基于超声成像技术的人桡骨骨内三维结构的研究

基于超声成像技术的人桡骨骨内三维结构的研究

自然骨骼中存在复杂的微管结构，通过微管结构进行保障血液和养分循环，并维持骨的生长和重建。本研究利用连续切片—图像反求建模三维重构的方法重构了皮质骨三维显微结构模型,针对重构过程中关键的图像配准问题,采取了软硬件结合的方法,得到图像配准,采用Mimics软件将其转换至三维空间,利用I-DEAS将点云模型构建为实体模型。最后对实体模型进行测量,计算出微管空间形态数据。本研究得到哈佛氏管以及福克曼管的空间特征,可以指导人工骨内微管结构的设计,对仿生骨研究和使人工骨技术由仿形走向仿生具有重要意义。由于受研究条件的限制,此类研究国内外报道极少。材料和方法一、显微镜电路人桡骨中段,由第四军医大学西京医院提供,为教学标本,经75%酒精浸泡保存。主要硬件:LEICASP1600型切片机、KEYENCEVH-Z450型显微镜,放大倍率×25～×3000,显示屏分辨率1620×1220。显微镜自带操作系统以及图像处理软件,可完成长度、角度等测量。主要软件:Osiris(日内瓦大学医院开发)、MATLAB(MathWorks公司开发)、Mimics(Materialise公司开发)、I-DEAS(EDS公司开发)。二、方法1.甲基丙烯酸甲酯片制备取20mm长桡骨标本,用油石、1200#金相砂纸研磨出三个沿骨长轴方向的定位面(图1)。标本脱水后抽真空(-0.64大气压)6h,将浸塑(甲基丙烯酸甲酯)后的标本放入直径10mm、高30mm的玻璃容器中,注入包埋介质。容器置于60℃热水中水浴3h,经过聚合反应,完成包埋。使用LEICASP1600型切片机制作切片。切片间距400μm。2.3d重建(1)旋转与平滑模式显微镜拍摄切片图像,放大倍率×175。在切片以及图像获取过程中,切片位置会有变化,主要为旋转与平移,共需调整3个自由度。利用MATLAB图像处理工具箱提供的函数以及定位点可完成图像配准工作。利用cpselect()函数,在相邻两幅图像中,选择两对对应定位点作为控制点。微调控制点,确定图形变换参数,完成图像配准(图2)。(2)划分边界时的图像进行调整利用Osiris软件划分哈佛氏管以及福克曼管。在哈佛氏管内部选取一点,指定灰度阈值,Osiris软件自动划分哈佛氏管边界。划分前后两幅图像相减,得到边界。为方便后续图像处理,将边界二值化。由于划分边界所用图线颜色在某些区域可能与其覆盖的颜色接近,图像二值化后,边界可能是不封闭的。使用imdilate()函数将图像放大,封闭边界。结构元素使用垂直与竖直,长度为2个象素的线段。最后填充图像(图3)。(3)维模型的建立将经过配准以及分割的图像按照切片顺序导入Mimics软件。Mimics需要切片间距以及象素尺寸作为参数,按照正确比例重构三维模型。其中切片间距为0.4mm;二维图像进行处理后,图像尺寸为1620×1220象素,KEYENCE显微镜测量的图像尺寸为1982.38×1492.60μm,因此象素实际尺寸为1.2237×10-3mm。设定图像方向并选择mask颜色后,Mimics根据二维图像计算三维模型。Mimics图像观察、测量均不方便,因此将图像输出为IGES格式(图4)。骨内微管结构的提取利用人桡骨标本进行切片,行显微镜拍摄,得到图像,经过配准以及分割,然后建模得到的三维显微结构真实地反映了人桡骨的骨内微结构,我们将其中一些重构比较完全的微管结构提取出来(图5),根据三维模型直接行形态数据测量,结果见表1。讨论一、连续切片-三维重构技术三维重构主要有两类方法:无损成象技术和连续切片-三维重构技术。其共同点是首先获取标本的连续截面图像,然后将二维图像重构为三维实体模型。对于无损成象技术,目前只有显微CT(microCT,μCT)可以达到微米级的分辨力,但国内显微CT分辨力不高,(清华大学的为40μm),难以分辨平均直径仅为50μm的哈佛氏管、福克曼管。所以我们采用连续切片-三维重构技术,其基本步骤为连续切片、获取切片图像、图像配准、三维重构。对于连续切片-三维重构来说,图像配准是关键问题,因为在制片或者图像采集过程中,数字序列图像每两层之间都存在错位现象,即旋转、平移等变形。本研究利用切片前制作的定位基准以及MATLAB的图形处理工具箱提供的图像配准函数,通过选择控制点(定位点)完成图像配准,就可以达到定位效果。通过连续切片-三维重构技术建模可得到比较完整的哈佛氏管。二、结构的角度与大小由于切片厚度太大,也就是采样间隔过大,导致信息丢失严重。一些哈佛氏管找不到相邻切片中的对应组织,在实体模型上的表现是有块状或者短条实体存在,而不是完整的哈佛氏管。当然模型边缘部分的块状有可能是在某个切片进入视野而后穿出,但是从重建的三维结构上,我们可以看到哈佛氏管走向基本平行于骨长轴,但也不是简单柱体,不同截面有形状、位置变化。通过三维结构,我们可以看到哈佛氏管在远离连通处夹角较小,绝大部分在0～10°之间,平均为5.7°。在连通处附近(400～800μm)夹角为5°～15°,甚至有20°～25°的夹角,平均夹角为12.2°。可见,哈佛氏管的走向并非处处一致。在远离福克曼管或者分支处,哈佛氏管接近平行。但是在接近分支的位置附近,哈佛氏管相互接近(夹角增大)。这种结构减小了起连通作用的福克曼管的长度,增大了哈佛氏管与福克曼管在连通处的角度。这将减小体液流经福克曼管的阻力,有利于骨内物质交换。哈佛氏管在连通处发生弯曲,相互接近,一方面降低了哈佛氏管之间体液流动的阻力,另一方面增大了单一哈佛氏管内流动阻力(弯曲管道流动阻力大于直管);哈佛氏管长径较大,减小了骨内单位长度的流动阻力,却对哈佛氏管之间的流动产生影响(体液倾向于沿阻力小的路径流动,而流向福克曼管的阻力大于沿哈佛氏管继续流动)。可见,哈佛氏管走向以及哈佛氏管长度是一对影响体液流动性的矛盾因素。在人工活性骨的设计中,可以参考自然骨的形态,控制这两个参数,产生最好的综合流动性。三、人工活性骨的优点骨骼是人体的支撑结构。对于轻微的骨损伤,骨组织具有自身修复的能力,但对于大段骨缺损,如骨肿瘤术后,骨自身难以完全修复,目前应用较多的是人工假体和高分子材料,具有较好的强度和可加工性,但在应用中存在很多问题。骨组织工程使用的支架材料(聚合物、复合材料、胶原、生物陶瓷等)所能控制的参数只有孔隙率以及大致孔径,整体结构基本是随机的,生物活性物质(生长因子、骨细胞)、组织液难以渗透到大段人工骨深部,临床上也难以直接应用。人工活性骨是比较理想的修复大段骨缺损的替代物,有如下优点:(1)来源广泛,价格低廉;(2)无抗原性或抗原性甚微;(3)可根据需要将植入物制成精确的三维形状;(4)产品易于控制和标准化,保证质量稳定。对于人工骨,微管结构是新骨长入的必备条件。没有微管结构或者微管设计不合理,骨细胞就难以长入,新骨无法形成,因此,目前研究人工活性骨的一个基础性问题是人工骨内部的显微结构的设计。密质骨内部是多孔的,其中占主导地位的是哈佛氏管(Haversiancanal)和福克曼管(Volkmanncanal)。体液从血管流经哈佛氏管、福克曼管,到环绕骨细胞的骨陷窝、骨小管,以及骨基质内的微小裂纹,为骨细胞运输代谢物,为其提供良好的生长环境,使其不断增殖。而哈佛氏管和福克曼管的直径、长度、间隔,福克曼管与哈佛氏管相交的角度、相对位置等几何参数对血液在各个哈佛氏管内的输送是否顺畅、骨各部位是否都能得到充分的营养供应、骨髂的孔隙率以及硬度、骨细胞