电针治疗慢性应激抑郁模型大鼠海马神经元凋亡及jnk信号转导通路的变化

电针治疗慢性应激抑郁模型大鼠海马神经元凋亡及jnk信号转导通路的变化

针灸和艾灸治疗有很好的临床效果，但其作用机制尚不完全清楚。许多研究报道不同的应激刺激可以通过激活JNK蛋白激酶(c-JunNterminalkinase,JNK)信号途径引起海马神经元凋亡。我们的相关研究发现慢性应激抑郁模型大鼠JNK蛋白激酶信号系统活化及引起相应的海马神经元异常凋亡参与了抑郁症的病理生理过程,前期的研究结果表明电针可以对慢性应激抑郁相关的信号通路上关键指标产生影响。在此研究基础上,我们使用电针治疗慢性应激抑郁模型大鼠,以期观察电针对海马神经元凋亡及JNK信号转导通路影响。1材料和方法1.1实验动物及分组雄性SD大鼠[动物许可证号:SCXK(京)2006-0009],体重(200±20)g,共65只,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,随机分为空白组、空白电针组、模型组、电针组、百优解组,每组13只。各组大鼠在实验前适应性喂养1周。应激结束后从每组中随机抽出5只进行免疫印迹(Westernblot)检测,其余大鼠用于流式细胞凋亡检测。1.2多次刺激的多次参考文献方法,造模动物全部接受孤养。大鼠共接受21d各种不同刺激,包括:断食24h、断水24h、昼夜颠倒24h、冷水游泳(10℃,5min)、热应激(45℃,5min)、夹尾3min、束缚3h,每种刺激平均使用3次。空白组和空白电针组大鼠不接受上述任何刺激,每笼6~7只饲养。1.3应激造模干预空白组:动物不接受任何刺激,自由摄食饮水饲养。空白电针组:动物每天进行电针处理,电针方法同电针组。模型组:动物每天进行慢性应激造模处理。电针组:动物每天进行慢性应激造模处理,同时在每天应激刺激前1h进行电针干预。选取“百会”“印堂”穴,用30号1寸毫针(2.5cm)平刺进针,深度为0.5~1.0cm,然后接HANSLH-202型电针治疗仪,电针频率为2Hz,电流强度为0.6mA左右,以大鼠头部微颤为宜。每次电针20min,每日1次,连续针刺21d。百优解组:动物每天进行应激造模处理,同时在每天应激刺激前1h进行百优解(盐酸氟西汀,美国礼来公司生产,批号:J20030017)灌胃干预。百优解用蒸馏水配成0.18mg/mL,按10mL/kg给药。以上各组同步平行实验,共计21d。1.4大鼠在vmin内活动参考文献方法制作80cm×80cm×40cm的周边不透明的立方型敞箱,将箱底用白线划分为面积相等的25块。室内隔音保持安静状态下将大鼠放置于敞箱底面的中心方格内,然后开始记录大鼠在3min内的活动。以穿越底面块数为水平穿越格数(记录四爪均进入的方格),以两前肢离开地面直立数为竖立活动次数,每只动物只测1次,分别于实验前1天和实验第22天进行。1.5碘化丙锭pi单染的制备慢性应激程序及行为学测试结束后,各组8只大鼠以3.5mL/kg的10%水合氯醛腹腔注射麻醉,断头取脑。于冰上分离出海马组织,先用冷生理盐水冲洗1次,再用200目网筛网搓法制成单细胞悬液。将制备好的单细胞悬液依照锚定蛋白V(AnnexinV)异硫氰酸荧光素(FITC)试剂盒操作说明进行处理:4℃、2000r/min离心5min;弃上清,加预冷的PBS混匀1mL,吸出一半放入另一空管内,再将剩下的一半进行同上离心后用来做碘化丙锭(PI)单染。上述空管中的一半加入3mLPBS,用迷你离心机混匀振荡离心5min,弃上清,然后加入200μL的结合Buffer;再次混匀振荡;再加入5μLAnne-xinV-FITC和10μL的20μg/mLPI溶液,将其混匀后于室温避光孵育15min;最后在反应管中加入400μLPBS,上FACScan型流式细胞检测仪(美国Becton-Dickinson公司)分析。1.6western-q病:蛋白质定量检测①脑组织蛋白提取及测定:慢性应激程序及行为学测试结束后,各组5只大鼠迅速被断头处死,取脑,分离出海马组织。取100mg组织加500μL组织裂解液(普利莱基因有限公司提供),匀浆后,以12000r/min速度在4℃离心15min,取上清液用于蛋白定量检测(BCA蛋白定量检测试剂盒由普利莱基因有限公司提供)。②SDS-聚炳烯酰胺凝胶电泳(SDS):从上述提取的样品中取出20μg总蛋白,用10%SDS在4℃、20mA条件下进行电泳。电泳结束后,在4℃、400mA条件下将蛋白质从SDS转到硝酸纤维素膜上。③抗体免疫反应:按产品使用说明书使用一抗JNK/p-JNK(购自美国CellSignallingTechnology)、二抗-actin(购自中杉金桥公司)。④化学发光显影及凝胶图像分析:将显影并定影好的胶片进行扫描,用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净吸光度值。1.7统计学处理实验数据以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,用统计学软件SPSS16.0对原始数据进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析和最小显著差法(LSD),P<0.05为差异具有统计学意义的标准。2结果2.1各组患儿的树立次数、越界次数比较由图1和图2可见,造模前,各组间的水平穿越格数和竖立次数的差异无统计学意义(P>0.05)。造模结束后,模型组与空白组相比,水平穿越格数、竖立次数明显减少(均P<0.05);电针组与百优解组水平穿越格数、竖立次数较模型组明显增多(均P<0.05)。空白电针组行为学无明显改变。*P<0.05与空白组比较(vsthecontrolgroup);#P<0.05与模型组比较(vsthemodelgroup).*P<0.05与空白组比较(vsthecontrolgroup);#P<0.05与模型组比较(vsthemodelgroup).2.2电针组ftc由图3可见,模型组海马神经元凋亡率高于空白组及空白电针组(P<0.05);电针组及百优解组凋亡率低于模型组(均P<0.05),且电针组低于百优解组(P<0.05)。在双变量流式细胞仪的散点图上,凋亡细胞FITC染色阳性而正常活细胞染色阴性。左下象限显示活细胞(FITC-/PI-),右下象限显示凋亡细胞(FITC+/PI-),右上象限显示继发性坏死细胞(FITC+/PI+),左上象限显示机械损伤细胞(FITC-/PI+)。由图3可见,右下象限凋亡细胞密度,模型组明显高于其它各组,以电针组最低。2.3对百优解组wagraprcract的预测和检测图4为磷酸化JNK(phospho-JNK)和总JNK的免疫印迹结果,JNK包括JNK1(分子量为46kD)、JNK2(分子量为54kD)和JNK3(分子量为54kD)。各组大鼠海马组织提取物与JNK磷酸化抗体杂交后的蛋白印迹可见,海马组织内只有模型组JNK的磷酸化水平明显增高。用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净吸光度值,算出各组被磷酸化的JNK占总JNK的百分数,并经统计学处理,结果表明,各组大鼠海马组织中JNK磷酸酶活化,模型组高于空白组和空白电针组(均P<0.05),电针组、百优解组均低于模型组(P<0.05)。Leftpanel:scatterplotsofflowcytometryshowingtheapoptoticcellsintherightinferiorquadrant(FITC+/PI-),secondarydeadcellsintherightsuperiorquadrant(FITC+/PI+),livingcellsintheleftinferiorquadrant(FITC-/PI-)indiffe-rentgroups.Rightpanel:histogramsshowingtheapoptoticratesofhippocampalneuronsindifferentgroups(x¯±s).∗P<0.05(x¯±s).*Ρ<0.05与空白组及空白电针组比较(vsthecontrolandcontrol+EAgroups);#P<0.05与模型组比较(vsthemodelgroup);△P<0.05与百优解组比较(vstheProzacgroup).Leftpanel:gelelectrophoresisstripsofWesternblotshowingtheexpressionofhippocampalp-JNKproteinindifferentgroups.Rightpanel:histogramsshowingtheexpressionlevelsofhippocampalp-JNKindifferentgroups(x¯±s).(x¯±s).A:空白组(controlgroup);B:空白电针组(control+EAgroup);C:百优解组(Prozacgroup);D:模型组(modelgroup);E:电针组(EAgroup).#P<0.05与空白组和空白电针组比较(vsthecontrolandcontrol+EAgroups);△P<0.05与模型组比较(vsthemodelgroup).3慢性应激抑郁大鼠海马神经元凋亡本实验采用目前国内外普遍接受的慢性应激抑郁模型,该模型由KatzRJ提出,经Willner等的改进逐渐形成,与人类抑郁症中慢性、低水平的应激源促进疾病发生、加速疾病发展的机制更接近。本实验模型组动物表现出抑郁状态,兴趣丧失,而使用了电针干预和百优解干预之后,大鼠的抑郁状态明显改善。海马是与学习、记忆、行为和情绪密切相关的重要脑区,也是应激损伤的主要靶器官。海马神经元损伤可能是诱发抑郁症的器质性基础之一。应激在抑郁的发病中起关键作用,应激对细胞凋亡和神经再生的损害可以通过抗抑郁药物缓解。AnnexinV/PI双染色法是目前最为理想的凋亡定量检测方法。本实验通过散点图统计结果分析看到,模型组大鼠海马组织的细胞早期凋亡率明显高于其它各组,提示慢性应激抑郁大鼠海马组织细胞存在明显的细胞凋亡现象。而电针组、百优解组大鼠海马组织的细胞凋亡率明显降低,提示电针和百优解干预可在改善慢性应激抑郁大鼠行为学症状的同时减低海马神经元凋亡率。JNK属丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族。MAPK为一类存在于所有真核细胞内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,细胞内的转录因子为其主要的作用底物。JNK的作用底物全部为转录因子,JNK在细胞生长、细胞分化和细胞死亡中起重要作用。MAPK/JNK通路主要由应激刺激所激活。许多研究结果表明,