登革病毒的发病机制及研究现状

登革病毒的发病机制及研究现状

病毒登格病毒（dv）是一种具有囊膜的单体生成性和正链rna病毒的。矩阵为10.11k，编码三种结构蛋白（c、c和e）和七种非结构蛋白（ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b和ns5）。自然界存在的登革病毒有四种血清型,均可引起温和的登革热(DF)和严重的致死率很高的登革出血热(DHF)、登革休克综合征(DSS),而关于DF至DHFDSS的发病机理迄今尚未阐明。近年来强毒力病毒理论开始获得一些直接证据,越来越受到研究者的重视,该理论认为DHFDSS的发生是受一种毒力更强的登革病毒株的感染。随着DNA测序技术的发展,登革病毒毒力的研究正进入一个新时期。1乳鼠感染登革病毒的致病模型登革病毒毒力指的是对人或易感动物的致病或致死能力,具体表现为在其感染的人或动物中引起的发病率与死亡率。研究者要测定病毒的毒力,需要一个与人体有相似发病过程及病理特征的动物模型。人、低等灵长类动物及蚊虫是登革病毒的自然宿主,但只有人被登革病毒感染后出现临床症状。黑猩猩、恒河猴、长臂猴、狒狒等均可被登革病毒感染,但仅出现病毒血症。小鼠是生物医学研究中使用数目最多的哺乳类实验动物,用适应在鼠脑组织中复制的登革病毒经脑内接种可使乳鼠产生脑炎。强毒株乳鼠模型可表现出严重的脑内感染,因脑炎而死亡,乳鼠感染登革病毒后的发病过程与人体不同。尽管如此,目前对登革毒力研究仍多采用乳鼠模型,以登革病毒经脑内注射后乳鼠有无发病及死亡率的高低作为衡量其毒力大小的标志。登革病毒的致病机理一直混沌不清,主要障碍之一是没有与感染登革病毒的人体症状一致的实验动物模型,无法直接对致病因子进行验证。目前除了乳小鼠模型外,还常常以毒株的物理学性状、理化特征作为毒力大小的标志,如空斑特征和温度敏感性等。最近Johnson等建立了一个成年小鼠的致病模型。他认为干扰素(IFN)在抗登革病毒感染中起到很重要的作用,因此他选择干扰素功能缺陷的小鼠做动物模型。发现将小鼠适应DEN-2腹膜内注射入不同年龄组的AG129小鼠(缺乏alphabetaIFN和gammaIFN接受基因)中,得到了一致的死亡率。用他自己研制的疫苗免疫过的小鼠则可抵抗该病毒的攻击,因此AG129小鼠是一个适用于登革疫苗研究的动物模型。2革命毒的毒力控制2.1den突变株对乳鼠神经毒力的影响目前通过比较强、弱毒株核酸序列的差异已发现了多个登革病毒毒力相关位点,根据获得减毒株途径的不同,可将其分为五类。一类,在敏感细胞上连续传代获得的突变株。登革病毒可在多种原代和传代细胞上增殖并产生细胞病变作用和空斑,如BHK21、HeLa、KB、Vero、LLC-MK2、FRhL和C636等。而较多文献报道的是通过在原代狗肾细胞(PDK)中连续传代,获得对人体减毒株。Puri等用DEN-1有毒株45AZ5PDK-0在PDK细胞中传代10、20、27次,再分别在FRhL细胞中传3代,得到3株突变株45AZPDK-10、20、27。对猴和人志愿者接种,发现3株突变株随传代次数增加减毒程度依次增大。测序结果表明,在45AZPDK0至10代中,E156由Thr变为Ile,可能影响毒力。在45AZPDK10至20代中,E44由Glu变为Lys是唯一的突变,它应该是影响毒力的氨基酸位点。45AZPDK20至27代中,E366由Asn变为Asp,此突变位于E蛋白的III区(domainIII),是黄病毒粘附细胞受体的位置,很可能影响对乳鼠的神经毒力和细胞嗜性。Sanchez等根据DEN-2Mexican株在LLC-MK2细胞单层上的形成噬斑的大小分为三组。大噬斑毒株组对乳鼠有强神经毒力,其余两组毒力相对较弱。测序结果表明,仅E390位突变产生氨基酸替换。其中大噬斑组由Asp变为His;具有较小噬斑和乳鼠神经毒力的3毒株由Asp变为Asn。说明E390位可能是DEN-2乳鼠神经毒力相关位点,这一替代亦发生在III区。二类,在宿主动物体内繁殖和传代获得的突变株。将登革病毒在鼠脑连续传代,使之适应在鼠脑中生长,可获得高生长滴度的病毒和乳鼠神经毒力突变株,并可能同时对敏感人群减毒。Bray等1991年将无鼠神经毒力的DEN-2NGC株(DEN-2-P)在鼠脑中连续传38代,获得1株鼠神经毒力适应突变株(DEN-2-N),并证实对敏感人群显著减毒。两毒株基因组全序列中共有10个核苷酸位点改变,分别位于PrM、E和NS1区,他们以DEN2-N的PrM或NS1基因分别替代全序列DEN-4814669cDNA中的相应基因,结果DEN-2-N(PrM-E)DEN-4嵌合体对乳鼠有神经毒力,DEN-2-N(NS1)DEN-4则没有。进而在DEN-2-P(PrM-E)DEN-4中引入前述PrM、E区中各种组合的点突变,发现仅含有E71Glu变为Asp和E126Glu变为Lys突变的嵌合体具有鼠神经毒力。Bray等认为E71Glu变为Asp,两者皆带负电荷,为保守的氨基酸替代;E126Glu变为Lys,是从带负电荷氨基酸转换为带正电荷氨基酸,可能在DEN-2鼠神经毒力中起重要作用。Kawano等发现鼠适应DEN-4H241株(H241N)对乳鼠有很高的神经毒力,而它的非鼠适应型亲本(H241P)无毒。比较发现两者结构蛋白区有5个氨基酸不同,通过在一系列分别包含一或两个突变氨基酸的嵌合体分析表明,有两个氨基酸改变是鼠神经毒力的重要决定因子。E155位点以Ile替换Thr,去掉了父本E区两个保守糖基化位点中的一个,因此E糖基化位点的损失在DEN-4鼠神经毒力改变中起重要作用。E401位Leu替代Phe产生神经毒力,但起的作用比E155小。另外,H241N对鼠的LD50比H241N(C-PrM-E)DEN-4稍高,而且两毒株平均致死天数比较差异显著,说明DEN-4非结构蛋白基因对鼠神经毒力也有一定的影响。三类,定位点突变和缺失突变获得的突变株。重组DNA技术是一种具有极高效率的产生突变方法,且理论上可产生各种可能的突变,这样就能对某一特定区段DNA的功能进行更为细致的研究。定位点突变技术目前主要应用于研究编码区序列与毒力的关系。Chen等用DEN-3CH53489的C-PrM-E基因替代了DEN-4814669全长cDNA中相应基因,构建DEN-3DEN-4嵌合体。再用定位点突变的方法在嵌合体E126、155位引入Glu变为Lys、Thr变为Leu的突变。乳鼠神经毒力实验结果表明,DEN-3父本和DEN-3DEN-4嵌合体无毒力,含E126Lys的嵌合突变体则有毒力,含E155Leu的嵌合突变体无毒力。作者推测E蛋白中带电荷氨基酸替代能改变对乳鼠神经毒力,而尽管E155Thr变为Leu减少了嵌合体E蛋白的一个糖基化位点,但嵌合体E蛋白大小与野生毒株一致,表明此糖基化位点在正常情况下不使用,没有使乳鼠神经毒力发生改变。Gualano等用在鼠脑传代24次的DEN-2NGC株构建了全长cDNA克隆pD-VWS501,可通过体外转录、转染后获得具乳鼠神经毒力的MON501。DEN-2PUO-218株不具有乳鼠神经毒力,以其PrM和E基因替代pDVWS501中相应序列,构建了第2个全长cDNA克隆pD-VWS310,通过体外转录、转染后获得的MON310对乳鼠不具有神经毒力。将MON501中E126Lys用Glu替代,MON310中E126Glu用Lys替代,可分别大大减弱或增强乳鼠神经毒力,从而证实了E126是DEN-2乳鼠神经毒力相关位点。缺失突变技术主要应用于研究非编码区序列与毒力的关系。Cahour等用OL-PCR方法,获得DEN-45′非编码区(18~98)位去除了不同区域核甘酸的cDNA片段,再用与DEN-4814669株全长cDNA重组的方法构建缺失突变株。发现4个去除区位于长茎区的突变株是致死突变株;7个去除区位于短茎或环区,噬斑小,在LLC-MK2和C636细胞生长速度下降,其中去除82~87段核苷酸的突变株可能对人毒力下降。Men等采用同样方法去除DEN-4814669全长cDNA中3′非编码区不同长度和位置的片段,构建一系列去除突变株。大多数突变株在LLC-MK2细胞培养中出现噬斑比野生株晚,在C636细胞中产生噬斑小。但突变株3′303~183(3′去除303~183nt片段的核苷酸)在这些细胞培养中有较高的生长滴度,可达到野生株产率,并可诱导猕猴产生与野生株相同水平的抗体,而其余去除突变株诱导猕猴产生的抗体水平均低得多,所有去除突变株引起猕猴病毒血症水平低或无法检出。四类,从不同症状病人中分离的不同毒株的序列比较。从不同症状病人中分离的野生毒株的序列比较在登革病毒毒力研究应占据重要地位,所采用的测序毒株在细胞或动物中传代次数要尽可能的少。Igarashi等在泰国同一流行地区、4周时间内分别从DF、DHF-Ⅰ级、DHF-Ⅱ级、DSS病人中分离出4株DEN-2,测序表明4毒株C和M区的氨基酸序列完全一致。DF分离株PrM-16位点是Arg,而其余3株为Ile,DSS分离株NS1-279位点为Gly,而其余3株为Asp,这些差异可能显著改变PrM和NS1的特性。4株毒株在5′末端完全保守,但DF株在3′末端的核苷酸改变,导致其3′二级结构与其余三株完全不同。五类,对具有已知功能的基因组序列直接突变获得的突变株。E蛋白抗原表位的变化会影响病毒对宿主细胞的吸附,从而影响到病毒毒力。Hiramatsu等发现DEN-2E386~397位的氨基酸序列为单克隆抗体3H5的抗原表位,其上游区E383~385为Glu-Pro-Gly,是DEN-2保守序列。利用DEN-4814669全长cDNA克隆,构建了一系列在E383~397区发生单个氨基酸突变的DEN-2(PrM-E)DEN-4嵌合体。结果表明,E383~385区任何一个氨基酸被替代都会导致不再被3H5中和,对乳鼠神经毒力完全或接近完全丧失,说明这三个氨基酸位点与是乳鼠神经毒力有关。PrM、E和NS1为糖蛋白,需要经过翻译后切割并添加N-连接聚糖,使之糖基化。通过对这一过程进行改变,可引起蛋白质突变并使病毒减毒。Pryor等在pDVWS310和pDVWS501中引入减少PrME切割位点的突变,获得两株抑制PrME切割的突变株。一株在PrM164位点引入突变,由Ser变为Ile;另一株在NS1蛋白亲水区Glu173和Lys174用Ala替代,使NS1缺乏第2个糖基化位点。两株突变病毒在细胞培养中生长减慢,对乳鼠神经毒力下降。综上所述,登革病毒毒力是多位点控制的,并非只有一个毒力因子发挥决定或主导作用。从多株登革病毒测序结果可知,核苷酸的变异在基因组序列内是随机分布的,而不是密集在特定区域内。可以推测,登革病毒毒力的变化是通过不同机制引起的,如5′和3′非编码区核苷酸一级结构和二级结构可能在病毒的复制周期参与必要的调节功能,因此在非编码区核苷酸序列的突变可干扰病毒的转录和复制。E和M(或它的前体,PrM)结构蛋白都能介导中和抗体的保护性免疫反应,NS1也是一个保护性抗原,在RNA复制中起重要作用。单个氨基酸的变化往往就能影响这些蛋白的功能,从而影响毒力。2.2基因组序列中影响毒力的3个部位目前发现的登革病毒的毒力位点大多在E区,PrM和nS1区也有涉及,C区氨基酸序列则趋于保守。多项实验表明非结构蛋白编码区对毒力有影响,5′和3′非编码区某些区段缺失严重影响毒力。E蛋白是黄病毒属的主要表面抗原,很可能与细胞受体连接和细胞膜融合有关,包含了诱导中和抗体的主要表位。目前认为黄病毒E蛋白基因组序列中影响毒力的3个区段是:(1)Ⅲ区(domainⅢ)(残基303~395),此区的突变改变病毒粘附至细胞的功能,影响病毒进入细胞和细胞嗜性;(2)Ⅱ区(domainⅡ)(残基52~136和190~284),此区的改变会影响病毒的促融合活性(fusogenicactivity);(3)Ⅰ区Ⅲ区分界面之间的联系,这一区是构成病毒和细胞膜联系的E蛋白单体形成二聚体和三聚体的位点。在所有被认为与毒力有关的位点中,E126位点得到多篇文献、不同实验室的研究结果的验证,为DEN-2、DEN-3的毒力相关位点。在黄病毒的三维结构中,E126Lys位于Ⅱ区E二聚体平面向外延伸的d-e环的最上方。d-e环由带正电荷的氨基酸占据,Glu变为Lys使d-e环中唯一的带负电荷的氨基酸变为带正电荷氨基酸,这一电荷变化可能改变了病毒和细胞间的相互作用。E155(156)作为E蛋白糖基化位点,被破坏后影响病毒毒力,已在DEN-1、DEN-4得到证实,但Chen等认为E155不是DEN-3毒力相关位点。2.3den-2-mexicar3/meq-3毒株登革病毒能够发生毒株内突变,上文已列举了许多点突变引起登革病毒毒力发生改变,更有一些实验直接证明登革病毒准种的存在。Sanchez等发现DEN-2Mexican分离株是由序列不同的毒株组成,其乳鼠神经毒力、LLC-MK2细胞单层培养中的噬斑大小也不同。Kin