改良arlov评分及he染色组织学评价半横断性脊髓损伤模型

改良arlov评分及he染色组织学评价半横断性脊髓损伤模型

脊柱损伤（cp）是一种严重的疾病。中国每年有大量患者因暑假而出现严重的瘫痪和瘫痪。SCI后神经细胞及神经纤维如何再生及能在多大程度恢复功能等均是很关键的问题。近年来,人们为探讨脊髓损伤修复的机理进行了大量的实验研究。但到目前为止,在不同类动物实验中评价脊髓损伤往往存在很大差异,还没有一种与人类最为接近的理想脊髓损伤模型,为了提高实验的运用价值,我们用较接近人的非人灵长类动物恒河猴为实验动物,建立了成年恒河猴脊髓半横断模型以探讨脊髓损伤修复及再生机理,为今后临床应用提供一定的理论实验依据。1材料和方法1.1实验动物分组成年恒河猴8只,雌雄不限,年龄约两岁,体质量3.5～4.5kg(昆明医学院实验动物中心提供),随机分为假手术和脊髓半横断组两组,每组各4只。1.2椎旁肌研磨法氯胺酮(50mg/kg)复合安定(1.5mg/kg)肌肉注射麻醉动物,俯卧位固定,常规备皮,消毒铺巾,以T10棘突为中心取后正中切口,长约5cm,逐层切开背部皮肤、皮下组织、胸背筋膜,切开椎旁肌棘突附着处,Cobb剥离器于椎板骨膜下剥离椎旁肌至关节突部,干纱布填塞止血。自动撑开器牵开椎旁肌,清理椎板及棘突旁残余的软组织,切开T10棘上韧带及棘间韧带,剪除T10棘突及切开黄韧带,Kerrison钳咬开椎板,暴露脊髓。切开硬脊膜及蛛网膜,术中可见脑脊液流出及脊髓正常搏动,以脊髓后正中血管为标志,锋利尖刀片自脊髓后正中裂迅速轻划至脊髓左侧,划开软脊膜及部分脊髓组织。以同样方法依次分层切割,并切除1mm长左半脊髓,术毕间断缝合硬脊膜,分层缝合肌层与皮肤;假手术组同样切开椎板,但不打开硬脊膜。术后予青霉素钠80×104U静脉输液防治感染,加强管理及防治并发症。1.3石蜡包埋前角神经元的检测术后3月时,取两组试验猴,经左心室插管至主动脉,剪开右心耳,灌注生理盐水1000ml冲洗血液,再灌注1000mlZamboni液固定,取T12脊髓标本取材后固定1月,石蜡包埋水平切片,切片厚度为6μm,行HE染色、横切面通过细胞核为标准,计数脊髓灰质前角神经元。1.4神经功能的检测1.4.1行为观察观察术后24h、1月、2月、3月,后肢自主运动、肌力和肌张力改变。依据文献对肌力进行评分。1.4.2电极刺激试验采用丹麦DANTAC公司生产CantataTM体感诱发电位仪,按国际脑电图制定的系统,仿人体部位设置针记录电极和参考电极,极间阻抗<2KΩ。表面电极置于内踝刺激胫后神经,记录电极置于Cz(中央后回的电生理体表定位区),参考电极置于Fp(前额电生理体表定位区)处,刺激强度10mA,频率3Hz,叠加500次,基本波形为P1-N1-P2波,待波形稳定且重复3次时中止并描记结果。假手术组和脊髓半横断组每只猴分别于术后24h及3月进行测定,主要观察P1潜伏期和P1-N1波幅变化。1.5统计方法对各组脊髓灰质前角神经元数进t检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。2皮质体感诱发电位csep变化2.1形态学观察脊髓半横断组脊髓损伤处结缔组织增生与周围硬脊膜粘连,半横断切口处略向外膨出,对合不整齐,形成不规则的空腔,内有少许组织充填。脊髓损伤下位节段灰质中胶质细胞增多,半横断同侧灰质前角神经元数量(31.25±3.6)与半横断对侧前角神经元数目(68.74±2.8)相比明显减少(P<0.01)、细胞固缩,白质前、侧及后索有散在空洞形成(附图),假手术组灰质前角种经元数为71.35±3.62。2.2行为学观察伤后24h,假手术组双后肢肌力均为3级,脊髓半横断组左侧后肢为0级,肌张力下降,表现为迟缓性瘫,右侧为3级;伤后3d,假手术组双后肢肌力均恢复正常;伤后5～7d脊髓半横断对侧后肢恢复正常,能负重;伤后14d,半横断侧后肢肌容积减少,表现为左后肢痉挛性瘫,伤后一月,脊髓半横断同侧后肢肌力均为二级;伤后三月内,其中有两只左后肢为3级,其余均为4级且有主动握持及部分负重(附表)。2.2皮层体感诱发电位(CSEP)变化CSEP主要由后索传导,是检测感觉传导通路的客观、敏感指标,猴CSEP包括3个基本可辨认波,系列为P1-N1-P2,伤侧P1潜伏期为(32.9±10.43)ms,较对侧(19.7±1.89)ms明显延长。伤侧P1-N1波幅为(3.43±1.46)μυ比对侧(6.97±2.82)μυ明显减低。3讨论3.1损伤区神经元的恢复脊髓半横断后3个月,损伤处结缔组织增生与周围硬脊膜粘连,半横断处脊髓吻合较差,虽有少许组织充填,但仍形成不规则空腔,说明断端缺少支持物恢复其形态的连续性,由于成年哺乳动物的再生神经纤维难以逾越损伤造成的胶质瘢痕和液化坏死空洞,因此,必须借助于其他手段桥接诱导再生纤维通过损伤区,恢复已遭破坏的神经联系。形态学观察显示,脊髓损伤部位神经元数量较对侧明显减少,胶质细胞增多,说明存在损伤区神经元的丢失,可能由于神经营养因子分泌不足以及脊髓损伤后启动一系列自杀性瀑布反应所致。脊髓前角神经元固缩,且有散在空洞形成,为脊髓损伤后各种病理反应的组织学表现。3.2术后运动功能本研究通过切断成年恒河猴左侧T11脊髓观察后肢功能改变,术后左后肢运动功能完全丧失,14天可有部分恢复,2至3个月损伤侧肌力评分达最大值,且有主动握持及部分负重,脊髓半横断侧皮层体感诱发电位(CSEP)结果显示P1潜伏期延长,P1-N1波幅明显降低,为感觉传导通路受损的表现,国内孟晓梅等的研究表明,成年猴脊髓半切后体感诱发电位变化与后肢运动功能密切相关,为脊髓损伤后后肢运动功能的一项间接、客观的检测指标。机体对运动的正常控制体现神经系统不同水平之间精细和动态的平衡,脊髓严重或完全损伤后,很多动物在脊髓损伤以下节段可以重新出现后肢运动,损伤后脊髓逐渐最终部分获得对运动控制的能力,这些研究提示运动控制的可塑性,可能是由于损伤部位以下脊髓内固有神经元网络所致运动功能重建。此外,许多学者也认为,半横断对侧脊髓侧枝出芽也可能是促进神经功能可塑性的重要因素,即脊髓损伤后存在一定的自我修复能力。我们采用后入路急性脊髓半横断模型,用半横断侧与对侧进行比较,并选择种属较接近人类的恒河猴为实验动物,采用锐性分层切割的方法,以减少术中对脊髓的挤压,术后观察后肢神经功能的变化,建立了稳定、可重复的非人灵长类恒河猴脊髓半横断模型,所需装置简单、手术操