长链神经毒素对大鼠丘脑束旁核神经元痛诱发放电的影响

长链神经毒素对大鼠丘脑束旁核神经元痛诱发放电的影响

根据研究，蛇毒具有抗凝、溶凝、止血、抗炎、肿瘤和排泄反应等作用。国外曾有报道,蛇毒在晚期癌症治疗中有良好的镇痛效果。多种蛇毒具有镇痛作用,包括蝰蛇、响尾蛇、眼镜蛇、银环蛇、蝮蛇毒等。1990年Chen和Robinson从眼镜蛇(Najanajaatra)毒中分离出的短链神经毒素Cobrotoxin具有镇痛作用,应用于临床并不出现成瘾性和耐药性,并且镇痛效果比吗啡持久。目前眼镜蛇毒的长链神经毒素Cobratoxin也已提纯。本研究团队利用行为学方法已经发现,Cobratoxin同样具有明确的镇痛效果。为了进一步验证Cobratoxin的镇痛效果,并为研究其作用机制打基础,本实验以丘脑束旁核(thalamicparafascicularnucleus,Pf)痛敏神经元单位放电为指标,观察了侧脑室注射不同剂量Cobratoxin对痛放电频率的影响。现报道如下。1材料和方法1.1大鼠分组实验成年雄性Wistar大鼠90只,体质量180~250g,由苏州大学医学部实验动物中心提供。90只大鼠分为以下6组(每组6只):(1)正常对照组;(2)生理盐水组;(3)吗啡组;(4)大剂量Cobratoxin组;(5)中剂量Cobratoxin组;(6)小剂量Cobratoxin组。1.2试剂制备方法水合氯醛(上海医药集团上海化学试剂公司)、Cobratoxin(ReceptogenInc)、吗啡(沈阳第一制药厂)、滂胺天蓝(SchmidGmbh&Co)等试剂。立体定位仪(Narishige)、分析天平(上海分析天平厂)、冰冻切片机(浙江金华市科迪仪器设备有限公司)、微电极放大器(NihonKohden)、双线记忆示波器(NihonKohden)、生物信号传递系统(上海医科大学生理学教研室)、ALC-V8动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司)、步进马达(Narishige)、微电极拉制仪(中科院上海生理研究所)等设备仪器。1.3鼠脑图谱pf大鼠以4%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉,分离右侧坐骨神经,以电刺激作为伤害性刺激。行气管插管,并将动物固定在立体定位仪上。根据Paxinos&Watson大鼠脑图谱,确定Pf的坐标和侧脑室给药部位。用三碘季铵酚(60mg/kg)制动,并维持人工呼吸。刺激电极为由镍铬丝制成的双极保护电极,刺激参数为:双脉冲方波,间隔10ms,波宽0.5ms,强度20~25V,每5.5s刺激1次。记录电极为玻璃微电极,内充2%滂胺天蓝和0.5mol/L醋酸钠,尖端直径≤1μm,阻抗10~20MΩ,用步进马达推进至脑表面下4.8~7.5mm处进行细胞外记录,信号经微电极放大器放大后,在双线示波器上显示,再经SUMP-PC输入计算机,做序列密度直方图(叠加10次)。1.4给药方法生理盐水、吗啡和不同浓度的Cobratoxin都经侧脑室注射,并分别在给药前和给药后5、10、20、30min时记录痛诱发单位放电。1.5天气形貌测定实验结束后,标记记录部位。玻璃微电极的末端接负极,大鼠头皮接正极,通直流电(20μA)10min,在记录电极尖端泳出滂胺天蓝;经侧脑室套管注入2μl滂胺天蓝溶液。然后直接断头取脑,在4%多聚甲醛中固定,次日做连续冰冻切片,观察蓝点是否在Pf内,侧脑室内有无蓝色残留。1.6兴烈性单位cr1.32用伤害性刺激前后1s平均放电频率的差值为变量单位。兴奋性反应采用临界比值标准:CR=(E-S)/E+S(E和S分别为相同单位时间内的诱发放电数和自发放电数,CR﹥1.96为兴奋性单位)。实验数据以表示,运用SPSS10.0统计软件和MicrosoftExcel2003进行方差分析和t检验,并制成统计图。2结果共记录了157个细胞,经组织学鉴定,记录电极尖端位于Pf内(图1)。2.1自发放电pf神经元157个单位放电中出现自发放电的有153个(占总数的97.5%),无自发放电但能诱发放电的有4个(占2.5%)。这表明绝大多数Pf神经元都有自发放电。自发放电主要有以下两种类型:(1)单脉冲放电:放电频率快慢不均,慢时几秒钟1次,快时1s可达10余次,甚至50余次,但是大多数频率中等,约5Hz(图2A)。这种类型的放电有124个(占79.0%)。(2)簇状放电:通常以3~5个脉冲成簇,簇间脉冲间隔不等,簇与簇的间隔也不等(图2B)。这种类型的放电有33个(占总数21.0%)。2.2pf兴奋刺激和外部周围刺激的三种不同反应2.2.1疼痛的特定机制此类神经元对伤害性刺激起反应,而对刷毛、轻触和抚摸等非伤害性刺激无反应。在157个单位中,此类神经元有98个(占62.4%)。2.2.2非伤害性刺激反应此类神经元除对伤害性刺激起反应外,也对非伤害性刺激起反应,但反应程度以伤害性刺激时最大。在157个单位中,这类神经元有47个(占29.9%)。2.2.3非损伤性感觉唤醒此类神经元仅对非伤害性刺激起反应,而对伤害性刺激无反应。在157个神经元中,此类神经元有12个(占7.7%)。2.3痛兴反应及放电频率Pf神经元对伤害性刺激一般出现以下3种反应:(1)痛兴奋反应:表现为伤害性刺激后,神经元的放电频率明显增加(图3A)。这种类型的放电有116个(占73.9%)。痛兴奋反应的持续时间大多数在1s左右,但也有超过2s和短于1s的(图3b、3c、3a)。(2)痛抑制反应:表现为伤害性刺激后神经元的放电频率减少甚至停止(图3B)。这种类型的放电有29个(占18.5%)。(3)痛无关反应:表现为伤害性刺激前后的放电频率无明显改变(图3C)。这种类型的放电有12个(占7.6%)。本实验选取仅对伤害性刺激有反应的痛兴奋神经元进行实验。2.4侧脑室注射大剂量co-toxin对pf神经元痛放电的抑制作用侧脑室注射生理盐水、吗啡及不同剂量Cobratoxin后Pf神经痛放电频率的变化见图4、5。侧脑室注射生理盐水2μl后5、10、20、30min,Pf神经元痛放电频率与注药前相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。侧脑室注射吗啡(40μg/4μl)后5min,Pf神经元痛放电频率明显降低;10min降到最低,差异有统计学意义(P<0.05));20min有所恢复;30min基本恢复到注药前水平。侧脑室注射大剂量Cobratoxin(4.5μg/kg)后5min,Pf神经元痛放电频率开始下降,10minPf神经元痛放电频率明显下降,20min和30min放电频率进一步下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。这表明侧脑室注射大剂量Cobratoxin对Pf神经元痛放电有明显的抑制作用。这种抑制作用在给药后5min左右起作用,在10、20min作用进一步增强,30min达到作用最高蜂。侧脑室注射中剂量Cobratoxin(1.12μg/kg)后10min,Pf神经元痛放电频率开始明显下降,20min进一步降低达最低峰。这表明侧脑室注射中剂量Cobratoxin对Pf神经元痛放电亦有明显的抑制作用。侧脑室注射小剂量Cobratoxin(0.56μg/kg)后10、20、30min,Pf神经元痛放电频率也都明显低于生理盐水对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。这表明侧脑室注射小剂量Cobratoxin对Pf神经元痛放电亦有明显的抑制作用。Cobratoxin对Pf神经元痛放电的抑制具有剂量依赖性。在注药后5min和10min,大、中、小3种剂量Cobratoxin对痛放电频率的抑制作用的差异无统计学意义(P>0.05)。注药后20min,大、中剂量组对痛放电频率的抑制比小剂量组显著;注药后30min,大剂量组对痛放电频率的抑制最显著,差异均有高度统计学意义(均P<0.001)。将Cobratoxin对Pf神经元痛放电的抑制时程与吗啡的抑制时程进行比较,发现在给药后20~30min时,吗啡的抑制作用已经恢复,而Cobratoxin的抑制作用还十分明显(图5),说明Cobratoxin的抑制作用时间比吗啡的长。3cobrotoxin的诊断作用在研究痛觉调制所采用的指标中,常用的主要有两个,一个是痛的行为反应,另一个是伤害性感受神经元的放电反应。痛觉最重要的整合中枢是丘脑。丘脑束旁核在内髓板内,位于中央中核内侧,与中央中核一起被合称为中-旁复合体,是公认的痛觉整合的关键位点,和生理及病理条件下的痛觉都密切相关。以束旁核痛放电为指标的电生理方法已经成为研究痛觉的经典方法之一。早期的行为学实验证实,提纯自Najanajaatra的眼镜蛇短链神经毒素Cobrotoxin具有镇痛作用。我国也早在20世纪80年代即发现眼镜蛇毒神经毒素具有镇痛作用。但由于眼镜蛇毒成分复杂,功能多样,短链的神经毒素Cobrotoxin可能仅是眼镜蛇毒素镇痛物质中的一种。新分离的长链神经毒素Crobratoxin值得关注。有研究发现,向大鼠腹腔或侧脑室注射Cobratoxin