复元胶囊对大鼠膝骨关节炎软骨的保护作用

复元胶囊对大鼠膝骨关节炎软骨的保护作用

骨关节炎（oa）是一种常见的慢性和进展性关节疾病。最典型的病理特征是关节软骨的损伤。研究表明OA软骨破坏以Ⅱ型胶原和蛋白多糖破坏丢失最明显,并伴随软骨胶原表型的改变-软骨细胞去分化后合成Ⅰ型胶原。复元胶囊是由临床治疗OA有效的复元汤化载加工而成。前期研究表明复元胶囊能改善膝骨关节炎患者症状,降低骨关节炎患者血清HA水平,调节兔膝OA软骨中MMPs/TIMPs的比例,抑制软骨退变。本实验采用Hulth法建立OA模型,观察复元胶囊对大鼠膝骨关节炎软骨Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白多糖的影响,探讨其对维持正常胶原表型、保护软骨的作用机理。1材料和方法1.1材料表面1.1.1动物重庆医科大学实验动物中心提供雄性SD大鼠60只,体质量250~300g。动物生产许可证号:SYXK(渝)2002007。1.1.2特效药复元胶囊由淫羊藿、鹿茸、肉苁蓉、川芎、当归等组成,委托重庆希尔安药业有限责任公司制成胶囊。四环素由鄂州市武昌鱼生物制药有限公司生产。1.1.3主试剂Ⅰ、Ⅱ型胶原多克隆抗体、SABC试剂盒及DAB显色剂均由武汉博士德生物工程有限公司提供。1.1.4主要设备微量移液器、37℃水浴箱、BCD-1650rongsheng冰箱、Olympus光学显微镜,由重庆医科大学免疫组化实验室提供。1.2方法1.2.1骨关节炎模型建立将60只大鼠随机分为正常组、模型组、四环素组、复元胶囊低、中、高剂量组,每组10只。Hulth法建立骨关节炎模型:无菌条件下切断大鼠右膝内侧副韧带、完整切除内侧半月板以及剪断前后交叉韧带。术后肌注青霉素抗感染,共5d。术后1w开始,每天驱赶大鼠跑步30min,共驱赶12周。而正常组不作任何处理。1.2.2复元胶囊的量依据Meeh-Rubner公式计算大鼠的等效给药剂量,复元胶囊低、中、高剂量组分别给予复元胶囊371.65mg/(kg·d)、743.30mg/(kg·d)、2229.90mg/(kg·d),四环素组予四环素50mg/(kg·d),正常组、模型组予生理盐水灌胃,于术后第2周开始,每天灌胃1次,共12周。1.2.3样品的采集和处理12周后,切取右膝股骨内侧髁,4%多聚甲醛固定,10%EDTA脱钙,常规石蜡包埋后切片,留作甲苯胺蓝染色及免疫组化染色。1.2.4免疫-检测免疫(1)甲苯胺蓝染色软骨蛋白多糖:切片常规脱蜡至水,0.1%甲苯胺蓝染色30min,入1%醋酸分化5s,烘干、透明、封片。(2)免疫组化SABC法染色Ⅰ、Ⅱ型胶原:切片常规脱蜡至水,3%H2O2封闭内源性过氧化物酶20min,复合抗原修复液抗原修复10min,正常山羊血清封闭,滴加Ⅰ、Ⅱ型胶原多克隆抗体(1∶100稀释)4℃过夜,滴加生物素化二抗37℃、20min,DAB显色显微镜下观察,苏木精复染1min,烘干、透明、封片。显微镜下观察染色结果并照片,采用Image-ProPlus图像分析软件计算阳性染色平均光密度(IOD)。1.3统计分析2结果2.1染色架构上甲苯胺蓝染色正常组软骨表面平整,甲苯胺蓝染色均匀;模型组软骨表面不规则,甲苯胺蓝染色极度不均,表、中层失染;四环素组软骨染色较模型组均匀,表层失染;复元胶囊各组软骨染色较四环素组均匀,各层未见明显失染。见图1。2.2各组小鼠材料的染色Ⅱ型胶原正常组全层软骨可见均匀染成棕褐色;模型组表、中层失染,而钙化层染色加深;四环素组表层失染,其余层可见不均匀着色;复元胶囊各组染色较四环素组均匀。Ⅰ型胶原正常组软骨未见着色;模型组表、中层见有不规则的着色,染色为淡褐色;四环素组及复元胶囊各组较模型组淡染。见图2、图3。2.3各组大鼠血清中型胶原的表达情况蛋白多糖及Ⅱ型胶原模型组显著低于正常组(P<0.01);各药物组高于模型组(P<0.05);复元胶囊各组较四环素组高(P<0.05)。Ⅰ型胶原模型组显著高于正常组(P<0.01);各药物组低于模型组(P<0.05);复元胶囊中高剂量组低于四环素组(P<0.05)。见表1。3讨论3.1小鼠骨髓蛋白多糖的染色蛋白多糖是关节软骨重要的细胞外基质成分,其渐进性丢失是OA的主要病理表现。甲苯胺蓝能将软骨蛋白多糖染成紫色或紫红色,而其余组织呈不同程度的蓝色。实验显示OA时软骨蛋白多糖丢失明显,而复元胶囊各组软骨蛋白多糖明显增加,提示复元胶囊可能有防止软骨蛋白多糖丢失的作用。3.2小鼠软骨三种免疫组化后的三性染色反应许多研究表明在进行性骨关节炎中,软骨基质中II型胶原蛋白表达下降。实验发现模型组软骨II型胶原表达降低,尤其是表、中层失染,这可能提示OA时软骨破坏从表层软骨开始,而钙化层染色加深可能是软骨对损伤的一种修复。实验结果与LahmA等一致。3.3软骨细胞的分化和合成型胶原I型胶原主要存在于骨、皮肤等组织,正常关节软骨不含I型胶原。骨关节炎时,软骨细胞去分化后合成Ⅰ型胶原,这是骨关节炎疾病进程的一个重要因素。软骨中产生的I型胶原不能完成正常II型胶原的生理功能,最终导致了软骨的破坏。3.4复元胶囊维持正常胶原表型的作用复元胶囊是治疗骨关节炎有效的复方实验制剂,具有补益肝肾、益气活血之功,临床显示其对OA有明显疗效。本实验研究发现:复元胶囊能增加骨关节炎软骨中II型胶原和蛋白多糖表达,同时抑制I型胶原表达,对维持正常胶原表型,保护关节软