复元胶囊诱导气虚血瘀证大鼠血管平滑肌细胞凋亡的分子机制研究

复元胶囊诱导气虚血瘀证大鼠血管平滑肌细胞凋亡的分子机制研究

世界上每年有900万人死亡，占所有死亡原因的1.3%。中医早就认识到,心脑血管病“其来也渐,其发也骤,其死也速,其愈也缓”,其病机主要是气虚血瘀,治疗应以益气活血为主。这些认识见于对“心痛”、“胸痹”、“痰饮”、“中风”等疾病的论述。现代研究认为,气虚血瘀是心血管疾病的病机关键。近来有研究报道,在动脉粥样硬化(AS)所引起的心血管疾病可见血管壁中膜层的平滑肌细胞向内膜迁移及过度增殖。血管平滑肌细胞凋亡不足是AS早期发生的重要因素。细胞凋亡是受基因调控的主动性死亡,bcl-2和bax是与细胞凋亡关系较为密切的两种基因。bcl-2和bax比值是决定细胞是否发生凋亡的关键。近来有研究报道,中医用益气活血法防治AS取得可喜成就,其机制与调节血脂代谢,改善血液流变性,抑制脂质过氧化,保护内皮细胞功能等方面有关,但从影响血管平滑肌细胞凋亡的角度研究甚少,。复元胶囊由黄芪、淫羊藿、川芎、当归、枸杞等组成,具有益气补肾活血之功效。通过以往研究证实,复元胶囊通过益气、活血治疗能明显改善气虚血瘀证患者的血液流变学、心脑血流动力学及血管活性物质的失衡状态。本研究旨在原有研究基础上,进一步探讨复元胶囊对气虚血瘀血管平滑肌细胞凋亡的影响,从细胞凋亡分子生物学、基因表达等角度研究复元胶囊作用于气虚血瘀证的可能机制,为更深入的临床研究提供依据,并为中医药在治疗气虚血瘀证的实验研究方面作出有益的探讨。材料和方法1实验材料1.1动物合格号SD大鼠40只,雌雄各半,月龄16月,体重600～800g,重庆医科大学动物中心提供,动物合格证号:SCXK(渝)2007-0001。复元胶囊,重庆希尔安药业有限公司生产,为道地药材(经过专家鉴定和指纹图谱分析),生产批号:070625,每粒含量0.40g。1.2标记检测试验末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)检测试剂盒,购自Boehringermannheim公司。bcl-2,bax蛋白多克隆抗体购自北京中杉生物技术公司。2大鼠的一般情况将大鼠随机分为3组:正常对照组(n=10),模型组(n=15),复元胶囊组(n=15)。模型组、复元胶囊组按王键等制作气虚血瘀证大鼠模型方法造模:①饥饿。大鼠按40g·kg-1·d-1提供饲料,每日8∶00给予全天量的2/3,20∶00给予剩余1/3饲料。②疲劳。大鼠每日14∶00开始分批置入直径50cm,高100cm的水桶内,桶内水深约45cm,水温与室温均保持为(10±0.5)℃。以木棒拨打强迫其不断游泳直到疲劳,时间长短存在个体差异,平均为(10±5)min。③寒湿。游泳后捞出大鼠,不予保温措施及擦拭水迹,关闭门窗任其暴露于空气中自然晾干。④惊慌忧恐。将未游泳大鼠放置水桶旁,任其倾听正在游泳大鼠挣扎叫声。⑤高脂饮食。将特制脂肪乳按5mL·kg-1加人大鼠日常饮水中,脂肪乳配方每500mL由猪油20g,胆固醇10g,胆盐2g,聚山梨酯-8020mL,1,2-丙二醇20mL,用适量蒸馏水配制而成。造模时间为4周。复元胶囊组大鼠给予复元胶囊1g·kg-1(复元胶囊溶于生理氯化钠溶液);模型组和正常对照组给予等容量生理氯化钠溶液,qd,每次灌胃容量为13.3mL·kg-1,喂养1个月。3观测指标3.1免疫组化检测将各组大鼠麻醉后取一侧股动脉血管平滑肌,迅速固定于4%多聚甲醛中,制成石蜡切片,以做凋亡及免疫组化检测。取另一侧股动脉血管平滑肌,迅速固定于10%戊二醛中,置于4℃冰箱保存,备电镜检测各组平滑肌细胞形态学差异。3.2对赫染色的形态观察将石蜡切片脱蜡后切片苏木素一伊红(HE)染色,光镜下观察血管内膜、中膜情况。3.3eli等阳性细胞TUNEL细胞凋亡检测试剂盒,按Gavrieli等所述方法进行。阳性细胞为细胞核出现褐色,即凋亡细胞。计算凋亡指数(SMAI):SMAI/%=阳性细胞数/细胞总数×100。3.4微生物样本的检测股动脉平滑肌细胞bcl-2,bax的表达采用链酶抗生物蛋白-过氧化物酶(SP)染色法,微波修复抗原,二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染,同时作不加一抗而其他条件均相同的阴性对照。胞浆染有棕黄色颗粒者为阳性。采用医学图像分析系统计算每个视野阳性细胞面积占整体面积的百分数。3.5半干活性重质碳酸钙片的制备标本用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗,1%锇酸铀固定后梯度脱水,环氧树脂618包埋,制作超薄切片,用醋酸铀和柠檬酸铅双重染色,HU-12A型电镜观察摄片。4统计学处理统计学分析应用SPSS12.0软件包进行统计学处理。计量资料用x¯±sx¯±s表示,采用one-wayANOVA,并进行两两比较,以P<0.05为差异有显著性。结果1各组大鼠虚假证辨证量表、复元胶囊对大鼠市场的影响模型组大鼠不同程度地出现倦怠嗜睡,精神萎顿,毛发稀疏易脱落等气虚症状,以及舌质较绛紫暗淡、尾部自尖至根出现皮下瘀紫或青斑等血瘀症状。根据大鼠气虚血瘀证辨证量表,模型组大鼠均得分在50分以上。复元胶囊组、正常对照组大鼠几乎没有出现以上症状。根据大鼠气虚血瘀证辨证量表,复元胶囊组、正常对照组大鼠均得分在10分以下。同时,对各组大鼠进行血液流变学检测。结果显示,与正常对照组比较,模型组全血黏度、红细胞聚集指数、红细胞电泳时间均显著升高(P<0.01);复元胶囊组无明显差异(P>0.05)。结果见表1。2复元胶囊组、正常组中膜的增长模型组中膜平滑肌显著增厚,肌纤维粗大,层数增多,排列致密;复元胶囊组、正常对照组中膜平滑肌走行清晰,无增生;弹力纤维未见异常。均无明显增厚现象。结果见图1。3复元胶囊对bcl-2表达的影响胞浆染有棕黄色颗粒者为阳性。模型组的VSMCs中bcl-2蛋白表达阳性率明显高于正常对照组(P<0.01),用复元胶囊治疗后,bcl-2阳性率较模型组明显降低(P<0.05),提示复元胶囊抑制bcl-2蛋白表达;各组VSMCs中bax蛋白表达阳性率无明显差别,然而复元胶囊组表达稍高。bcl-2/bax比值模型组较正常对照组明显增高(P<0.01),复元胶囊组较模型组明显降低(P<0.01),与正常对照组比较无显著差异(P>0.05)。结果见表2,图2,图3。4各组大鼠血管平滑凋亡情况比较阳性细胞为细胞核出现褐色,即凋亡细胞。模型组较正常对照组SMAI明显减少(P<0.01),模型组大鼠血管平滑肌凋亡严重受阻。复元胶囊组与模型组、正常对照组比较,SMAI明显增加(P<0.05)。结果见表2和图4。5小鼠骨髓嗜多染红细胞增殖和复元胶囊组正常对照组主要为正常血管平滑肌细胞;模型组可见代表有细胞增殖的幼稚血管平滑肌细胞;复元胶囊组可见有线粒体肿胀,染色质边集以及核固缩等形态学改变征象。电镜下各组血管平滑肌细胞形态见图5。复元胶囊对大鼠血清中bax、放空率的影响现代研究认为,气虚血瘀倾向是现代人群一个突出的体质病理学特征;从以药测证的角度推论,冠心病的病机关键是气虚血瘀,因为应用益气活血中药治疗动脉粥样硬化相关疾病取得良好的临床效果;同时气虚血瘀证的病理变化主要表现在内皮功能障碍,这同时也是AS的启动步骤。因此我们推断,气虚血瘀是心血管疾病的病机关键。近来有研究报道,活血化瘀治疗冠心病的作用机制不仅限于传统意义上的活血通脉,它不仅具有调整脂质代谢失调、抗氧自由基损伤,减轻缺血再灌注损伤、抗凝作用,而且还具备保护血管内皮细胞、调节血管平滑肌细胞凋亡的作用。在动脉粥样硬化所引起的心血管疾病可见血管壁中膜层的平滑肌细胞向内膜迁移及过度增殖。AS早期,VSMC的增殖与凋亡失衡造成了VSMC数量的过度增加,因而,调整平滑肌细胞增殖与凋亡的平衡,维持血管壁细胞数目稳定在正常水平是治疗AS的重要途径。bcl-2原癌基因产物主要存在于线粒体膜和核膜的蛋白质,抑制细胞凋亡。而与其相对的基因bax则抑制细胞生长,促进凋亡。它们需构成二聚体结构才能发挥作用。bcl-2同源二聚体及bax异源二聚体参与抑制细胞凋亡调控,只有bax同源二聚体促进细胞凋亡,因此bcl-2/bax比值是决定细胞是否发生凋亡的关键。本实验采用饥饿、寒冷、惊恐、高脂饮食等方法制作气虚血瘀证大鼠模型。造模方法人工模拟了以下可导致气虚的因素:①“人过四十,阴气自半”。中年以后肺脾肾等五脏渐衰,故选择老年大鼠使之本身具有气虚衰弱之体质。据载,大鼠月龄16个月相当于人类45～60岁,与临床气虚血瘀证高发年龄段一致。②“饥则损气”。长期慢性饥饿可导致以脾胃气虚为主的全身性气虚表现。③“劳则耗气”。强迫大鼠游泳,使之产生疲劳可耗气伤精,劳累之后更加纳呆食差。④“湿伤脾,寒伤肾”。游泳水温及室温均低于大鼠体温,且泳后不予保温措施和擦拭水迹,则通过寒、湿两种致病因素导致脾、肾二脏损伤。⑤“忧思伤脾,惊恐伤肾”。任大鼠倾听同类在水桶中游泳挣扎声响,使其产生忧虑与惊恐的情绪,表现为全身颤抖,四肢蜷缩或躁烦乱窜,具有七情内伤作用。⑥“肥甘厚味易致高粱之疾”。在以上基础上给予大鼠饮用脂肪乳,有助于形成心、脑血管病的高危因素如高脂血症,动脉粥样硬化,血液稠黏,内皮功能障碍等。中医理论认为肥甘厚味滋腻碍胃而伤脾,又可助生痰湿导致瘀血证的发生,故具有促进气虚与血瘀的双重作用。另寒湿等致病因素有利于血瘀证的形成。并与气虚血瘀夹杂,形成气虚、血瘀、寒凝的证侯。在本实验中,模型组与正常对照组相比较,HE染色可见血管平滑肌细胞内膜及中膜平滑肌显著增厚,肌纤维粗大,层数增多,排列致密。SMAI减少,bcl-2蛋白表达、bcl-2/bax增加,显示模型组的VSMC增殖和凋亡严重失调,而复元胶囊组与模型组相比,中膜平滑肌走行清晰,无增生;弹力纤维未见异常,无明显增厚现象。SMAI增加,bcl-2表达减少、bcl-2/bax下降,提示复元胶囊能改善气虚血瘀证VSMC的这种平衡失调,改变了bcl-2/bax表达比率,诱导细胞凋亡的增加。本研究中发现虽然复元胶囊组大鼠bax上调不明显,但bcl