产超广esbls与非产esbls大肠埃希菌耐药性及耐药基因携带情况分析

产超广esbls与非产esbls大肠埃希菌耐药性及耐药基因携带情况分析

随着抗菌药物的广泛应用，大腿艾滋病毒的耐药性（eco）逐年增加，对各种抗菌药物的抗药性需药率高出临床探讨。ECO的耐药机制很多,如细菌产生灭活酶或钝化酶对抗菌药物的灭活与修饰;抗菌药物作用靶位的改变;膜对抗菌药物的通透性下降,药物摄入减少;膜对抗菌药物的主动外排,药物排出增加;细菌形成生物被膜;其中以产酶最为重要,研究的也最多。笔者主要针对ECO对临床常用抗菌药物的耐药性及超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因、氨基糖苷类、喹诺酮类抗菌药物耐药基因携带情况进行研究。1材料和方法1.1esblus阳性菌株54株不重复ECO来自青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院各种临床标本中分离的菌株;其中27株ESBLs阳性菌,27株ESBLs阴性菌;所有菌株经ATBExpression系统鉴定。大肠埃希菌ATCC25922敏感质控菌株(山东省临检中心提供);肺炎克雷伯菌ATCC700603ESBLs阳性质控菌株(北京医院惠赠)。1.2抗菌药物的耐药率、中介率、敏感率采用K-B法,按2005年美国临床实验室标准化研究所/美国临床实验室标准化委员会(CLSI/NCCLS)颁布的标准计算ECO对抗菌药物的耐药率、中介率、敏感率;抗菌药物纸片均为英国Oxoid产品。1.3esbls阳性试验按CLSI/NCCLS推荐方法,头孢他啶与头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟与头孢噻肟/克拉维酸,两组任意一组后者与前者抑菌环直径之差≥5mm,即确认为ESBLs阳性。1.4离心吸弃液挑取菌落置入内含100μl生理盐水的0.5ml离心管内,12000r/min离心5min,吸弃上清液;加裂解液A50μl、裂解液B2μl,混匀后置入55℃保温1h,后置入95℃保温5min,10000r/min离心30s,上清液即为扩增的模板液。1.5pcr扩增产物均为聚合酶链反应(PCR)法。各种靶基因PCR扩增体系均为:每反应体系P1、P2引物各0.5μmol/L,dNTPs各200mmol/L,KCl10mmol/L,(NH4)2SO48mmol/L,MgCl22mmol/L,Tris-HCl(pH9.0)10mmol/L,NP400.5%,BSA0.02%(w/v),TaqDNApol1U,总反应体积20μl(其中模板液5μl)。PCR扩增产物>500bp热循环参数均为:93℃预变性2min,然后按93℃60s、55℃60s、72℃60s共35个循环,最后72℃延长至2min。PCR扩增产物<500bp热循环参数均为:93℃预变性2min,然后按93℃30s、55℃30s、72℃60s共35个循环,最后72℃延长至2min,产物经2%琼脂糖凝胶电泳。引物序列见表1。1.6统计分析产ESBLs组与非产ESBLs组ECO耐药情况,应用统计学分析软件SPSS11.5,经χ2检验,检验水准α=0.05进行统计学分析。2eco耐药基因携带情况2.1耐药率54株ECO对22种抗菌药物的药敏率,见表2。2.2产ESBLs与非产ESBLsECO耐药株在27株产ESBLs菌株中,头孢噻肟不敏感株为26株,头孢他啶不敏感8株,仅有1株头孢噻肟敏感但头孢他啶耐药,头孢他啶不敏感仅9株。对产酶组与非产酶组耐药性检测结果发现,ECO对氨基糖苷类抗菌药物与呋喃妥因耐药性产酶组略高于非产酶组,但统计学分析,两组差异无统计学意义(P>0.05)。2.3ECOESBLs耐药基因携带情况PCR检测显示,TEM型ESBLs型别最为常见,16株扩增阳性占59.3%,CTX-M-1型9株占33.3%,SHV型5株占18.5%,OXA-1型8株占29.6%,6株未扩增出阳性结果,10株同时携带≥2种基因型。2.4ECO对氨基糖苷类抗菌药物耐药基因的携带本试验用阿米卡星、奈替米星、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素来检测ECO对氨基糖苷类抗菌药物耐药情况,只要对其中任意1种抗菌药物不敏感,即检测其耐药基因。检测结果显示,54株ECO中耐氨基糖苷类抗菌药物44株,耐药率为81.5%;PCR结果显示,其中aac(3)-Ⅰ4株占9.0%;aac(3)-Ⅱ38株占86.4%;aac(6′)-Ⅰ17株占38.6%;aac(6′)-Ⅱ11株占25.0%;ant(2″)-Ⅰ8株占18.2%;ant(3″)-Ⅰ12株占27.3%。2.5ECO对喹诺酮类抗菌药物耐药基因携带结果药敏结果显示,4种抗菌药物有交叉耐药性,54株病原菌中耐喹诺酮类抗菌药物为41株,耐药率为75.9%,qnr基因检出率为7.3%。ECO部分耐药基因PCR扩增结果,见图1～4。3产酶基因型的检测结果本试验的54株ECO对阿米卡星、奈替米星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢西丁、氨曲南、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南和美罗培南具有较高的敏感性,敏感率达70.0%～100.0%;对喹诺酮类、庆大霉素、哌拉西林的敏感性<27.8%。对ESBLs阳性组与ESBLs阴性组进行22种抗菌药物耐药性检测结果发现,除两组全部敏感的抗菌药物外,ECO对氨基糖苷类抗菌药物和呋喃妥因的耐药性产酶组略高于非产酶组,但差异无统计学意义。而对其余13种抗菌药物,产酶组耐药性明显高于非产酶组,差异有统计学意义;分析原因,一方面是与ESBLs的水解底物有关;另一方面可能与携带编码ESBLs基因的质粒上往往同时携带其他类抗菌药物耐药基因有关。本次PCR结果显示,TEM型ESBLs型别最为常见,16株扩增阳性;但这种酶是广谱酶还是超广谱酶还需测序证实。国内在ECO中检测到TEM型ESBLs的报道少见,李家斌等在3株ECO和1株克雷伯菌属中检测到TEM-10型ESBLs为国内首次报道;陈炫等在2株ECO中检测到TEM-19型ESBLs,此型主要见于美国和法国。本次PCR结果,SHV型5株阳性,熊自忠等和胡云建等分别在2株和1株ECO中检测到SHV-12型ESBLs;提示SHV型ESBLs并不是我国ECO主要的ESBLs型别。本次试验检测到9株CTX-M-1阳性菌株,但就我国各大医院的相关试验结果及我国该基因型的流行趋势,我们并不排除本次试验所测的ESBLs阳性菌株尚存在其他CTX-M型ESBLs,CTX-M型ESBLs为我国ESBLs的主要酶型,可能与广泛使用头孢噻肟有关。OXA型ESBLs以往国外文献报道主要存在于铜绿假单胞菌和鲍氏不动杆菌中,而在肠杆菌科细菌中所占比例较少,国内相关报道也较少;本研究结果发现,8株OXA-1型扩增阳性,比例较高。氨基糖苷类修饰酶按功能可分成乙酰转移酶(AAC)、磷酸转移酶(APH)、核苷转移酶(ANT)3类,目前已发现的有>30种。本研究发现aac(3)-Ⅱ和aac(6′)-Ⅰ为我院临床ECO主要的产酶基因,分别占86.4%和38.6%;而美国则以ant(2″)和aac(2)为主;捷克和斯洛伐克是ant(2″)和aac(3);希腊则以aac(6′)-Ⅰ检出率最高。aac(3)主要修饰庆大霉素、妥布霉素,但aac(3)-Ⅰ不是我院ECO主要的基因型,仅检测到4株。本次试验凡扩增出aac(3)-Ⅱ基因的菌株,其表型均表现为庆大霉素耐药,但aac(3)-Ⅱ基因扩增阳性的菌株并不是都对妥布霉素、奈替米星、卡那霉素表现为耐药,其原因可能与不同抗菌药物被修饰的速度不同,使其产生耐药情况不同,如妥布霉素被钝化的速度仅为庆大霉素的1/4,故临床产aac(3)钝化酶的菌株对庆大耐药,但对妥布霉素仍敏感。此酶对阿米卡星尚稳定,因为庆大霉素、妥布霉素、奈替米星都存在3-位氨基,而aac(3)为氨基糖苷-N-3-乙酰基转移酶,ECO耐药株通过aac(3)-Ⅱ基因编码的aac(3)-Ⅱ对上述抗菌药物进行钝化介导,但阿米卡星由于1-氨基被4-氨基-2-羟丁酰取代,对邻近的3-位氨基造成空间上的位阻而形成aac(3)-Ⅱ钝化酶的抗性。aac(6′)-Ⅰ为阿米卡星修饰酶,3株阿米卡星耐药菌均检测到aac(6′)-Ⅰ,但其他14株携带aac(6′)-Ⅰ基因表型均对阿米卡星敏感,这可能是由于病原菌摄取或转运抗菌药物的速度远远超过药物被修饰的速度,使较多药物进入菌体与核糖体结合而发挥作用。本次试验显示,ant(2″)-Ⅰ和ant(3″)-Ⅰ也占有一定的比例,分别为18.2%和27.3%。喹诺酮类药物是近20年来发展十分迅速的一类抗菌药物,因其抗菌谱广、抗菌活性强、使用方便、剂型多等优点,在国内外临床控制感染性疾病中普遍应用;同时细菌对该类药物的耐药性也成蔓延趋势。以前认为病原菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药机制,主要通过靶位的改变(