-花青素细胞刺激素对下丘脑葡萄糖敏感神经元放电活动的影响

-花青素细胞刺激素对下丘脑葡萄糖敏感神经元放电活动的影响

i-mth是由阻断氨基酸（popc）生产的黑皮质素家族（mh）引起的最具抑制作用的黑皮质素家族的成员。在已知的5种黑皮质素受体中只有MC3R和MC4R分布于脑内,α-MSH是其内源性配体,介导生理性饱感信号,从而在调控体质量和能量稳态中发挥着重要作用。研究表明,在第四脑室或迷走神经背核注射MC3R/4R激动剂MTII或拮抗剂SHU9119分别产生抑制和促进摄食的效应。下丘脑室旁核(PVN)和下丘脑外侧区(LHA)接受大量由弓状核(ARC)POMC/CART神经元发出的传入信号,经过整合后进一步作用于下游的孤束核(NTS)。而NTS内的POMC神经元在参与迷走-迷走反射的同时,进一步将外周来的信号整合投射到下丘脑的PVN等核团。我们先前已观察到α-MSH对脑干背侧迷走复合体(DVC)的葡萄糖敏感神经元和胃扩张敏感神经元的放电活动具有调制作用,但是α-MSH对下丘脑葡萄糖敏感神经元的作用仍不清楚。大量的研究结果已证明,LHA主要含有葡萄糖抑制型(GI)神经元,VMH主要含有葡萄糖兴奋型(GE)神经元,而PVN中含有GI和GE两类神经元。本实验旨在通过观察α-MSH对下丘脑葡萄糖敏感神经元放电活动影响,从而进一步探讨α-MSH在下丘脑参与摄食调控的可能机制。1材料和方法1.1饲养管理健康Wistar大鼠150只,雌雄各半,体质量250～300g,由青岛市药品检验所提供。依据青岛大学动物饲养道德规范饲养,室温20～25℃,12-12h昼夜循环光照条件下,自由摄食和饮水,预养1周。实验药品α-MSH、SHU9119及葡萄糖D-(+)-Glucose均系Sigma公司产品,其使用浓度分别为500nmol/L、1mol/L和0.5mol/L,pH7.4,以上药品均以9g/L的NaCl溶液配制。1.2立体定位仪乌拉坦(1.0g/kg)腹腔麻醉大鼠,手术中酌情追加水合氯醛。维持体温(37±1)℃。将大鼠置于立体定位仪上,门齿条低于耳杆中心3.4mm。剪去大脑上方皮肤,用牙科钻去除颅骨,清除脑膜,以加热的30～40g/L琼脂生理盐水溶液覆盖在大脑表面,并保持前后囟水平。1.3压力注射检测paxilus-w龙制备四管玻璃微电极,尖端直径约3～10μm,电极阻抗5～20MΩ,用于电生理记录和微量注射。记录电极充灌0.5mol/L的醋酸钠和2g/L滂胺天蓝(pH7.7)。另外3管分别充灌α-MSH、葡萄糖及生理盐水或SHU9119,分别与压力注射仪的管道相连。按照Paxinos-Watson图谱定位。LHA:前囟后(AP)1.8～2.3mm,旁开(L/R)1.5～2.0mm,深度(D)7.5～9.0mm。PVN:AP为1.8～2.3mm,L/R为0.1～0.4mm,D为7.7～8.4mm。VMH:AP为2.8～3.3mm,L/R为0.2～1.0mm,D为9.3～10.0mm。1.4葡萄糖敏感神经元放电频率的测定通过监听器声音变化和监视器显示基线漂移突然变细的现象来判断电极尖端到达空气与琼脂界面,用液压推进操纵器将微电极下至接近预定深度寻找神经元,经4-导压力注射仪(PM2000B,MicroDataInstrument,Inc.USA)将药物注射到神经元表面。记录放电神经元稳定放电至少150s后,加压注射葡萄糖(GS),观察其放电频率的变化,注射前后放电频率改变在20%以上者记为葡萄糖敏感神经元。待放电频率恢复稳定至少150s后,再微量注射α-MSH观察3～6min,待放电频率再次恢复并稳定至少150s后注入生理盐水作为对照。或者待放电恢复并稳定150s后注入SHU9119,然后于20s内注入α-MSH对比观察其放电频率的变化。放电信号经MEZ-8201型微电极放大器输入VC-11双道示波器的上线显示波形,电信号经由示波器同步Y轴输出,通过SUMP-PC生物信号处理系统输入计算机,由Histo软件进行放电频率分析。1.5大鼠脑注射法记录完毕,通过玻璃微电极电泳,滂胺天蓝标记最后一个记录位点(-20μA,15min)。大鼠在过量麻醉下,经心脏灌注生理盐水100mL,随后用40g/L多聚甲醛溶液150mL灌注固定;取脑后固定4h;冠状冷冻切片(厚度100μm),确定记录神经元的位置。1.6神经元弃之用量对符合鉴定标准的神经元进行分析,非葡萄糖敏感或者记录位置在3个核团之外的神经元弃之不用。用MATLAB7.0和SPSS16.0软件统计,实验数据以x¯±sx¯±s表示。加药前后频率变化比较采用成对t检验,放电频率变化百分比之间的比较采用独立样本t检验,P<0.05为差异有显著性。2结果2.1gs对火炬放空频率的影响在LHA记录到的78个神经元中有26个(33.33%)GE神经元,36个(46.15%)GI神经元。36个GI神经元中有75%(27个)被α-MSH所抑制。而26个GE神经元中被α-MSH所兴奋和抑制的神经元数目相等,均为8个。对于被α-MSH抑制的27个GI神经元,在加入GS前后放电频率分别为(5.61±0.87)和(2.62±0.55)Hz,加入GS前后放电频率比较差异有极显著意义(t=6.79,P<0.01),平均降低了56.16%±3.84%;而在加入α-MSH前后其放电频率分别为(3.72±0.49)和(1.39±0.29)Hz,加入α-MSH前后其放电频率比较差异有显著性(t=6.08,P<0.01),平均降低了59.99%±4.51%。其中12个被α-MSH抑制的GI神经元,先后加入SHU9119和α-MSH,神经元的放电频率变化百分比由(52.90±1.53)%降低到(20.88±0.60)%(t=3.38,P<0.01),表明α-MSH对GI神经元的抑制效应部分被阻断。2.2-msh前后放电频率的变化在PVN共记录到68个神经元,其中有27个(39.71%)GE神经元,其中24个被α-MSH兴奋;有20个(29.41%)GI神经元,其中14个被α-MSH抑制。其中被α-MSH兴奋的24个GE神经元,在加入GS前后的放电频率分别为(3.20±0.75)和(5.99±1.03)Hz,加入GS前后的放电频率比较差异有显著意义(t=6.88,P<0.01),平均升高了128.64%±18.87%;在加入α-MSH前后放电频率分别为(2.06±0.22)和(5.00±0.54)Hz,加入α-MSH前后放电频率比较差异有显著性(t=7.05,P<0.01),平均升高了(156.53±19.65)%。被α-MSH抑制的14个GI神经元,加入GS前后的放电频率分别为(1.74±0.31)和(0.61±0.16)Hz,加入GS前后的放电频率比较差异有显著性(t=6.71,P<0.01),平均降低了(67.86±3.73)%;给予α-MSH前后放电频率分别为(1.43±0.17)和(0.28±0.07)Hz,给予α-MSH前后放电频率比较差异有显著性(t=8.46,P<0.01),平均降低了(77.79±4.08)%。对7个被α-MSH抑制的GI神经元先后加入SHU9119及α-MSH,放电频率变化百分比由(152.32±37.46)%降低到(27.09±7.56)%(t=3.27,P<0.01)。对18个被α-MSH兴奋的GE神经元同样预先给予SHU9119,其放电频率变化百分比由(143.48±22.06)%降低到(39.84±6.28)%(t=4.52,P<0.01),结果表明α-MSH的效应部分被阻断。2.3gs前后e神经元放电频率的变化在VMH共记录到的56个神经元中GE神经元有22个(39.29%),GI神经元有8个(14.29%)。22个GE神经元中被α-MSH所兴奋的神经元有20个(90.91%)。被α-MSH所兴奋的20个GE神经元,加入GS前后其放电频率分别为(1.68±0.22)和(4.12±0.51)Hz,加入GS前后其放电频率比较差异有显著意义(t=6.44,P<0.01),平均升高了(167.42±20.66)%;而在加入α-MSH前后其放电频率分别为(1.59±0.19)和(3.93±0.32)Hz(t=9.24,P<0.01),平均升高了(181.91±32.52)%。其中有10个被α-MSH所兴奋的GE神经元预先给予SHU9119,其放电频率变化百分比由(186.20±50.36)%降低到了(24.31±5.89)%(t=3.19,P<0.05),表明α-MSH对GE神经元的兴奋效应部分被阻断。3mc4r基因缺陷对人类实验者的作用中枢POMC系统调节能量平衡是通过黑质素受体(MC4R/3R)的内源性激动剂α-MSH及其内源性的拮抗剂AgRP的作用来实现的。POMC的过度表达会伴随MC4R/3R以及α-MSH的表达增加,从而导致饥饿感增强,这些效应都能够通过预先给予SHU9119而得到抑制。有研究结果表明,用α-MSH免疫后大鼠与正常组对比在限制摄食和继续腹腔给予α-MSH后,其摄食量有明显增加。预先脑室注射SHU9119,下丘脑促进摄食的临界点就会上调。POMC神经元仅在ARC和NTS两核内分布,而这两个部位又是通过与下丘脑的LHA、PVN、VMH等核团的纤维联系进行整合作用。本实验结果显示,在LHA内主要是GI神经元且大部分被α-MSH所抑制,在VMH内则主要为GE神经元且绝大部分被α-MSH所兴奋,而在加入MC4R拮抗剂SHU9119后,α-MSH的作用则大部分被阻断。我们传统认为LHA为饥饿中枢,VMH为饱食中枢,α-MSH通过抑制饥饿中枢同时兴奋饱食中枢从得达到抑制摄食的效应。人们普遍认为PVN在控制食欲以及能量平衡方面发挥着至关重要的作用,对促进和抑制食欲的信号的处理起到一个中转站的作用。本实验PVN内有88.89%的GE神经元被α-MSH所兴奋,70%的GI神经元被α-MSH所抑制,同时给予SHU9119后α-MSH的作用部分被阻断,说明了在PVN内这两类神经元的兴奋性可以被α-MSH所调制。本文结果也进一步证明了PVN在