高效液相色谱-电喷雾-离子阱质谱快速鉴定硫酸奈替米星有关物质的结构

高效液相色谱-电喷雾-离子阱质谱快速鉴定硫酸奈替米星有关物质的结构

氨基葡萄糖醇是将氨基葡萄糖醇的半合成氨基酸糖苷类抗生素引入千家万户的。虽然这两种抗菌谱相似，但奈多星对氨基糖苷类化合物的转移酶稳定，而且耳肾的毒性低于其他类似产品，临床应用为硫酸和盐酸。美国药典32版(USP32)、英国药典2009(BP2009)、日本药局方15版(JPⅩⅤ)、《中国药典》2005年版(Ch.P2005)等药典中均对有关物质进行了控制。王建等曾建立HPLC-ESI-IT-MSn方法对硫酸奈替米星中有关物质的结构进行探讨,但在实验中未考虑流动相中三氟乙酸对有关物质离子化效率的影响,从硫酸奈替米星样品中只检出4个杂质,对其中的1个有对照品的杂质进行鉴定外,其余几个杂质均未进行结构推定,为此,笔者在文献基础上,应用了TFAfix技术,即在柱后添加丙酸,显著提高了电喷雾离子化效率,从硫酸奈替米星样品中检出了9个杂质。利用“诊断碎片离子推断策略”(Diagnosticfragment-ion-basedextensionstrategy,DFIBES)对检出杂质结构进行推定,即通过研究奈替米星和西索米星标准品的质谱裂解规律,总结出这类物质的质谱裂解规律,再以此结构为模型,对相似物质的结构进行推定,报道如下。1药品、标准品和标准品Agilent1100LC/MSDTrap液质联用仪(美国Agilent公司)。奈替米星标准品(批号:0355-200001,572u·mg-1)、西索米星标准品(批号:0353-200001,584u·mg-1)均由中国药品生物制品检定所提供,硫酸奈替米星原料分别由浙江震元制药有限公司(040412)和无锡市第二制药厂(20080501B、20080501C)提供;其余试剂均为色谱纯。2方法和结果2.1tfafix测定色谱条件:色谱柱:AgilentSB-C18(4.6mm×150mm,3.5μm);流动相:水-三氟乙酸-甲醇(84∶1∶15);流速:0.5mL·min-1;柱温:35℃。TFAfix方法:在色谱柱后接一个三通阀,用泵在柱后添加一定量的丙酸(20%丙酸,80%异丙醇,流速为0.05mL·min-1)。质谱条件:ESI离子源;离子源温度:350℃;雾化室压力:275.8kPa;干燥气流速:9L·min-1;离子扫描范围:m/z100~900;正离子方式检测,分流模式进样(分流比为3∶2),采用全扫描一级质谱(Fullscan)、自动全离子扫描二级质谱(AutoMS2)、手动多级质谱(manualMS3~4)3种方式采集奈替米星及有关物质的质谱信息。2.2供试品溶液的配制取本品适量,精密称定,加水溶解并定量稀释制成每1mL中含奈替米星约2mg(供一级质谱扫描)、5mg(供二级质谱扫描)和10mg(供多级质谱扫描)的供试品溶液。2.3奈替米星加氢离子二级质谱碎片离子用去离子水分别配制0.1mg·mL-1的奈替米星、西索米星标准品,按“2.1”的条件采集二者的一级、二级质谱,在负离子模式下未检测到相应的-离子,在正离子模式下,奈替米星和西索米星的基峰均为+,奈替米星加氢离子二级质谱碎片离子为:m/z458,441,350,317,299,282,233,215,191,160;西索米星加氢离子二级质谱碎片离子为:m/z430,413,322,289,271,254,205,187,163,160。二者裂解规律相同:A环与B环之间的糖苷键断裂是主要的裂解途径,奈替米星/西索米星的加氢离子(m/z476、m/z448)均失去A环(-126)形成子离子(m/z350、m/z322),子离子可继续脱去C环(-159)生成对应于B环的离子(m/z191/163),或脱去B环生成对应于C环的离子(m/z160);失去A环的子离子(m/z350,m/z322)可开环裂解,失去117,形成m/z233、m/z205离子,该离子可脱水,生成m/z215/187的离子;B环与C环之间的糖苷键也会断裂,失去C环(-159),生成丰度较小m/z317、m/z289离子;奈替米星和西索米星加氢离子脱水(-18)是另一主要裂解途径(m/z458和m/z430),该离子还会失去中性分子NH3(-17),生成离子(m/z441,m/z413),这两种离子均会失去C环(-159),生成对应的离子。它们的裂解途径见图1。2.4奈替米星乙基化合成副产物的质谱特征批号040412的奈替米星LC-ESI-IT-MS在正离子模式下的全离子扫描色谱图(TIC)见图2,为表达方便,按出峰的先后顺序命名各色谱峰,有关物质的编号与色谱峰号对应,即1号峰为物质1,2号峰为物质2,以此类推。物质1的+为m/z350,二级质谱为:m/z233、215、191、160,其裂解模式与奈替米星中m/z350(+)的三级质谱一致,由此可以推断,物质1为奈替米星的B+C环结构,为奈替米星的主要降解产物1-N-乙基-加洛糖胺(1-N-ethylgaramine)。物质2的+为m/z434,二级质谱为:m/z416、399、308、271、254、205、163、146,其中m/z416、399、308、146均比西索米星中的对应离子少14,即少一个亚甲基,提示物质2比西索米星少一个甲基,m/z271、254、205为西索米星A+B环的特征离子、m/z163为西索米星的B环离子,表明物质2具有西索米星的A+B环结构,由此推定物质2中缺失的亚甲基位置在C环上,m/z146等碎片离子均可印证推测合理,多级质谱数据也未能确定该亚甲基缺失的具体位置,其可能结构为3″或4″位脱甲基西索米星。3号色谱峰的+为m/z448,二级质谱裂m/z为:m/z430,413,322,289,271,254,205,187,163,160,与西索米星加氢离子的二级质谱一致,其色谱保留时间也与西索米星一致,可见物质3为西索米星。物质4、物质7和物质8的+均为m/z504,比奈替米星加氢离子(+m/z476)多28(相当于一个乙基的质量数),推测为奈替米星的乙基化合成副产物。物质4的二级质谱为:m/z504、486、387、378、345、310、261、219、160,碎片离子m/z160为奈替米星的C环离子,m/z219比奈替米星中B环离子m/z191多28,推测物质4中增加的乙基在B环上,m/z345、378、261等碎片离子分别比奈替米星的m/z317、350、233的碎片离子多28也旁证该推测的合理性,为明确该乙基在B环上具体位置,采用手动多级质谱模式:m/z504→219→MS3,得到三级碎片离子为m/z202,比m/z219小17,即B环上有自由的氨基存在,合成工艺可知,奈替米星B环上的1位氨基为优先乙基化氨基,因此物质4B环上自由氨基应在3位上,另一乙基化位置应为5位羟基上,由此推定杂质3的结构为5-O-乙基奈替米星。物质5的+为m/z603,二级质谱为:585、567、350、218、191、173;碎片离子m/z350为奈替米星B+C环的特征离子,m/z191为奈替米星B环离子,提示该化合物中有B+C环结构,为进一步确定结构,实验中对m/z585进行三级质谱扫描,得m/z567、469、459、350、300、282、236、218、191、174,其中m/z459比m/z585少126,提示物质5中有奈替米星中的A环结构,m/z603比m/z476多127的信息提示,物质5中另有一类似A环的结构,但其中的某个氨基可能为羟基所替代。三级质谱中出现了在奈替米星、西索米星及其他杂质的质谱中均未出现的碎片离子m/z236、218,提示该碎片离子为结构推定的关键离子,采集碎片离子m/z236的四级质谱,得碎片离子m/z128,125,112。根据上述一系列的质谱信息,经过结构尝试分析,最后得到物质5可能的结构见图3,用该结构解析二级、三级和四级质谱,各碎片离子均得到合理解释,提示该推测合理,该结构为首次发现,有待于用其他方法对其进一步的确认。物质6的+为m/z520,二级质谱离子为:392、361、275、233、215、160;m/z160对应奈替米星C环离子,m/z392、275、233比奈替米星B+C环及其衍生出的离子m/z350、233、191均大42,表明物质6与奈替米星有相同的裂解方式,但在B环上增加丙基或丙基的同分异构体,离子m/z215(比m/z233小18)提示其B环上有游离的羟基,丙基可能在其B环的3-氮位置,由m/z361比奈替米星中A+B离子m/z317多44推测物质6的A环比奈替米星的A环多2,提示其A环与依替米星一致,即在4′-5′位为饱和键,根据上述分析可知,物质6的可能结构为3-丙基-依替米星或其同分异构体。物质7的二级质谱为:m/z486、441、369、350、345、327、282、233、215、191、160、155,其碎片离子m/z350、233为奈替米星B+C环的特征离子,m/z191为奈替米星B环的特征离子,表明物质7的B+C环与奈替米星相同,乙基化发生在A环上,m/z345、327均比奈替米星的A+B环离子m/z317、299多28也旁证该推测;物质7的二级质谱中出现了丰度相对较高的A环离子m/z155,该离子在奈替米星、西索米星及其他几个杂质的加氢离子二级质谱中丰度很低,几乎观察不到,如果A环的2′位氨基上连接乙基,使得离子生成过程中由于发生了γH重排,形成相对稳定的离子(图4),据此可以推出物质7的结构为2′-N-乙基奈替米星。物质8的二级质谱为:m/z486、469、441、378、317、299、282、264、191、188、146,碎片离子m/z317、299、282为典型的奈替米星A+B环的特征离子,m/z191为奈替米星B环的特征离子,表明物质8的A+B环与奈替米星相同,增加的乙基在C环上,m/z378比奈替米星的B+C环离子m/z350多28、m/z188比奈替米星的C环离子m/z160多28,旁证该推测合理,为明确该乙基在C环上具体位置,采用手动多级质谱模式:m/z504→378→188→MS4,得到四级碎片离子为m/z170,144,113;对碎片离子进行分析表明,只有当乙基连接在3″-氮位上,这几个碎片离子才能得到合理解释,解析过程见图5,可以推断,物质8的化学结构为3″-N-乙基奈替米星。物质9的+为m/z490,二级质谱中子离子为:m/z472、455、364、341、317、299、282、233、215、191、174、146,其中m/z299、282、233、215、191与奈替米星的二级质谱中对应的碎片离子完全相同,m/z299、282分别对应于奈替米星的+及+,表明物质9中有奈替米星的A+B环结构,增加的14应在C环上,m/z364、174均比奈替米星中对应离子m/z350(B+C环)、160(C环)多14,推测物质9可能为物质2的二乙基化产物。根据上述推定过程,对硫酸奈替米星样品中有关物质可能化学结构式总结见图6。3西索米星的合成硫酸奈替米星样品中有关物质来源复杂,有合成起始原料西索米星及其引入的杂质去甲基西索米星等;有降解产物如1-N-乙基-加洛糖胺,有乙酰化过程中产生的二乙酰化副产物5-O-乙基-奈替米星、2′-N-乙基-奈替米星、3″-N-乙基-奈替米星等,以及起始原料中杂质在乙酰化过程中形成的副产物3-N-丙基-依替米星等。提高产品质量可从以下几个方面入手: