猪饲料中螺旋霉素、替米考星和泰乐菌素的hpce检测方法的建立

猪饲料中螺旋霉素、替米考星和泰乐菌素的hpce检测方法的建立

现在，由于药物的使用受到高度重视。世界上的发达国家和发展中国家需要严格的监督管理和法规来限制食品药物。大环内酯类如螺旋霉素(Spiramycin,SPM)、替米考星(Tilmicosin,TIL)、泰乐菌素(Tylosin,TYL),是兽医临床上使用较广泛的一类抗生素药物,在饲料中经常添加且使用量仅次于四环素类抗生素。由于缺乏相应的理论指导,随着养殖环境的恶化和兽药的滥用,使大环内酯类抗生素在动物产品中的残留超标,严重危害着消费者的健康,同时给我国动物产品的出口造成极大的障碍但是目前我国饲料添加剂的管理尚不十分的完善,一些养殖户为了追求更大经济效益,常常过量的添加这些药物。因此需要建立准确、简单、快速、成本低的检测方法,从饲料源头上把住此类药物市场准入关。目前,对大环内酯类药物的检测手段较多,有微生物抑制实验(MIA)、免疫方法、薄层色谱(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法(LC/MS、LC/MS/MS)等。毛细管电泳技术(capillaryelectrophoresis,CE)是20世纪80年代末迅速发展起来的一项新型液相分离分析技术,它以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,具有高柱效、高灵敏度、分离速度快、进样量少、溶剂消耗少、仪器简单、成本低及分离模式多样等特点,在药物检测中的应用日益广泛。使用CE检测动物组织中大环内酯类药物残留的报道较多:Lalloo等在1997年建立了红霉素、交沙霉素和竹桃霉素的CE检测方法,Zhou等于2000年建立了红霉素、螺旋霉素和竹桃霉素的CE方法,Deng等在2007使用CE-ECL(电化学发光检测器)检测大鼠血浆中的红霉素,检测限达0.35ng/mL。饲料中大环内酯类药物的检测方法,国内报道不多,仅在2007年张建勋等使用HPLC检测猪饲料中的替米考星,定量限为2mg/kg。国外相对较多:Gramse等2004年利用LC检测饲料中TYL,定量限为7.2g/t;González等2007年使用HPLC-ECD检测动物饲料中的竹桃霉素、泰乐菌素、罗红霉素、螺旋霉素、交沙霉素和吉他霉素6种大环内酯类药,检测限在0.02～0.61mg/kg。但是此类药物在饲料中的检测,目前检测饲料中大环内酯类药物手段多采用用液相方法,并且只是检测其中一种或几种药物,还没有同时检测饲料中SPM、TIL和TYL这3种药物的报道,此外用HPCE作为检测手段的检测饲料中SPM、TIL和TYL的方法也尚未见报道。1材料和方法1.1仪器、实验和仪器HP3D毛细管电泳仪(安捷伦科技公司,德国)配有二极管阵列检测器,仪器控制和数据处理由HP3D化学工作站(安捷伦科技公司,软件版本A.08.03);氮吹仪:OrganomationAssiciation.Inc(美国);超纯水仪:Milli-Q(美国);高速冷冻离心机:Biofugestratos(Heraeus,德国);实验室pH计:PHSJ-4A,上海雷磁仪器厂;旋涡混合器:HQ-60(北方同正生物技术发展公司)。泰乐菌素、替米考星的纯度均大于98.0%(质量分数w),购于德国Dr.EhrenstorferGmbH公司;螺旋霉素纯度大于99.0%(w),购于美国Fluka公司。内标噻苯达唑含量为99.0%(w),购于美国Sigma公司。甲醇,乙腈为色谱纯,美国DIKMA公司产品;氢氧化钠、柠檬酸、磷酸氢二钠为分析纯,北京试剂公司产品;去离子水,由Milli-Q超纯水仪获得。饲料:猪全价配合饲料,购自北京正旺饲料厂。1.2溶液制备1.2.1溶液的配制准确称取螺旋霉素、替米考星和泰乐菌素,用甲醇配制为1000μg/mL标准储备液。称取内标噻苯哒唑配制为40μg/mL的甲醇溶液。置于-20℃冰箱密封保存。1.2.2标准混合溶液取适量的标准储备液(除内标)配制为100和500μg/mL混合标准工作液。置于4℃冰箱密封保存。1.2.3柠檬酸溶液和柠檬酸溶液配制配制0.04moL/L磷酸氢二钠溶液,0.02moL/L柠檬酸溶液,二者按体积比1∶25混合,用pH计调节为pH2.5的缓冲溶液。缓冲溶液上机前经超声脱气,过0.2μm水系滤膜。1.2.4萃取复合溶液甲醇和去离子水按体积比1∶1混合,配制成复溶液。1.3试验用培养基国产毛细管,总长57cm,有效长度50cm,内径75μm;运行电压25kV;温度25℃;3.5kPa×8s进样;检测波长为232和295nm。新毛细管用1moL/LNaOH冲洗20min,超纯水冲洗5min,缓冲溶液冲洗20min;每天开机用1moL/LNaOH冲洗5min,超纯水冲洗5min,缓冲溶液冲洗20min;每次进样间用缓冲溶液冲洗3min。1.4标准曲线的建立取40、80和120μL的100μg/mL混合标准工作液;40、56和80μL的500μg/mL混合标准工作液,加到5mL刻度试管中,每个质量浓度均加40μL内标噻苯哒唑,氮气吹干后用400μL复溶液复溶,得到质量浓度依次为10、20、30、50、70和100μg/mL的上机溶液,每个质量浓度进样3次,以各药的峰面积与内标峰面积之比和饲料浓度建立标准曲线。1.5腈、甲醛的萃取准确称取(1±0.02)g猪全价饲料,置于100mL离心管中,加入混合标准工作液后静置15min以上,加40mL乙腈提取,涡动1min,20℃超声15min,9000r/min高速离心10min,取上清液4mL,氮气吹至2mL,加入3mL正己烷,3500r/min离心3min,弃去上层的正己烷,重复萃取1次后,下层经氮气吹干后,加入100μL40μg/mL的内标,再用氮气吹干,最后以400μL复溶液复溶。过0.2μm有机针孔滤膜后上机检测。1.6检测限和定量限取空白饲料样品,设6个平行,按上述样品前处理方法(1.5)进行处理、电泳条件(1.3)进样,得到空白饲料色谱图,测得基线噪音值,取平均值,将信噪比S/N=3作为检测限(LOD),S/N=6为定量限(LOQ)。1.7添加回收率试验以混合标准工作液添加到空白饲料,使饲料的添加质量比为50、100和400μg/g,按1.5样品前处理方法进行添加回收试验,每个质量做5个平行,根据峰面积比计算添加回收率和日内变异系数,连续做3d,计算日间变异系数。2结果与分析2.1电泳条件下各药的峰面积比3种大环内酯类药物(包括内标)在1.3节所述电泳条件下,均得到了基线分离,在10～100μg/g的范围内,各药的峰面积比与样品浓度之间成线性相关,相关系数R>0.999(表1)。2.2检测限和定量限饲料中SPM检测限为3.0μg/g,定量限为6.0μg/g;TIL检测限为5.0μg/g,定量限为10μg/g;TYL检测限为8.0μg/g,定量限为16μg/g。空白饲料电泳图谱、添加饲料电泳图谱分别见图1和2。2.3饲料样品添加回收以50、100和400μg/g3个浓度添加水平对饲料样品进行添加回收试验(表2),平均回收率>74%,变异系数≤8.1,表明该方法稳定可靠。3讨论3.1电泳分析条件的选择和优化3.1.1单次给药法分离在毛细管电泳的分离条件中,缓冲溶液的pH与类型是关键。用宽pH缓冲范围的磷酸盐体系(pH1.5～13)进行pH值的搜索。在碱性条件下,溶剂峰与药峰重叠,调节pH也不能使其分开,在酸性条件下,随着pH的增大,TYL的出峰时间提前,而TIL和SPM的出峰时间延后。结合考虑分离效果与分离效率,选择pH3.3做进一步研究。在pH3.3条件下使用相同离子浓度的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液,醋酸缓冲溶液,琥珀酸缓冲溶液,在这3种类型的缓冲体系中,柠檬酸的分离效果较好,所以选择柠檬酸做为buffer组分。在确定了pH和缓冲溶液的种类后,考察不同的离子强度的缓冲溶液对分离的影响。结果表明,低离子强度的缓冲体系中,电流很小,迁移时间提前,药物不能很好的分离;而在高离子强度的缓冲体系中,电流随着离子强度的增大而增大,迁移时间延后,且基线漂移,分离效果不佳。故选择40mmol/LNa2HPO4-20mmol/LCit。Lalloo等曾在缓冲溶液中加入50%(体积分数φ)甲醇,减小电流以减小焦尔热,避免断流的发生,又能进一步提高分离度。然而尝试加入不同比例乙腈和甲醇后,结果药峰峰形未见改善,但分析时间延长。所以选用40mmol/LNa2HPO4-20mmol/LCit,pH3.3的纯水相作为分离buffer。在进行添加回收实验中,药峰位置有样品的杂质干扰,本试验曾试用过BondEluteC18(500mg,3mL)、OasisHLB(60mg,3mL)、OasisMCX(60mg,3mL)和WatersSCX(500mg,3mL)小柱以除去干扰,但效果都不太理想。此后通过调节缓冲溶液的pH,发现在pH2.5可以将杂质峰与药峰分开,所以,没有采用SPE柱,这样既减少了成本,又简化了前处理的步骤。所以最后采用的40mmol/LNa2HPO4-20mmol/LCit(pH2.5)纯水相缓冲溶液。3.1.2pa5s,kpa8spsq为确定进样量,以添加回收的样品进样,以一系列进样量(3.5kPa×5s;3.5kPa×8s;3.5kPa×10s;3.5kPa×12s)进行比较,在提高仪器浓度响应值的同时,兼顾峰形和分离度,最后选择以3.5kPa×8s压力进样。3.1.3扩展光程毛细管毛细管柱长及内径与分离时间成正比,柱子越长、内径越大分离时间越长,所以适当的缩短长度,增大内径可以提高分离效率,但是如果过短,各药物间达不到很好的分离。本实验采用有效长度为50cm,内径75μm的国产毛细管柱。安捷伦扩展光程毛细管其仪器响应值是同等长度普通毛细管的3～4倍,可以用来降低仪器的检测限。因此本试验可以使用更短的扩展光程毛细管,以进一步降低检测限。分离电压直接影响迁移时间,实验考察了18～29kV电压对分离的影响,结果表明,分离时间与电压成反比。然而电压过高,产热也相应增多,所以,综合考虑选择25kV为最佳分离电压。3.2提取回收率的药物本试验对比了甲醇、乙腈、乙酸乙酯和PBS(pH2.5)的提取效果。发现甲醇提取所含的杂质很多,乙酸乙酯提取的回收率很低;而用乙腈提取,既可以得到较为满意的回收率,所含的杂质也较少,这可能与乙腈本身具有沉淀蛋白的作用有关。用PBS提取的回收率尚可,但是药物有降解发生,这是因为在酸性条件下,大环内酯类药物不稳定,苷键发生水解所致。所以最后选择乙腈作为提取溶剂。3.3spm、til和tyl的干扰本实验对饲料中常添加的四环素(TC)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC)、强力霉素(DOC)对SPM、TIL和TYL的干扰进行了实验。结果表明,以上药物可以在饲料样品中与SPM、TIL和TYL有效分离(图3)。3.4与液相检测限的比对本方法与普通液相相比,检测限及定量限都偏高,这是由于分离药物的毛细管内径只有75μm,而普通液相使用的柱子内径在4mm左右,毛细管的进样量在几nL,液相的进样量在10～200μL,此外HPCE使用的是普通的紫外检测器且检测窗口比液相检测池相比要小20倍,以上这些导致了本实验的检测限偏高。但是随着激光诱导荧光检测器的产生和使用电化学检测法,可以把检测限降为10-10～10-12mol/L甚至10-21mol/L,所以因紫外检测器所致的较高检测限可以通过更换检测器来降低。本实验使用HPCE每检测一个样品所需要的缓冲溶液只需要不到2mL,而且本方法分离所使用的为全水相,而常用的液相方法分离大多在有机相进行,对于本类药物的分离大多使用乙腈和水相,并且分离的时间越长所消耗的有机相越多,成本相应提高,对环境的污染也增大。此外本实验使用的国产毛细管柱成本不到20元人民币,比液相用的柱子要廉价很多。所以与液相方法相比该方法具有成本