,该位点基因型为26/-,由电泳图得知先证者女儿该位点基因型为26/26,根据遗传规律可知女儿为携带者,外孙女为26/25,但由于女儿是纯合子,无法判断外孙女是否携带者。先证者内含子13中为(CA)21,基因型为21/-,其女儿为21/20,外孙女为21/21,根据遗传规律可知女儿的21拷贝带与致病基因连锁,外孙女的两条21拷贝带中一条来自母亲的致病基因连锁带,故外孙女也为携带者。用此项试验可以为其中13个家系作出诊断,可诊断率为68.4%。5.用BclⅠPCR/RFLP技术对19个HA家系进行连锁分析的结果:除家系6、15、18外,其余家系均能作出诊断,可诊断率为84.2%;运用二核苷酸重复序列多态性可诊断率为68.4%,家系9、10、12、16、19不能作出诊断;而运用VNTR/PCR可诊断率为89.5%,只有家系9、14不能作出诊断。可见,联合运用BclⅠPCR/RFLP与另二种间接诊断方法之一即可对19个非倒位HA家系全部作出诊断。间接诊断技术根据Ⅷ因子活性水平及症状可把HA分为重型、中型和轻型,其中重型约占50%。在HA中,由Ⅷ因子基因倒位引起的约占40%～50%。这样约25%的HA是由Ⅷ因子基因倒位引起。本实验室建立了直接诊断倒位引起的重型HA的LD-PCR技术。该技术代替了国际上的Southernblod杂交技术,大大简化了步骤,省时、省力、结果准确可靠。本实验的16个重型HA家系中共检出7个有FⅧ基因倒位,占43.8%,并检出10位女性携带者。但其他导致HA的FⅧ基因突变高度异质,这使得直接检出所有突变基因变得繁琐,成本高。我们采用了3种间接诊断技术,即BclⅠRFLP分析,St14VNTR及二核苷酸重复序列多态性分析技术,分别对19个非倒位HA家系进行连锁分析及诊断。BclⅠ是位于FⅧ基因内的一个多态性位点,用Kogan等的方法扩增片断为142bp,经BclⅠ酶切后含酶切位点的变为99bp,由于片断较短,必须进行聚丙烯酰胺凝胶电泳才能分析结果。本实验自行设计引物,扩增片断及酶切片段为374/211bp,经调整PCR条件,扩增条带强,特异性好,直接用2%琼脂糖凝胶电泳即可分析结果,经济、省时。在本组19个家系中可诊断率达到84.2%,可提供可靠的诊断结果。St14/VNTR的实验步骤较BclⅠ更简便,只需PCR,不需酶解,电泳分析结果非常清晰,其杂合率较高,提供的多态信息量(PIC)也高,本组中19个家系的可诊断率为89.5%。但由于该位点位于FⅧ基因以外,有5%的重组率,故作出诊断时要小心,最好有其他指标佐证以防误诊。二核苷酸重复序列多态性发现较晚,分别位于FⅧ基因内含子13和22中,其二核苷酸重复序列拷贝数变异较多,提供的多态信息量可达70%～80%。本组在19个家系中运用二核苷酸重复序列多态性为13个家系作出诊断,可诊断率为68.4%。通过对HA家系进行基因诊断的几种方法,我们认为对HA,首先应用LD