幼龄公山羊雌激素受体免疫反应产物分布特点的研究

幼龄公山羊雌激素受体免疫反应产物分布特点的研究

动物的繁殖功能主要通过eegaxy星（hyp-axys）实现。雌激素(estrogen,E)是HPG轴中影响动物生殖活动的重要激素之一,它通过雌激素受体(estrogenreceptor,ER)作用于靶器官而发挥其调节作用。近年来的研究结果表明,雌激素不仅作用于生殖系统,也深刻影响脑内神经元的结构和功能,包括性腺轴和内分泌网络的高级中枢下丘脑。已有研究证明,ER阳性产物广泛存在于大鼠、小鼠、环鸽下丘脑的一些核团及脑垂体和外周的一些器官如卵巢、睾丸、血管内皮、平滑肌、消化道、骨组织、前列腺、子宫、输卵管等。目前尚未见有关ER在山羊下丘脑-垂体-性腺轴中分布的详细资料。为了从形态学角度全面探讨ER在山羊神经生殖调控中的作用,本试验应用高灵敏度的免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(Streptaridin-peroxidase,SP)法对ER反应产物在幼龄山羊下丘脑、垂体、性腺中的表达进行了研究。1免疫组化sp法检测ca-小鼠肝脏组织病理学2月龄健康山羊4只,放血致死后,立即剖开腹腔取出睾丸,用生理盐水迅速漂洗组织块后,立即浸入4℃的含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB,pH7.3)固定24h,组织经脱水、透明、浸蜡、包埋后,做连续切片(片厚6μm)。取2套切片,一套做HE染色,确认细胞;另一套按试剂盒说明进行免疫组化SP法染色。性腺摘取后,迅速取下头部,向两侧颈总动脉同时注入37℃生理盐水400～500mL冲去残血,随后灌注4℃的含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.3)600～800mL,先快后慢。开颅取出羊脑,切取下丘脑和垂体,浸入上述固定液中,后固定12h。浸入4℃的20%蔗糖PB液,至组织块沉底后做额状冰冻连续切片,片厚40μm,隔3取2,取2套切片,一套做Nissl染色,作核团定位,部分用作阴性对照试验;另一套按试剂盒说明进行免疫组化SP法染色。2er免疫反应产物应用免疫组化SP法(DAB棕色反应法)染色的切片,背景无色或浅棕色,ER免疫反应产物呈棕色,阳性物质位于细胞核和胞质及突起;少数细胞胞核为阴性、胞质为阳性或胞质为阴性而胞核为阳性。对照组切片染色均为阴性,说明免疫组化SP法具有ER免疫反应的特异性。2.1神经元胞内神经纤维ER免疫反应阳性神经元呈深浅不等的棕色或棕红色,为多极或双极神经元,胞体呈不规则的圆形、卵圆形、梭形、三角形等,细胞直径为6.11～116.4μm,聚集或分散存在。神经元胞浆内充满棕色的反应物质,核着色较胞浆深,呈红棕色,居中央或偏向一侧,偶见双核神经元(图1,2)。部分神经元可见到1～3个突起,突起内也存在阳性反应物质。阳性神经纤维呈浅棕色细丝状或串珠状分布于阳性神经元间。第三脑室室管膜也可见大量小的深染的阳性神经元和大量密集排列的神经纤维。见表1。2.2er免疫反应阳性物质腺垂体中可见大部分的腺细胞呈深棕色强阳性着色,腺细胞形成的滤泡周围的ER免疫反应阳性物质呈斑块状不等。神经垂体中可见串珠样、大小不等、排列较均匀、染色较深的阳性纤维(图3)。2.3细胞间质和色谱分析睾丸中ER阳性反应细胞主要分布于睾丸曲细精管中的几乎所有的初级精母细胞和支持细胞,细胞的胞质、胞核均着色,但着色较浅,同时在睾丸间质中也有微弱的棕色阳性产物。初级精母细胞呈圆形或卵圆形;睾丸支持细胞呈锥形,突向管腔,胞核着色较胞质深。3er在睾丸中的表达张吉强等在对ER-β在成年雄性大鼠下丘脑中分布的研究中发现,除视前内侧区和视前室周核的表达较强外,其余各核团如腹内侧核、背内侧核等的表达较微弱。本试验发现,ER免疫反应阳性神经元广泛分布于幼年山羊下丘脑中的14个核团中,以视上核、室旁核、室周核、视交叉上核、弓状核、乳头内侧核、乳头外侧核等与生殖有关的核团数量最多,腹内侧核、背内侧核、乳头中间核等较少。幼龄公山羊下丘脑中ER免疫反应阳性产物的广泛分布,表明下丘脑是雌激素的重要靶器官之一,ER参与或调节下丘脑的神经内分泌活动,雌激素可通过ER改变下丘脑中部分核团的转录,参与神经元的生长发育和分化、激素的分泌、神经递质的合成和释放、性行为等。研究发现,雄性小鼠下丘脑视前区,ER-βmRNA的水平持续升高至出生,并在生后仍保持高水平。而本试验中ER在幼龄公山羊下丘脑视前区的表达水平较低,推测与试验所用的第一抗体的亚型及动物种类有关;同时,ER阳性反应产物既存在于胞核,也存在胞质,与Blastein等的结果一致,说明ER广泛存在于整个细胞内。本试验在腺垂体发现ER呈强阳性且大量存在,说明垂体的ER与雌激素反馈抑制促性腺激素的分泌,并通过介导雌激素作用而影响垂体前叶的发育。神经垂体和视上核及室旁核中ER的表达,提示ER部分介导了雌激素对视上核、室旁核内催产素和加压素神经元等的分泌活动。雄性生殖器官的发育与功能除主要受雄激素调控外,雌激素对于雄性生殖器官的发育与功能必不可少。早先的研究并未在睾丸发现ER阳性细胞。Wang等发现,小鼠睾丸几乎所有的间质细胞和20%的肌样细胞呈ER阳性反应。张吉强等采用免疫荧光法发现,ER-β在间质细胞的胞核及胞质中均有表达,且随发育过程其阳性细胞的数量逐渐增加。Jefferson等证明,ER-β在大鼠睾丸中的表达从E16到P5逐渐增强,阳性部位主要位于发育