分光光度法测定叶绿素的误差分析

分光光度法测定叶绿素的误差分析

常绿叶子是植物生长发育、生理代谢变化和营养状况的基本材料，可以作为环境生理调查的指标。因此,叶绿素含量以及叶绿素a、b的相对比值常常用作研究植物生长发育的生理指标。测定叶绿素含量的方法有离体法(如分光光度法)和活体法(如叶绿素仪法)(苏正淑和张宪政1989)。分光光度法具有准确度高的特点,是叶绿素含量测定过程中应用最广泛的方法。由于生产分光光度计的厂家众多,不同型号仪器间的性能差异很大,在测定叶绿素含量,尤其是在叶绿素a与叶绿素b相对比值的测定过程中存在较大差异(杨善元1983;刘秀丽等1999;牟晓玲2004),因此影响了叶绿素作为植物生长发育参考指标的可比性。本文探讨了不同厂家的性能不同的分光光度计对测定植物叶绿素含量以及叶绿素a、b之间相对比值的影响,以供相关研究者参考。材料和方法1供试品种两种实验材料为水稻(OryzasativaL.)、棉花(GossypiumhirsutumL.)、玉米(ZeamaysL.)(分别由本校水稻组、棉花组和玉米组提供)和喜荫植物吉祥草(ReineckiacarneaAndr.Kunth)(由本校园林公司提供)。利用上述实验材料的功能叶片测定叶绿素含量。2叶绿素的提取以水稻剑叶作为分离纯化叶绿素的材料。叶绿素的提取和分离参照果秀敏等(2000)的方法并进行适当修改。将水稻功能叶片(剑叶)置于石油醚(30~60℃)-无水乙醇(3:2,V/V)混合溶液中研磨成浆状,转移至分液漏斗中,加入等体积的蒸馏水洗去水溶性物质和乙醇,静置分层(必要时加少量的饱和NaCl溶液),取出含色素的石油醚溶液并置于暗中备用。将硅胶G60(青岛海洋化工厂,薄层层析用)与蒸馏水按1:3的比例研磨成浆状后涂布薄层板,晾干,于110℃下活化1~2h后用于叶绿素的薄层分离。流动相为石油醚(30~60℃)-丙酮-苯(2:1.5:2,V/V)混合液。分离后的叶绿素a、b分别用丙酮抽提,在暗中真空干燥后作为参照品。在暗中用80%丙酮提取叶绿素后用分光光度法测定叶绿素含量(王学奎2006)并计算叶绿素a、b的相对比值,重复3次。实验中采用的分光光度计分别来自尤尼柯(UNICO,上海)、日立(HATACHI)、北京瑞利、上海上分和上海光谱5个厂家,前两种分别为固定狭缝(1.8nm)、波长精度为±0.5nm和可调狭缝(0.1~5nm)、波长精度为±0.3nm的具有波长自动校准功能的双光束分光光度计,后三种分别为狭缝宽度2、4、6nm(波长精度均为±2nm)的单光束分光光度计。结果1线性关系和参照品的制备水稻叶片的混合色素经硅胶G60薄层分离后可得到7种不同的色素斑点(图1),从展开剂端至点样端依次为:β-胡萝卜素、去镁叶绿素a、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、紫黄质和新黄质,这与已有的研究结果(彭光华等1998;果秀敏等2000)相吻合。将分离得到的叶绿素a和叶绿素b分别用80%丙酮抽提后测定其在红光区的吸收光谱(图2),其峰型对称,与相应的标准图谱一致,说明经层析分离得到的叶绿素a、b具有较高的纯度,再于暗中低温真空干燥后得到的粉状物作为叶绿素a、b“标准品”的参照品。将层析、纯化、真空干燥后的叶绿素a、b分别溶于80%丙酮中,在其最大吸收波长处于不同狭缝(可调狭缝、双光束分光光度计)下测定吸光度后,参照相应的摩尔吸光系数计算出实测浓度(表1)。结果表明,较小的狭缝宽度(0.1和0.5nm)下测定结果的标准差(SD)较大,狭缝宽度等于或大于1nm时测定结果的标准差小;但随着狭缝宽度的增加,测定结果呈现减小的趋势;狭缝宽度小于0.5nm或大于4nm时,测定结果的相对误差均较大。2叶绿素含量及其比的测定结果选取C3植物水稻、C4植物玉米和喜荫植物吉祥草的功能叶片,用80%丙酮研磨抽提得到叶绿素混合溶液,采用2种具有波长自动校正功能的双光束分光光度计测定叶绿素含量的结果(表2)表明,对于最大吸收波长为663nm的叶绿素a而言,波长偏差在2nm以内时,对定量测定值的影响不显著;但波长偏向长波(665nm)时,对叶绿素a测定值的影响程度明显大于短波(661nm)偏离的影响。就叶绿素混合液中最大吸收波长为645nm的叶绿素b(80%丙酮溶液中)而言,波长偏离会严重影响含量的测定。波长偏离1nm时,虽然对叶绿素b含量测定的影响程度尚未达到显著差异水平,但与645nm下的测定结果相比,其相对偏差达到4%~7%;一旦波长偏差达到2nm时,则叶绿素b含量测定结果的相对偏差大于10%,差异显著。波长偏差对叶绿素b含量测定的影响显著大于叶绿素a含量的测定,因此相应地影响了Chla/Chlb的比值,波长红移时引起Chla/Chlb的值偏低,波长蓝移时引起Chla/Chlb的值偏高,当波长偏差达到2nm时,会导致Chla/Chlb产生显著偏离(表3)。无论是玉米(Chla/Chlb≈3.7)还是水稻(Chla/Chlb≈3),叶绿素混合溶液在红光区的吸收光谱(图3)都只呈现一个明显的吸收峰,只是在短波方向的半峰宽明显增加;即使是对于Chla/Chlb接近2的喜荫植物吉祥草而言,叶绿素b在红光区的吸收也只出现一个不很明显的肩峰(图3曲线3)。除了叶片中叶绿素b的含量相对较低外,其他原因就是叶绿素b在红光区的摩尔吸光系数明显小于叶绿素a且两者的吸收峰之间相互重叠。因此,从叶绿素混合溶液来说,在波长“蓝移”的情况下会导致Chla/Chlb偏高,当波长“红移”时则引起Chla/Chlb偏低。表4是不同类型的分光光度计对不同植物叶绿素含量及其比值测定的结果。从表4可见,具有波长自动校准功能的双光束分光光度计对叶绿素含量及其Chla/Chlb比值的测定结果之间具有较好的可比性;而波长精度为±2nm的单光束分光光度计测定的数据之间有较大甚至显著的差异,缺乏可比性,并且导致Chla/Chlb与其相应的“理论值”之间出现较大出入。叶绿素含量与波后波长的相关性表3叶绿素的含量变化与植物生长发育状况以及环境变化密切相关,因此在研究中涉及叶绿素含量及其比值测定的报道或综述文献很多,由于试验材料的差异以及实验中使用的分光光度计的性能不同,导致实际研究过程中测得的叶绿素含量等结果之间存在很大差异,特别是Chla/Chlb的相对比值差异更大。对于Chla/Chlb理论值≈3的C3植物,已有报道的测定值低的甚至小于1(牟晓玲2004),高的则远大于3(杨善元1983;刘秀丽等1999),本实验中也同样出现水稻和棉花Chla/Chlb的测定值分别大于6、大于4的情况(表4),以致测定数据之间不具相互可比性。无论是C3植物(水稻)还是C4植物(玉米),使用具有波长自动校准功能、波长精度较高的双光束分光光度计时,实际测得的Chla/Chlb的相对比值不仅与相应的理论值接近,且叶绿素定量结果之间也有较好的可比性和重现性。本文的研究结果表明,使用波长精度和波长重现性相对较差的单光束分光光度计测定叶绿素含量及其比值时,其结果之间缺乏可比性(表4),同时Chla/Chlb相对比值也与相应的“理论比值”存在较大偏差。分光光度法定量测定叶绿素时,通常根据混合溶液中叶绿素a和叶绿素b在红光区最大吸收波长处的吸光度值、按Arnon公式计算出叶绿素含量。虽有报道称Arnon公式也会引起测定结果的偏差(段光明1992;唐银凤1996),但这种方