结核分枝杆菌耐吡嗪酰胺和乙胺丁醇的pnca和embb基因突变分析及治疗对策

结核分枝杆菌耐吡嗪酰胺和乙胺丁醇的pnca和embb基因突变分析及治疗对策

目前，抗病性的药物条件非常严重，已成为核电站的治疗领域的难题。传统的结核菌药敏试验已不能满足临床早期开展有效化疗的需要。利用基因分析方法,快速的反应结核分支杆菌基因突变情况。本文通过分析106株临床分离株的传统药敏实验和embB、pncA基因,研究embB、pncA基因突变与耐EMB和PZA药物之间的关系,精确地反映患者的耐药情况,为临床治疗提供依据。1pcr扩增产物结核分支杆菌标准株来源于中国药品生物制品鉴定所;106例耐多药肺结核和对照组20例来源于我院住院患者。以上病例治疗前后均做培养和药敏,Bactec培养增菌、菌种鉴定和药敏试验:按“结核病诊断细菌学检验规程”进行分支杆菌培养、菌种鉴定和药敏试验。EMB、PZA的高、低耐药浓度标准分别为50、5、250和50mg/L。将分离株进行前处理后提取DNA,置-20℃保存备用。在25μl反应体系中,4种dNTP的终浓度各为0.2mmol/L,引物1、2的终浓度各为0.4umol/L,纯化的DNA模板10～100ng,TaqDNA聚合酶1μ。置DNA热循环仪扩增后,在2%琼脂糖凝胶中电泳检测扩增产物。结核分支杆菌16SrRNAl23-275位核苷酸(按大肠杆菌16SrRNA的编码位置)是原核生物高度变异的区域,扩增该区域272bp片段,在8%(29:1)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,由于不同种细菌DNA单链的空间构象不同,电泳后片段的迁移率也就不同,而呈现出不同的电泳图谱。与结核分支杆菌标准图谱相似的分离株判定为结核分支杆菌复合群;与其图谱不同的分离株判定为非结核分支杆菌。根据结核分支杆菌embB基因序列(基因库EMBL编号U68480)设计、合成的引物可扩增embB基因产生365bp片段。pncA基因序列(genebankaccessionnumbleU59967)设计P1和P2可扩增该基因32-313位碱基产生282bp片段(pncA上游)。引物P3和P4可扩增该基因265-512位碱基产生248bp片段(pncA下游)。PCR扩增产物在6%(59;1)。非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳,银染色后观察结果并照相。与结核分支杆菌标准株单链DNA迁移率相同的为野生型,出现泳动变位的为突变型。耐多药肺结核进行个体化化疗方案治疗,对照组进行普通化疗,化疗疗程为三个月。2embc基因106株分支杆菌分离株经传统菌种鉴定为结核分支杆菌;传统药敏试验结果显示,94例TB菌耐吡嗪酰胺(PZA)药物株中,高耐药37株,低耐药57株。83例TB菌耐乙胺丁醇(EMB)高耐药53株,低耐药30株。随机选94株耐多药分支杆菌分离株,经PCR-SSCP菌种鉴定分析,均与结核分支杆菌标准株的电泳图谱相似,进一步证明为结核分支杆菌。分析94例TB菌耐吡嗪酰胺(PZA)的pncA基因突变率为44.69%(42/94),其中pncA上突变率为30.9%(29/94),pncA下突变率为12.7%(12/94)。还发现1株pncA上和pncA下同时突变株。耐乙胺丁醇(EMB)的embB基因突变率为54.2%(45/83),两种基因同时突变率为11.8%(11/94),其中embB基因均在传统药敏的高耐药区域。高耐药37例TB菌耐吡嗪酰胺(PZA)中,pncA基因突变率为75.6%(28/37),占总体的35.1%(33/94);其中pncA上突变率为43.2%(16/37),pncA下突变率为29.7%(11/37),有1株pncA上和pncA下同时突变株2.7%(1/37)。PZA低耐药57例中,pncA基因突变率为24.6%(14/57),占总体的9.5%。其中pncA上突变率为22.8%(13/57),pncA下突变仅1例。embB基因突变均在传统药敏的高耐药区域,低耐药30株未见突变。选择耐多药住院病人进行Bactec培养增菌、菌种鉴定和不同梯度药敏试验和embB、pncA耐药基因分析,根据大量检验得出的第一手材料,分析embB、pncA突变与临床治疗的关系,有针对性地建立个体化化疗方案。建议方案有:2·5·1单药H、R、E、S均低耐药者,而联合用药敏感,可继续采用联合用药治疗。2·5·2单药中E、P高耐,并有基因突变,停E、P,改用H、O、R、K为主的联合用药治疗方案,另加免疫调节剂。2·5·3E高耐,并有基因突变,改用K、O、P为主和HRS的联合用药治疗方案,另加力克肺疾或丙硫异烟胺等药物。2·5·4药E、P低耐,但无耐药基因突变,还可坚持以HRE为主的联合用药,并加O、S、K、P等一项单药物及免疫调节剂治疗。2·5·5联合药敏发现P有低耐,并有耐药基因突变,但HRE或HRS联合用药敏感,决定在HRE或HRS基础上,去掉P,加O、1321、丙硫异烟胺和免疫调节剂治疗的治疗方案。经过治疗前后对比分析,痰菌转阴率为65.9%(62/94),病灶治疗有效率为69.1%(65/94),空洞治疗有效率为56.4%(53/94),与对照组有明显的差异。3e研发prca突变吡嗪酰胺(PZA)是一种烟酰胺类药物,它在体外酸性条件(pH5.0～5.5)下,具有抗分支杆菌活性,可能PZA是一种具有抗分支杆菌活性复合物(如吡嗪酸)的前身,在分支杆菌吡嗪酰胺酶的作用下,在细胞内转变成吡嗪酸而发挥杀菌作用,当吡嗪酰胺酶编码基因pncA突变后,使吡嗪酰胺酶活性丧失,而产生耐药现象,结果分析94例TB菌耐PZA的pncA基因突变率为44.69%(42/94)。另实验发现pncA基因突变以高浓度突变为主,占35.1%(33/94),低浓度耐药株大部分不突变,仅有9.5%突变。在突变株中以pncA上突变为主,突变率为30.9%(29/94)。pncA下突变也较常见,突变率为12.7%(12/94)。在低浓度中pncA下突变较少见,94株中发现1株pncA上和pncA下同时突变株。pncA基因突变是结核分支杆菌耐PZA的主要基因,且基因突变与耐药水平是有关系的,还有部分高浓度和大部分低浓度没有基因突变,提示可能存在其它耐药因素。乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)是1961年发现的一种具有抗分支杆菌活性的合成药物,是第一线抗结核药物。最近的研究表明结核分支杆菌耐EMB与阿拉伯糖基转移酶的编码基因embABC操纵子突变或emb蛋白过度表达有关,该操纵子由embC、embA和embB三个基因组成,其中embB基因(尤其是306位密码子)突变是耐EMB产生的主要原因。结核分支杆菌embB基因约3246bp,编码一个糖基转移酶,embB基因突变使糖基转移酶结构改变,影响了EMB和糖基转移酶的相互作用,而导致耐EMB的产生.通过PCR-SSCP技术分析了45株结核分支杆菌耐EMB分离株embB基因7597位至7961位碱基(编码215位至336位氨基酸),突变率为54.2%。大多数结核分支杆菌耐EMB是由于embB基因突变所致,少数是由于embC和embA突变所致。21.1临床分离植物的传统细菌鉴定及药物过敏试验结果22pcr-scp初步鉴定23rc-scp分析中的ebam基因24-vmmm、ppca突变与药物过敏试验之间的关系25pmmm、pcna突变与临床治疗之间的关系1·615pcr-scp分析、eit和pcla基因14pcr-scp初步鉴定13结核菌dna的制备和pcr扩增1·21传统药敏不同耐药期对embc基因的影响通过PCR-SSCP方法分析结核分支杆菌临床分离株的embB基因,可快速检测部分结核分支杆菌E