经穴注射骨髓间充质干细胞联合中药对糖尿病大鼠下肢血流的影响

经穴注射骨髓间充质干细胞联合中药对糖尿病大鼠下肢血流的影响

下肢缺血性疾病主要由下肢动脉阻塞、血栓闭塞性脉管炎和糖尿病引起。与股浅动脉、腓动脉、胫骨前动脉和胫骨后动脉一样，也有镇静、疼痛、感染、四肢坏死等疾病，最后约1.3名患者需要四肢骨折。临床常用血管搭桥术、球囊扩张术、支架植入术、动脉内膜剥脱术等手术方法进行治疗,但术后早期容易并发血栓形成,后期血管再度狭窄。而保守治疗效果不佳,给患者身心造成很大痛苦。近年来研究表明,目前主要是骨髓单个核细胞(bonemarrowmononuclearcell,BMNC)和自体骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)移植,可定向分化为内皮细胞,促进“血管生成”及“血管新生”,进而改善缺血肢体血液循环。董建勋教授在传统移植方法的基础上不断探索创新,率先在国内开展了辨证循经注射BMNC的方法,探索性治疗慢性下肢缺血性疾病42例,取得了较为满意的疗效。但是,对于循经穴位注射BMSCs、肌肉注射BMSCs,以及联合与单用益气活血中药这几种方法哪个更有效以及经穴注射BMSCs治疗作用机制仍不清楚。为了比较这几种治疗方法的效应差异,本研究采用经穴、肌肉注射BMSCs、联合以及单用益气活血中药的干预方法,监测了各种方法干预DM大鼠缺血后肢血流灌注量和皮肤温度的变化并分析了其机制,现报道如下。材料表面1.药物、药品和仪器80只体质量为200-220gSPF级雄性SD大鼠,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2012-0001,并随机分为8组,每组10只。1×PBS磷酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物有限公司),链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),100μL微量注射器(高鸽牌,中国),PeriScanPIM型激光多普勒血流成像仪(瑞典PERIMEDABCO.)。益气活血方药物组成:生黄芪120g,党参120g,炙甘草48g,当归120g,鸡血藤120g,川牛膝48g等。饮片由北京中医医院中药房提供,符合1995年版《中华人民共和国药典》相关规定,并由北京中医医院制剂室煎制。以上复方以大火煎开,文火水煎2次过滤去渣,合并水煎液后在中药液体包装机中浓缩成含生药1.5kg/L溶液作为灌胃浓度(相当于患者临床正常用药剂量的18倍)。4℃冰箱保存备用。方法1.造模前后股动脉并传统采血模型的制备80只雄性SD大鼠,经普食水适应喂养1周后编号,信封随机抽取70只按50mg/kg剂量空腹腹腔注射STZ以制备糖尿病模型。于造模后3、7、14、28d尾静脉采血针取血检测随机血糖浓度,以血糖值>16.0mmol/L作为糖尿病模型制备成功标准。造模前,大鼠经常规备皮、消毒、铺巾,经左侧腹股沟韧带中点(摸到股动脉搏动后)做1个1-1.5cm的纵行皮肤切口暴露股动脉。正常假手术组与DM大鼠假手术组:游离股动脉,不行结扎切除动脉术,直接缝合切口。DM缺血模型:大鼠左侧后肢缺血模型。游离股动脉后,用1号线结扎近端、远端股动脉和部分远端隐动脉,切除动脉和所有侧支血管。术毕,5-0缝合线缝合皮肤,建立糖尿病大鼠左侧后肢缺血模型。2.实验方法及仪器正常假手术组(正常血糖假手术组)、DM假手术组(糖尿病大鼠假手术组)、DM缺血组(糖尿病大鼠缺血组):予局部注射1×PBS+蒸馏水灌胃;中药组:缺血局部注射1×PBS+益气活血中药灌胃;局部注射组:缺血局部注射BMSCs+蒸馏水灌胃;局部+中药组:缺血局部注射BMSCs+益气活血方灌胃;穴位注射组:穴位注射BMSCs+蒸馏水灌胃;穴位+中药组:穴位注射BMSCs+益气活血方灌胃;采用全骨髓贴壁法获取并传代培养的第3代BMSCs,经流式细胞分析合格,用于本实验。局部注射取缺血组织与正常组织交界处等距离选取5个点为注射部位,穴位注射取穴如下:足太阴脾经三阴交:后肢内踝尖直上10mm处;足少阴肾经照海:后肢内踝下1cm;足少阳胆经环跳:后肢髋关节后上缘;足少阳胆经阳陵泉:后三里上外侧5mm处;足阳明胃经后三里:膝关节后外侧,在腓骨小头下约5mm处;每只大鼠共注射100μL浓度为1×107/mLBMSCs,每处注射20μL。中药浓度与剂量:1.5kg/L浓度中药与灌蒸馏水灌胃剂量根据大鼠体重以10mL/kg进行换算,于术后第2天起连续灌胃7d。使用PeriScanPIM型激光多普勒血流成像仪,激光波长为670nm。本仪器采用NR扫描模式,观察扫描面积宽10cm×10cm,扫描高度12-14cm,应用LDPI2.5图像软件,进行后肢体表血流图的记录、分析、处理。实验室室温保持在23-25℃之间。激光多普勒血流成像仪(LDPI)其输出结果以相对流量单位PU(灌注量)值表示,采用PU指数(PUI)=术侧PU/健侧PU,来表示术侧微循环的血流情况,PUI越大微循环缺血程度越低,侧支循环建立越好。本研究于术后2、7、14、21d在北京中医药大学科研实验中心检测激光多谱勒血流流速及血流散斑图。实验数据用SPSS19.0软件进行分析,计量资料用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA),两两比较采用LSD检验,用ue0af±s表示,交互作用分析采用方差分析,以α=0.05作为检验水准。造模情况分析70只糖尿病大鼠造模1个月后,大鼠血糖维持在16.0mmol/L以上者61只,DM模型成模率为87.14%,成模率高,成模稳定。在行大鼠左后肢缺血模型制备术后,DM大鼠左后肢缺血模型存活率为88.52%,每组大鼠造模情况见表1。经检验,各组数据均为正态分布,方差齐,可以进行比较。2.1穴位注射对pui术后第7天pui的影响经t检验,术后各组大鼠第7、14、21天PUI与第2天PUI组内比较,结果如下:正常血糖假手术组第7天PUI较第2天略有降低(P<0.05),穴位注射组、穴位+中药组PUI于术后第7天略有升高(P<0.05);DM缺血组、中药组、局部+中药组、穴位注射组、穴位+中药组PUI术后第14、21天大幅升高(P<0.05),且穴位+中药组PUI术后21d显著升高(P<0.01)。见表2,图1。2.2各组pui差值比较术后第7天与第2天PUI差值组间的比较:与正常假手术组、DM假手术组比较,局部注射组、穴位注射组、穴位+中药组的差值增加明显(P<0.05);与中药组比较,穴位注射组、穴位+中药组差值增加明显(P<0.05),差异有统计学意义(见表3)。术后第14天与第2天PUI差值组间的比较:与正常假手术组比较,DM缺血组、中药组、局部+中药组、穴位注射组、穴位+中药组差值增加明显(P<0.05);与DM假手术组比较,穴位+中药组差值明显增加(P<0.05),差异有统计学意义(见表3)。术后第21天与第2天PUI差值组间比较:与正常假手术组、DM假手术组比较,局部+中药组、穴位注射组、穴位+中药组差值增加明显(P<0.05),与DM假手术组比较,DM缺血组、中药组差值增加明显(P<0.05),差异均有统计学意义(见表3)。3.穴位注射的单独效应与双方差分析见表4。当不用中药时,局部注射的单独效应为2.7;当用中药时,局部注射的单独效应为1.5。经方差分析,两种干预方法的交互效应F=0.01,P>0.05,两者不存在交互效应。当不用中药时,穴位注射的单独效应为-11.8;用中药时,穴位注射的单独效应为-9.2,经方差分析,两种干预方法的交互效应F=0.008,P>0.05,两者不存在交互效应。辨证循经注射bmscs联合中药的方法及疗效评价下肢缺血性疾病主要包括血栓闭塞性脉管炎、肢体动脉硬化闭塞症、糖尿病周围血管病变等,属于中医“脱疽”范畴,属周围血管疾病中难治性疾病。糖尿病经常合并下肢动脉血管病变又称糖尿病周围血管病变(peripheralvasculardisease,PVD)是引起下肢缺血,最终导致截肢的主要原因。其发病率与非糖尿病者相比要高出20倍,严重的PVD患者除面临下肢截肢的危险,其死亡风险也增加了4-7倍。当前治疗DM下肢缺血性疾病的主要方法有:祛聚、溶栓、扩张血管、中医中药等,然而,这些方法主要用于病变早期、轻度的患者及无法行血管重建的患者,且多数效果不甚理想。临床将BMSCs移植到缺血的肢体可在局部形成血管内皮细胞,产生新生血管,但临床患者存在缺血部位广泛、BMSCs容积、浓度等原因对BMSCs的分化及疗效产生不利影响。董建勋教授在原有3种骨髓干细胞移植的方法(局部肌肉注射、静脉注射与动脉注射)基础之上不断探索、创新,提出辨证循经注射BMSCs联合中药以提高BMSCs存活率、分化能力,以及疗效的观点。本研究实验结果亦证实了该观点,经穴注射BMSCs联合益气活血中药干预糖尿病后肢缺血大鼠21d后,PUI达(88.80±10.44)%,使用经穴注射BMSCs联合中药的方法,大鼠缺血后肢血流灌注恢复速度快,与经穴注射BMSCs、局部注射BMSCs、局部注射BMSCs联合中药、单用中药的方法相比,能显著改善缺血大鼠后肢的血流量灌注,即经穴注射BMSCs联合益气活血中药的方法要明显好于其他干预方法,但是益气活血方中药与经穴注射BMSCs没有明显交互作用,需要进一步研究探讨。中医基础理论认为,气与血的关系还可以概括为“气为血之帅”“血为气之母”。《血证论·阴阳水火血气论》说:“守气者,即是血”,气能生血、行血、摄血。诸多研究证明,益气或活血方对改善微循环有促进作用,但目前研究多为单一活血方或益气方,益气活血方对骨髓间充质干细胞增殖作用研究较少。气有温煦的作用,血有濡养的功能,四肢百骸、五脏六腑皆赖气血以濡养,气能行血,血能载气,血流灌注得以改善。另外,辨证选取足太阴脾经、足阳明胃经、足少阴肾经、足少阳胆经进行循经注射BMSCs。通过对穴位的刺激,一取其可以调畅经络之气血;二可以濡养三阴、三阳之经脉;三可以滋养神经肌肉组织;四可以通过对躯体伤害性传入的抑制效应达到镇痛作用。董建勋教授认为BMNC来源于骨髓血,属于人体“阴中之阳”,具有生发、温煦、推动等作用。辨证循经注射BMNC,可以更好地发挥促进血管再生,提高BMSCs存活率,以濡养经脉,从而起到使缺血肢体