hmlh1基因表达逆转azaddp细胞对顺铂耐药的研究

hmlh1基因表达逆转azaddp细胞对顺铂耐药的研究

近年来，癌症的发病率和死亡率有快速增长的趋势，化疗和抗化疗已经成为癌症治疗中必须解决的难题。随着表观遗传学研究的深入,研究认为某些基因启动子甲基化和肿瘤耐药关系密切,可用于预测肿瘤化疗效果。DNA错配修复系统(mismatchrepairsystem,MMR)是人体细胞中存在的一种能识别并修复DNA碱基错配的安全保障系统。hMLH1基因是一系列DNA错配修复基因中最重要的一种,也是MMR系统的重要成分,其甲基化可导致MMR缺陷。近年来发现hMLH1的失活不仅与肿瘤发生、发展有关,还可能导致某些肿瘤对某些抗肿瘤药物耐药。由于hMLH1基因甲基化是肺癌发生、发展的因素之一。因此本研究旨在探讨hMLH1基因与肺癌细胞化疗耐药方面的作用机制,为肺癌治疗提供新的靶点。1材料和方法1.1菌株和试剂人肺腺癌A549细胞株来源于美国模式培养物研究所(AmericanTypeCultureCollection,ATCC),由中南大学湘雅二医院肿瘤中心保存。人肺腺癌耐药株A549/DDP细胞株购自中南大学湘雅医学院细胞中心,由北京大学肿瘤临床学院建系,其亲本细胞A549来源于ATCC。顺铂购于山东齐鲁制药公司;5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-eoxycytidine,5-Aza-CdR)购于美国Sigma公司(货号A3656)。5-Aza-CdR是一种常用的去甲基化药物,本研究根据文献采用无毒低剂量(0、0.5、1.0、5.0、10.0和20.0μmol/L)5-Aza-CdR对体外培养的肺癌耐药细胞A549/DDP产生干预。逆转录试剂盒购自美国Fermentas公司;甲基化修饰试剂盒购自美国ZYMO公司;CpG甲基化酶(SssImethylase)购自美国NEB公司;Annexin-ⅤFITC凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物有限公司;Hoechst33258购自碧云天生物技术研究所;MTT购自美国Sigma公司。1.2方法1.2.1rt-pcr检测复苏A549及A549/DDP细胞接种于无菌培养瓶中,将培养瓶置于37℃、CO2体积分数为5%、100%湿度的培养箱中培养。根据细胞生长情况每1~2d换液或传代,待细胞生长至对数期时进行实验。A549/DDP培养液中加入2.0μg/mL顺铂以维持其耐药表型。RNA抽提:收集A549和A549/DDP细胞并加入适量TRIzol,每1mLTRIzol加0.2mL氯仿,室温放置5min;12000×g离心15min;每1mLTRIzol加0.5mL异丙醇,12000×g离心15min;DEPC水配制的75%乙醇洗涤RNA沉淀1次;空气干燥,DEPC水溶解。贮存于-70℃。逆转录合成cDNA按RT试剂盒说明进行,PCR反应条件:hMLH1:95℃5min,94℃30s、58℃30s、72℃1min共35个循环72℃延伸5min;β-actin:95℃1.5min,94℃30s、52℃30s、72℃30s共35个循环,72℃延伸5min。PCR产物在0.15%的琼脂糖凝胶中电泳20min后,在凝胶成像分析系统下显影照相存档。1.2.3msp检测1.2.3.dna的提取细胞DNA提取采用胰酶消化贴壁生长的细胞,每106~107个细胞中加入500μL细胞裂解缓冲液,加入蛋白酶K消化,常规酚/氯仿抽提法抽提DNA。外周血DNA提取采用常规酚/氯仿抽提法抽提DNA。甲基化阳性对照DNA的处理,取健康志愿者外周血DNA1μg,S-腺苷甲基硫氨酸0.2μL,缓冲液4μL,甲基化酶SssI0.25μL,灭菌双蒸水补足至40μL,于37℃循环反应3h,所得DNA作为甲基化阳性对照。1.2.3.2天竺葵装饰每例取制备的DNA约1500ng。后按EZDNA甲基化试剂盒说明书进行。1.2.3.pcr扩增条件MSP引物参考文献设计,甲基化hMLH1:上游引物5’-ACG-TAGACGTTTTATTAGGGTCGC-3’,下游引物5’-CCTCATCGTAACTACCCGCG-3’,115bp,退火温度63℃;非甲基化hMLH1:上游引物5’-TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTT-GT-3’,下游引物5’-ACCACCTCATCATA-ACTACCCACA-3’,124bp,退火温度为62℃。PCR扩增条件95℃5min,94℃30s、63/62℃30s、72℃50s共40个循环,72℃7min延伸,4℃保存。在2%琼脂糖凝胶中电泳30min后,凝胶成像分析系统下显影照相存档。1.2.4dmso-pcr反应取对数生长期A549、A549/DDP细胞,用10%灭活新生牛血清RPMI-1640培养基制成的单细胞悬液1×104个/孔接种于96孔细胞培养板液中,每孔200μL,实验组分别加入0.2、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0和80.0μmol/L的顺铂,另设对照组(不加药)和空白组(只有培养基),每组设3个平行孔。48h后,每孔加入5mg/mL的MTT20μL,继续培养4h弃上清液,每孔加入150μLDMSO,避光振荡10min,用全自动酶联免疫检测仪于492nm处测定吸光度A值。分别计算各组IC50值,耐药倍数=耐药细胞IC50/亲本细胞IC50,逆转耐药倍数=单用顺铂时耐药细胞IC50/5-Aza-CdR与顺铂合用后耐药细胞IC50。1.2.5继续温育和温育混养箱继续温育取对数生长期细胞,3×105个/孔接种于放有盖玻片的6孔细胞培养板中,每孔约2mL,置于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱继续温育48h。吸去细胞培养基,加入0.5mL4%多聚甲醛固定10min,PBS冲洗,加入1mL的10μg/mLHoechst33258染色液,室温放置3~5min,吸除Hoechst33258染色液,用PBS洗涤,取出盖玻片,置于载玻片上,加入1滴抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。1.2.6流式细胞术检测细胞的鉴定取对数生长期细胞置于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱继续温育48h。收集细胞,把密度调至2.5×105~5×105个/mL的细胞悬液,分别取1mL加入5mL试管,500~1000×g离心5min,4℃冷PBS液洗涤2次,1mL冷PBS重悬细胞,500~1000×g离心5min,用200μL的BindingBuffer稀释,加入FITC标记的Annexin-V10μL和PI5μL,室温避光15min,加入300μLBindingBuffer,立即用FCM进行流式细胞术定量检测。1.3数据统计与分析采用SPSS13.0统计软件对数据进行处理。计量资料中正态分布数据用表示。根据直线回归计算各药物的IC50,正态分布的两组以上的数据的比较采用方差分析,两组间比较采用t检验,非正态分布数据的比较采用秩转换的非参数检验,相关性分析用Pearson’s相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1-aza-cdr检测hmlh1mrna表达从RT-PCR结果可见(图1),在分子量标准为215bp位置,A549及A549/DDP细胞均出现hMLH1扩增条带,A549细胞中hMLH1mRNA表达明显高于A549/DDP细胞,两者差异有统计学意义(P<0.05)。随着5-Aza-CdR浓度为0、0.5、1.0、5.0、10.0μmol/L时,hMLH1mRNA的相对表达量逐渐升高。说明在一定范围内随着5-Aza-CdR浓度增加,hMLH1mRNA的相对表达量也增高,呈浓度依赖性(γ=0.865,P<0.05)。20.0与10.0μmol/L5-Aza-CdR作用A549/DDP细胞后,hMLH1mRNA的相对表达量之间差异无统计学意义(P>0.05),可见浓度为10.0μmol/L时,5-Aza-CdR可使A549/DDP细胞中hMLH1mRNA高表达。2.2甲基化细胞系A549细胞仅出现非甲基化条带(U),为hMLH1非甲基化细胞株;耐药细胞株A549/DDP细胞同时出现甲基化(M)和非甲基化(U)条带,为hMLH1部分甲基化细胞株。通过对10.0μmol/L的5-Aza-CdR干预A549/DDP细胞后出现非甲基化条带(U),用凝胶电泳分析软件QuantityOne对结果进行分析得出平均光密度值(OD),经比较差异有统计学意义(P<0.05,图2)。2.3-asa-cdr对a549/ddp细胞的抑制效果结果显示顺铂干预48h后对A549细胞的IC50为(4.7±0.7)μmol/L,而对A549/DDP细胞的IC50约为(30.1±1.8)μmol/L,后者的耐药倍数为A549细胞的6.37倍,可见顺铂对A549/DDP细胞的增殖具有抑制作用,但与A549细胞相比A549/DDP细胞对顺铂耐受明显。所以A549/DDP细胞被确定为耐顺铂的肺癌细胞株。加入10.0μmol/L5-Aza-CdR作用48h后,顺铂对A549/DDP细胞的IC50约为(6.9±0.6)μmol/L,逆转顺铂耐药倍数约为4.33倍。结果明显可见10.0μmol/L5-Aza-CdR可提高A549/DDP细胞对顺铂的敏感性,但仍比亲本细胞A549对顺铂的敏感性低。经比较差异均有统计学意义(P<0.05,图3)。2.4凋亡细胞的检测A549/DDP细胞与10.0μmol/L5-Aza-CdR干预48h后的A549/DDP细胞形态规则均呈圆形均匀的淡蓝色,基本未见凋亡细胞,两者无明显差异,可见10.0μmol/L5-Aza-CdR作用48h对A549/DDP细胞的凋亡作用较小。经20.0μmol/L顺铂干预后,A549/DDP细胞在倒置荧光镜下可见部分凋亡细胞,即细胞核或细胞质内出现致密浓染颗粒块状荧光,不规则,大小不等,可见凋亡小体;而5-Aza-CdR干预后的A549/DDP细胞在倒置荧光镜下可见凋亡细胞明显增多(图4)。2.5两组患者预后的a549/ddp细胞凋亡百分数比较A549/DDP细胞与10.0μmol/L5-Aza-CdR干预后的A549/DDP细胞的凋亡率都极低;A549/DDP细胞凋亡百分数为(1.41±0.10)%,10.0μmol/L5-Aza-CdR干预后的A549/DDP细胞凋亡百分数为(1.67±0.18)%,两者比较差异无统计学意义(P>0.05);也能证明10.0μmol/L5-Aza-CdR作用48h后不引起细胞凋亡。经2.5、10.0和40.0μmol/L顺铂干预后,A549/DDP细胞凋亡百分数分别为(3.57±0.94)%、(15.31±1.51)%和(34.89±1.81)%;5-Aza-CdR干预后的A549/DDP细胞凋亡百分数分别为(13.92±1.36)%、(25.44±1.91)%和(48.37±1.63)%,经5-Aza-CdR干预后的细胞较单用顺铂的A549/DDP细胞凋亡程度明显增高,差异无统计学意义(P<0.05,图5)。3hmlh1启动子甲基化全身化疗是目前大多数非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)患者的主要治疗手段,而主要的含铂类方案有效率只有30%~47%。由于耐药的发生常导致肺癌化疗的失败。hMLH1基因是MMR系统的重要成分,与肿瘤的发生发展密切相关,已有多篇文献报道正常细胞和肿瘤细胞hMLH1基因的甲基化状态与转录之间呈负相关。去甲基化药物5-Aza-CdR是一种常用的去甲基化药物,研究者认为低剂量持续给药可能是以后研究的方向。低剂量的5-Aza-CdR虽无直接抗肿瘤作用,但能通过改变卵巢癌和结直肠癌耐药细胞hMLH1甲基化状态,从而逆转肿瘤的顺铂耐受,所以低剂量的5-AzaCdR和化疗联合可能达到更好的临床治疗效果。hMLH1甲基化与化疗耐药研究主要集中在结直肠癌和卵巢癌。Strathdee等对卵巢癌耐顺铂细胞株研究认为hMLH1启动子甲基化可能是hMLH1表达丧失的常见机制,也可能是顺铂耐药的机制。Plumb等研究卵巢癌及结肠癌细胞系裸鼠移植瘤进一步证实了hMLH1启动子区甲基化可能是卵巢癌铂类等细胞毒性药物耐药性的普遍机制。Watanabe等通过MS-PCR研究对首次和顺铂化疗后二次切除的卵巢癌组织的hMLH1甲基化状态,认为在卵巢上皮癌中hMLH1启动子甲基化是获得性铂类耐药的重要分子学因素。Meyers等研究5-FU处理结肠癌细胞系后,hMLH1表达阴性的细胞较阳性者对5-FU更具有耐受性。Arnold等发现用5-Aza-CdR可使细胞hMLH1基因表达增加,从而使原本对5-FU耐药的细胞的敏感性增强。hMLH1启动子甲基化与NSCLC的病理生理密切相关,大量研究发现NSCLC组织中hMLH1蛋白及mRNA表达缺失与hMLH1基因甲基化有关。Kouso等研究表明hMLH1蛋白的低表达与遗传的不稳定性有关。铂类药物是NSCLC化疗中的常用药物,那么hMLH1甲基化是否也和NSCLC的铂类耐药有关,是否也能通过逆转hMLH1甲基化来改变NSCLC的铂类耐药状态,目前国内外尚无相关研究。本研究选用耐顺铂的NSCLC细胞株A549DDP作为研究对象,并用其亲本细胞株A549作为对照。发现两株细胞均表达hMLH1mRNA,但A549表达hMLH1mRNA明显高于其耐药株;且经5-Aza-CdR作用后可上调A549/DDP的hMLH1mRNA表达。同时MSP结果可见经5-Aza-CdR去甲基作用后可使A549/DDPhMLH1部分甲基化状态转变为非甲基化状态,证明了hMLH1的甲基化状态与转录之间呈负相关。在一定范围内随5-Aza-CdR浓度的增加A549/DDP细胞中hMLH1mRNA的表达也增高。本研究发现10.0μmol/L5-Aza-CdR已经能很好的逆转hMLH1基因甲基化,恢复其基因表达。经10.0μmol/L5-Aza-CdR干预后,A549/DDP对顺铂的IC50明显下降,并且通过测量细胞凋亡形态及细胞凋亡率可进一步证明,该浓度5-Aza-CdR明显提高了A549/DDP对顺铂的敏感性,发生了耐药逆转。由此说明肺腺癌耐药细胞株的发生与hMLH1基因启动子区域的甲基化状态密切相关。但本研究也发现,虽然5-AzaCdR干预细胞后,再用顺铂作用于A549/DDP,可显著降低A549/DDP对顺铂的IC50,逆转耐药倍数约为4.34倍,但与亲本细胞A549相比仍具有耐药性,提示A549/DDP的化疗耐药还与其他耐药相关基因有关。这一系列的耐药相关基因可能从不同的作用位点以