分子生物学-细胞凋亡课件

1细胞凋亡（apoptosis）23一、细胞凋亡的总论1．

凋亡概念的形成

1965年，Kerr发现，结扎鼠门静脉后，电镜观察到肝实质组织中有一些细胞体积收缩、染色质凝集。这些细胞从其周围的组织中脱落并被吞噬且机体无炎症反应。451972年Kerr、Wyllie和Currie首次提出了细胞凋亡(Apoptosis)

的概念。Apoptosis一词来源于希腊，原意指秋天树叶的凋落以及花瓣的散落，其语源是apo(off,离去之意),ptosis(falling，凋落之意）。

KerrJFR,WyllieAHandCurrieAR.Apoptosis:abasicbiologicalphenomenonwithwide-rangingimplicationsintissuekinetics.

BrJCancer1972;26:239-257被引用了9000多次。6细胞凋亡一词出现之前的1965年，Lockshin等在研究蛾的变态发育过程中已发现存在着细胞程序性死亡（Programmedcelldeath，PCD）现象。

7在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。例如蝌蚪变成青蛙，其变态过程中尾部的消失伴随大量细胞死亡，高等哺乳类动物指间蹼的消失、颚融合、视网膜发育以及免疫系统的正常发育都必须有细胞死亡的参与。这些形形色色的在机体发育过程中出现的细胞死亡有一个共同特征：即散在的、逐个地从正常组织中死亡和消失，机体无炎症反应，而且对整个机体的发育是有利和必须的。因此认为动物发育过程中存在的细胞程序性死亡是一个发育学概念。

8细胞凋亡在鸭和鸡的脚的形态发生中的作用9细胞凋亡在非洲爪蟾发育过程中尾巴消失中的作用溶酶体中cathe-pasin酶的浓度102002年10月7日英国人悉尼·布雷诺尔、美国人罗伯特·霍维茨和英国人约翰·苏尔斯顿，因在器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔生理或医学奖。

11悉尼·布雷诺建立了美丽线虫（Celegans）模型。约翰·苏尔斯顿发现雌雄同体的美丽线虫在发育成熟过程中，1090个体细胞中必定有131个细胞死亡。说明线虫的每个细胞的位置、分裂与命运都是由遗传决定的程序所精确地预先确定的。罗伯特·霍维茨发现了控制细胞凋亡的第一个基因Ced-3。1213S.Brenner.THEGENETICSOFCAENORHABDITISELEGANS

Genetics,1974;77:71-94.被引用了4800多次。J.E.SulstonandS.Brenner.THEDNAOFCAENORHABDITISELEGANS,Genetics,1974;77:95-104.JYuan,SShaham,SLedoux,HMEllis,andHRHorvitz.

TheC.eleganscelldeathgeneced-3encodesaproteinsimilartomammalianinterleukin-1beta-convertingenzyme.

Cell,1993;75(4):641-52142．细胞凋亡的概念细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序死亡。

3．细胞凋亡的生理意义1）组织分化、器官发育

2）免疫耐受3）损伤和衰老细胞的清除15二、细胞凋亡的形态学及生化特征1．细胞凋亡的形态学特征1）往往涉及单个细胞。凋亡细胞连接消失，与周围的细胞脱落。2）细胞体积变小，细胞质浓缩。3）胞膜结构完整，有泡状突起。4）细胞核染色质浓缩，聚集核膜周围。5）在胞浆中出现由降解的胞浆和胞核成分包裹于膜性成分中形成的凋亡小体(Apoptoticbodies)。6）无内容物外溢，因而不引起周围的炎症反应。

1617正常T细胞 凋亡T细胞 电镜照片凋亡细胞的形态特征细胞形状改变染色质凝聚、分块胞质皱缩182．细胞凋亡的生化特征1）染色质DNA断裂,形成180~200bp整数倍的DNA片段。2）细胞内活性氧分子增多、胞浆钙离子升高。3）膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面

4）线粒体膜电位消失，膜通透性变大。

1920

ControlTUTU+IGFBATU+IGFControlTUMarkerZouetal.Endocrinology2009213．细胞凋亡与细胞坏死的区别

细胞凋亡细胞坏死细胞形态皱缩肿胀胞浆浓缩肿胀胞膜

完整、泡状受损核染色质浓缩聚集核膜周围染色质不规则移位DNA断裂方式在核小体间整倍性断裂不规则结局凋亡小体崩溃诱导原因

生理或病理病理基因调控

++(?)炎症反应无有2223细胞凋亡与细胞坏死的区别24252627细胞死亡方式角质化自噬284．细胞凋亡与细胞程序性死亡的区别

——PCD是个功能性的概念，描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中,一个预定的并受到严格程序控制的正常组成部分。——

细胞凋亡则是一个形态学的概念，描述一件有着一整套形态学特征的与坏死完全不同的细胞死亡形式。

29第二节常用的细胞凋亡检测方法一、细胞凋亡的形态学检测1.光学显微镜和倒置显微镜302.荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜313.透射电子显微镜观察3233二、流式细胞仪——磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）3435三、DNA片断化检测36四、TUNEL法37五、凋亡相关因子检测1、caspase3检测12、其它因子检测（1）免疫组化（2）QPCR（3）Westernblot3839404142细胞凋亡的过程：第三节细胞凋亡的信号转导途径接受凋亡信号凋亡调控分子间的相互作用Caspase激活和级联反应死亡底物的活化细胞凋亡43细胞凋亡信号通路44细胞凋亡信号转导的两大途径：○

由死亡受体(Fas、TNFR）介导的外源途径。在这条途径中，启始caspase-8首先被激活；○

线粒体介导的内源途径。在这条途径中，启始caspase-9首先被激活。细胞凋亡后期的共同途径：□

效应Caspase的激活

4546一、Caspase是凋亡的执行者

Caspase

(Cysteinylaspartate-specificprotease)：在特异的天冬氨酸之后切割靶蛋白的一类进化上保守的半胱氨酸蛋白酶。471．Caspase家族特征

Caspase通常以酶原（Pro-caspase）的形式存在.

N末端具有一个原结构域（Pro-domain），C端同源区存在活性位点。

Caspase酶原包含约20kD的结构域和约10kD的结构域。Prodomainp20

p10

ActivesiteＮＣ482.Caspases的分类根据在细胞凋亡中起的作用，Caspases分为两大类：启始Caspase(Initiator)和效应Caspase(Effector)1）启始Caspases包括-2，-8,-9,-10等，对细胞凋亡的刺激信号作出反应，启动细胞的凋亡过程；2）效应Caspases包括-3，-6，-7等，是在细胞凋亡过程中的具体执行者，完成对特定蛋白底物的水解。

493．Caspase激活的机制去除N端原结构域；在大小亚基中进行切割；大小亚基形成异源二聚体，进而形成四聚体。活性酶就是由这两种亚基以(P20/P10)2的形式组成的

Prodomainp20

p10

ActivesiteＮＣ504．Caspase激活的方式

1）启始Caspase激活（同源激活）Caspase-8的激活Caspase-9的激活2）效应Caspase激活（异源激活）51

i）Caspase-8的激活(Caspases-2,-10)死亡受体与配体结合后，死亡受体三聚体化。通过DD区（Deathdomain）的蛋白质-蛋白质相互作用，死亡受体与接头蛋白FADD（Fas-associateddeathdomain）结合，形成DISC（Death-inducingsignalingcomplex）。通过FADD的DED区(Deatheffectordomain)，Procaspase-8

被募集在DISC上。聚集后Procaspase-8，通过自身或相互之间的切割产生成熟的Caspase-8。52Procaspase-8的激活过程53ii）Caspase-9的激活

细胞色素c

（Cytochromec）从线粒体释放。通过Apaf-1(Apoptoticproteaseactivatingfactor-1)的WD40结构域，细胞色素c和Apaf-1结合。通过Apaf-1的CARD

（Caspaseactivationandrecruitmentdomain）结构域，Apaf-1形成七聚体。通过各自的CARD结构域，Procaspase-9被募集到细胞色素c/ATP/Apaf-1

组成的凋亡复合体（Apoptosome）而水解激活。54Caspase-9的激活过程Caspases激活的级联反应

552）效应Caspase的激活（异源激活）

效应Caspases不象启始Caspases

，不能被募集到或结合DISC或凋亡复合体上，它们必须依赖启始Caspases才能活化。

565．Caspase的效应机制

激活的Caspase可以水解约100个底物，包括细胞调节、细胞信号转导、DNA修复、组织平衡、细胞存活等环节中重要的蛋白，从而使细胞表现为凋亡特有的形态学及生化特征：细胞皱缩、断裂，染色质聚集，DNA降解，以及随后的凋亡细胞被吞噬细胞迅速地清除等。571）凋亡抑制物的水解。例如：ICAD是CAD核酸酶（Caspases-activatedDNase）的抑制蛋白，而CAD核酸酶可以造成凋亡时DNA的片段化。在正常情况下，CAD不显示活性是因为CAD-ICAD，以一种无活性的复合物形式存在。细胞凋亡时，Caspases水解ICAD，CAD就会处于活性状态并最终使DNA片段化。58Caspase：Cysteine-dependentaspartateproteasesCAD：

Caspase-activateDNasePARP：Poly（ADP-ribose）polymerase细胞凋亡的DNA降解592）细胞结构的破坏。例如：核纤层是由核纤层蛋白（Lamina）通过聚合作用而连成头尾相接的多聚体，形成核膜的骨架结构，使染色质得以形成并进行正常的排列。Caspase水解核纤层蛋白之后，导致细胞染色质的固缩。

60613）调节蛋白丧失功能。

例如：凝胶溶胶蛋白（Gelsolin）可以使肌动蛋白（Actin）凝胶状态变为溶胶状态。Caspase水解凝胶溶胶蛋白而产生片段，使之不能通过肌动蛋白纤维来调节细胞骨架。4）Caspase还可以影响DNA修复、mRNA剪接、DNA复制等重要过程中的蛋白。

62综上所述，Caspase以一种有序的的方式对细胞进行“破坏”，通过切断细胞与周围的联系，拆散细胞骨架，阻断细胞DNA复制和修复，干扰mRNA剪切，损伤DNA与核结构，从而使细胞降解为凋亡小体。因此，Caspase在细胞凋亡过程中的作用处于中心地位。

63二、死亡受体介导的凋亡途经

死亡受体均属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族，可与相应的配体（Ligand）结合后。主要包括:Fas/FasL、TNFR/TNF、TRAILR/TRAIL。

641．Fas/FasL系统1）Fas/FasL

蛋白：Fas又称CD95或凋亡蛋白-1(Apo-1)，分子量约为43kD。胞浆部分含有70个左右对于凋亡不可缺少的氨基酸序列，即DD区。FasL分子量约40kD。

2）分布：Fas表达比较广泛，胸腺、心脏、肝、肺、肾和卵巢等都有表达。FasL通常只出现于活化的T细胞和NK细胞。653）Fas诱导凋亡的途径：

Fas-FADD-Caspase-8

FasL与Fas结合后，Fas三聚体化。通过DD区的相互作用，Fas与FADD结合，形成DISC。通过FADD的DED区，Procaspase-8被募集在DISC上。聚集的Procaspase-8，通过切割产生成熟的Caspase-8。66

Fas/FasL信号途径672．TNFR/TNF系统1)TNFR和TNF蛋白TNFRI又称为TNFR55，分子量约为55-60kD。TNFRII又称为TNFR75，分子量约为75-80kD。TNFRI与TNFRII在胞膜外区有28%的同源性，在胞浆区没有同源性。TNFRI在胞浆区有一个约80个氨基酸的DD区，TNFRII没有同样的结构域。68TNF-

又称恶液素(cachectin)，成熟的人TNF-

有157个氨基酸，约17kD。TNF-

又称淋巴毒素a(Lmyphotoxin

,LT-

)，成熟蛋白长171个氨基酸组成，分子量25kD。2）分布：TNFRI和TNFRII分布十分广泛，几乎存在于所有有核细胞表面。693）TNFRI诱导凋亡的途径：TNFRI-TRADD-FADD-Caspase-8TNF与TNFRI结合后，TNFRI三聚体化。通过DD区的蛋白质-蛋白质相互作用，TRADD(TNFreceptor-associateddeathdomainprotein)不但可以结合TNFRI的胞浆区，也可以结合FADD的C-端部分。通过FADD的DED区，Procaspase-8被募集在DISC上。聚集的Procaspase-8，通过切割产生成熟的Caspase-8。70TNFR/TNF信号途径713.TRAIL/TRAILR系统TRAIL和TRAILR蛋白TRAIL，又称凋亡蛋白2配体（Apo2ligand),分子量32kD。TRAIL最显著的特征就是能够选择性杀伤肿瘤细胞而对大多数正常细胞没有明显毒性。第一个发现的TRAIL受体—DR4，成熟蛋白有445个氨基酸。在C端的胞浆区有DD区。另一种TRAIL受体—DR5，成熟蛋白有394个氨基酸。胞浆区有DD区。722）DR4和DR5的分布：在正常和肿瘤细胞中，DR4和DR5分布非常广泛，包括脾、肝、肺、胸腺和外周血白细胞、活化T细胞以及一些肿瘤细胞系都有它们的表达。3）DR4和DR5诱导凋亡的途径：TRAILR-FADD-Caspase-873三、线粒体介导的凋亡途经线粒体不仅是细胞能量代谢的中心，而且在起源于细胞内部的死亡信号所诱导的细胞凋亡中处于中心位置。这些细胞内部的死亡信号源自各种因素，如DNA损伤、氧化压力、X-射线、化疗药物、营养缺乏等等。因而，线粒体所介导的凋亡途径又称为细胞凋亡的内源途径，其过程大致如下：741．线粒体跨膜电位（△

）的消失和线粒体渗透转运孔（PTP）的开放

在正常细胞中，由于呼吸链中的质子和电子的转移而在线粒体膜两侧产生了电位，该电位促使了ATP的形成。线粒体膜上的PTP，是位于线粒体外膜间由多个蛋白质组成的复合孔道，调节着线粒体基质和胞质中的离子和蛋白因子的转运。当PTP不可逆的高水平开放时，使分子量小于1.5kD的物质可以通过线粒体内膜，导致△

不可逆的下降。752.细胞色素c从线粒体中的释放和Caspase-9的激活细胞色素c是14kD蛋白，正常情况下定位在线粒体内膜空间。当细胞色素c从线粒体释放后，能与Apaf-1、Procaspase-9结合在一起形成凋亡体复合体（Apoptosome），导致Caspase-9的水解激活。LiuX,KimCN,YangJ,JemmersonR,WangX.Inductionofapoptoticprogramincell-freeextracts:requirementfordATPandcytochromec.Cell.1996;86:147-157

被引用了3000多次。76线粒体还可释放其它介导细胞凋亡的分子：AIF（Apoptosis-inducingfactor）、Smac/DIABLO、Omi/HtrA2。

77线粒体介导的凋亡途径78四.颗粒酶(granzyme

)/穿孔素(perforin)诱导的凋亡途径细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在杀死肿瘤细胞和病毒感染的细胞时,通常释放颗粒酶和穿孔素.79颗粒酶和穿孔素的作用机制80

第四节重要的凋亡调控基因细胞凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，Caspase家族、Bcl-2家族、抑癌基因p53、IAP家族等。81一、Bcl-2基因家族

B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-celllymphoma/leukemia-2gene,Bcl-2)，是1984年研究B细胞白血病和非何杰金滤泡性淋巴瘤中高发的t(14∶18)染色体易位时发现的。82Bcl-2家族成员分为两类：

抗细胞凋亡，如Bcl-2、Bcl-xL、Al、Bcl-w、Mcl-1。在这类分子中，都有Bcl-2同源区1-4(Bcl-2homologydomains，BH1-BH4)的结构。促进细胞凋亡。在这类分子中，又分为两个亚族：①Bax亚族，如Bax、Bak、Bok，有BH1、BH2和BH3的结构；②BH3-only亚族，如Bik、Bad、Bid、Bim，只有BH3的结构。83Bcl-2基因家族的结构特征

841．Bcl-21988，Vaux等在依赖IL-3的B淋巴细胞中发现，转染Bcl-2基因能够阻止剥夺了IL-3的B细胞的凋亡。因而，Bcl-2是第一个被发现的靠阻止细胞死亡而非促进细胞增殖起作用的癌基因。Bcl-2抗凋亡作用的机制：通过与促凋亡蛋白相互作用而抑制细胞凋亡。DLVaux,SCory,andJMAdams.Bcl-2genepromoteshaemopoieticcellsurvivalandcooperateswithc-myctoimmortalizepre-Bcells.Nature,1988;335:440-2

被引用了2000多次。852．Bax

Bax是细胞凋亡促进因子。Bax自身可以组成同二聚体，也可以与Bcl-2构成异二聚体。Bcl-2与Bax蛋白量的比率决定异二聚体（Bcl-2/Bax）与同二聚体（Bax/Bax）的比值。这对决定细胞凋亡的易感性起关键作用。如果Bcl-2的过度表达，与BAX形成异二聚体而阻抑细胞凋亡。86３．BadBad缺乏典型的C端跨膜结构，说明它并非一完整膜蛋白。Bad是细胞凋亡促进因子。Bad可以置换Bcl-2/Bax异二聚体中的Bax，使Bax游离而促进细胞凋亡。87Bcl-2与Bax、Bad在凋亡中的相互作用8889二、p53基因p53并非为所有细胞的凋亡过程所必需，但对DNA损伤而诱发的细胞凋亡却是必不可少的。p53的两大功能：使细胞在G1期停滞。当DNA损伤后，p53首先诱导细胞进入G1期，抑制细胞增殖，直至损伤的DNA修复。一旦DNA不能被修复，p53就会活化那些诱导细胞凋亡的基因转录，使细胞发生凋亡。9091三、IAP家族及其拮抗基因IAP

(inhibitorofapoptosisprotein)为一组具有抑制凋亡作用的蛋白质，首先是从杆状病毒（Baculovirus）基因组克隆到。在哺乳动物中，已发现IAP至少有八种：c-IAP1、c-IAP2、NIAP、XIAP和survivin、BRUCE、ILP-2、ML-IAP。921．IAP的特征：IAP家族是哺乳动物体内唯一被发现的Caspase抑制剂。70氨基酸的BIR重复序列（BaculovirusIAPrepeat）。在C末端还拥有一个RINGFINGER序列，因而它们具有泛素（Ubiquitin）E3的活性。

932．IAP抗凋亡的机制：通过BIR序列与Caspase蛋白质-蛋白质作用，IAP可以直接抑制Caspase-3，-7和