低氧诱导的gf-3表达调控作用的研究

低氧诱导的gf-3表达调控作用的研究

营养细胞最初发育于低氧环境。这是克服贫困的关键。缺氧诱导因子1(HIF-1)是广泛存在于哺乳动物和人体的一种转录因子,与特定的靶基因结合,激活靶基因,使细胞适应缺氧环境。TGF-3β是一种多功能细胞因子,滋养细胞的TGF-3β表达,与滋养细胞增殖和分化有关,调节滋养细胞的浸润功能。本文研究低氧条件下,体外培养的BeWo细胞HIF-1α及TGF-3β表达的变化,以及应用反义核苷酸封闭HIF-1α后,低氧对TGF-3β表达的影响,以探讨缺氧对滋养细胞浸润功能的影响及HIF-1对TGF-3β表达的调控作用。1材料和方法1.1免疫调节体的制备DMEM培养基和胎牛血清购自Invitrogen公司。鼠抗人HIF-1α和TGF-3β单克隆抗体,辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体购自SantaCruse公司。Trizol购自Gibcol公司。MAV、随机引物购自Promega公司。HIF-1α的反义及正义寡核甘酸由上海生工生物公司合成。HIF-1α、TGF-3β及内参β-actinPCR引物、TaqMan探针均由上海基康公司合成。定量PCR反应体系为ABI公司产品。1.2细胞培养和材料制备孕早期的绒毛组织取自第四军医大学唐都医院妇产科门诊,共8例,孕6～8周,经电动负压吸引术结束妊娠。绒毛经无菌PBS液冲洗后,移入无菌台内,去除胎膜组织及蜕膜组织,取成簇的小绒毛部分(约50g)。加少许DMEM培养液,绒毛组织剪成0.5～1mm3小块,接种到6孔培养板中,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液,37℃、5%CO2条件下培养12h,开始缺氧实验。绒毛组织分4组培养,正常对照组:细胞在正常培养液、常氧浓度下培养48h;缺氧组:细胞在正常培养液、低氧条件下培养48h;HIF-1α反义组:培养液加入HIF-1α反义寡核甘酸(10μmol/L)、低氧条件下培养48h;HIF-1α正义组:培养液加入HIF-1α正义寡核甘酸(10μmol/L)、低氧条件下培养48h。HIF-1α寡核甘酸为全硫代修饰,反义寡核甘酸序列为:5′-GCCGGCGCCCTCCAT-3′,正义寡核甘酸序列为:5′-ATGGAGGGCGCCGGC-3′。低氧装置为可调式培养箱(美国Forma公司产品),将绒毛组织放入可调式培养箱中,由进气孔充入低氧混合气体(5%CO2、2%O2、93%N2)20ml/min,30min后密闭,在37℃条件下培养。48h后收集绒毛组织,-80℃保存。HIF-1α的反义及正义寡核甘酸序列和浓度,低氧浓度及缺氧时间参照Caniggia等报道。1.3rna的纯化、鉴定和pa-igodt的表达取绒毛组织约100mg,加入到装有1ml预冷的Trizol液的匀浆器中充分匀浆后,移入1.5ml离心管中。于室温静置10min后,加入0.2ml氯仿振荡,再于室温下静置15min,于4℃、以12000g离心15min。取上层水相加于新的离心管中,加入等体积的异丙醇摇匀,室温静置10min,于4℃、以12000×g离心10min。弃上清,加750ml/L乙醇1ml,离心(同前)5min。取沉淀物干燥后,用20μlDEPC水浴解,用紫外分光光度计鉴定RNA的纯度并计算其浓度。其余置-20℃保存备用。用20μl的反转录体系,包括总RNA样品2.5μl(含RNA2μg)、oligodT引物2μl、RNA酶抑制剂0.5μl(含20U)、5×buffer5μl(含dNTP)、AMV反转录酶1μl及DEPC水9.5μl。PT-PCR的条件为:70℃5min,42℃3min,42℃60min,72℃5min。cDNA产物置-20℃保存。1.4检测tgf-3方法mRNA水平的定量PCR检测HIF-1α基因上游引物的序列为:5′-ATCAGCTATTTGCGTGTGAGGA-3′;下游引物为:5′-TCTGTGCTTTCATGTCATCTTCAAT-3′。检测HIF-1α所用探针序列为:5′-CAAATCACCAGCATCC-3′。TGF-3β基因上游引物为:5′-CGGAATGAGCAGAGGATCGA-3′;下游引物为:5′-GCTGTTTGGCAATGTGCTC-3′;检测TGF-3β所用探针序列为:5′-CTTCCAGATCCTTCGGC-3′。采用50μlABI体系,包括:10×TaqManbufferA5μl、25mmol/LMg2+10μl、10mmol/LA1μl、10mmol/LC1μl、10mmol/LG1μl、20mmol/LU1μl、TaqGold0.5μl、AmpEraseUNG0.5μl、上游引物(20μmol/L)0.5μl、下游引物(20μmol/L)0.5μl、TaqManprobe(50μmol/L)5μl及多聚酶(5U/μl)0.25μl,加去离子水至50μl。采用ABI7700全定量PCR仪检测。PCR循环参数为:50℃2min,95℃10min,95℃15s,60℃1min,共50个循环。阴性对照以三蒸水代替多聚酶加入扩增体系,以β-actin作为内参照进行PCR,计算机软件(PEBiosystermsanalysissoftware)分析各反应的荧光强度得出反应的CT值并绘制β-actin的标准曲线,参照标准曲线,得出目的基因的相对反应起始拷贝数。目的基因mRNA=目的基因拷贝数/内参拷贝数。1.5sds电泳取绒毛组织约100mg,冷BPS洗涤2次,加入预冷的裂解液1ml(含亮肽酶、抑肽酶和胃蛋白酶抑制剂各0.1mg/L),置匀浆器中充分匀浆,于室温静置30min,于4℃、以12000×g离心10min。取上清,采用Bio-Rad法定量蛋白。取20μg总蛋白,加入等体积的样品缓冲液,于100℃作用5min,进行50～80g/L或50～120g/L不连续SDS分离。电泳完毕后,在Bio-RodMini湿式转移电泳槽中,于冰浴中以100V、250mA电移2h。转膜结束后,将硝酸纤维素膜于30g/L的BSA液中,于4℃封闭过夜。依次加入1∶200鼠抗人HIF-1αmAb或1∶200鼠抗人TGF-3βmAb,4℃过夜,洗涤及加1∶1000HRP标记的羊抗鼠IgG,室温下孵育1h。洗涤,以DAB显色后,照相。图像经扫描后,用LabWork3.0UVP软件分析条带的面积和灰度。蛋白含量=条带面积×平均灰度。1.6统计处理实验结果以x¯±sx¯±s表示,统计方法采用单因素的方差分析,组间比较采用LSD法。2结果2.1pcr检测结果HIF-1α和TGF-3β蛋白Westernblot条带见图1,定量PCR荧光信号强度对PCR循环数的曲线和标准曲线见图2、3。HIF-1α和TGF-3β蛋白及mRNAPCR结果见表1。与对照组相比,缺氧组HIF-1α和TGF-3β蛋白,HIF-1α和TGF-3βmRNA表达均明显增加,均有显著意义(P<0.05)。2.2白及mrna表达变化与HIF-1α正义组比较,HIF-1α反义组HIF-1α蛋白及mRNA表达明显减少,相差均有显著意义(P<0.05);与HIF-1α正义组比较,HIF-1α反义组TGF-3β蛋白及mRNA表达也下降,相差均有显著意义(P<0.05)。3低氧诱导的分娩细胞tgf-3表达在胎盘形成的早期,滋养细胞是在低氧环境中发育。低氧可抑制滋养细胞表达浸润性表型及其对子宫内膜的浸入。孕8周后,随着绒毛间隙血流的增加,滋养细胞周围氧浓度升高,其浸润能力也增加。孕12周左右,滋养细胞浸润能力达高峰,浸入到子宫内膜上1/3,深达子宫螺旋动脉,导致小口径的动脉扩张,最终建立起有效的胎盘血液循环。孕12周后,滋养细胞的浸润能力明显下降。滋养细胞的浸润能力在时间和空间上都受到严格调控。多种细胞因子参与了对滋养细胞浸润功能的调控,但TGF-β超家族成员在滋养细胞浸润功能的负调控中发挥重要作用。人类TGF-β存在3个异构体:TGF-1β、TGF-2β和TGF-3β。研究发现,TGF-1β、TGF-2β和TGF-3β在孕12周前的胎盘中都有表达,然而TGF-1β、TGF-2β在整个孕期胎盘中表达是均一的,只有TGF-3β表达呈现了严格的发育调节模型。孕早期,绒毛组织TGF-3β表达增加,在6～8周时表达高峰,孕9周后明显下降。在时间上,滋养细胞TGF-3β表达高峰比浸滋滋养细胞表达浸润表型变化一致。TGF-3β表达下降,滋养细胞表达的浸润型黏附分子(整合素α1β1)增加。本实验结果显示,低氧可诱导体外培养的绒毛组织TGF-3β蛋白及mRNA表达增加。HIF-1是由α和β两个亚基组成的异二聚体结构。HIF-1α是唯一可接受氧浓度变化调节的亚单位,它决定HIF-1的活性。低氧可诱导HIF-1α表达增加,与HIF-1β形成的异二聚体结构的数量也增加。在正常氧浓度下,HIF-1α迅速被蛋白酶降解。HIF-1αmRNA在整个孕期胎盘中都有表达,但孕早期变化明显;HIF-1α蛋白表达随孕期增加而下降。体外培养的滋养细胞,缺氧可诱导其HIF-1α蛋白表达及与DNA结合的活性。本实验结果也显示,低氧可诱导体外培养的绒毛组织HIF-1α蛋白及mRNA表达增加。TGF-3β是HIF-1的靶基因,TGF-3β与HIF-1α之间存在密切的关系。孕12周前,两者在滋养细胞中的表达是平行的。孕5～8周,滋养细胞的HIF-1α和TGF-